Sunteți pe pagina 1din 72

Nu poţi înşela legile naturii fără să fii pedepsit!

Balzac(1799-18509)

METODE DE ANALIZĂ BAZATE PE INTERACŢIUNEA


RADIAŢIILOR ELECTROMAGNETICE CU MATERIA

Curs 6-7

A se studia în plus pentru acest capitol:


- Capitolele corespunzătoare din cartea Analiza medicamentului. Ghid
practic, autori Imre S., Muntean D.L.
- Materialul suplimentar corespunzător bibliografiei indicate
Pentru animaţii, aveţi nevoie de o conectare la internet, apoi urmaţi link-ul
respectiv. 1
Introducere în spectrometrie
a. Natura şi caracteristicile radiaţiei electromagnetice

2
Din punct de vedere energetic, COMPONENTA CÂMP
ELECTRIC are contribuţia cea mai importantă!!! şi practic
această componentă este importantă în studiul
interacţiunilor radiaţiilor electromagnetice cu materia.

E = h  = h c /  = h c
unde E – energia radiaţiilor (J - Joule), h – constanta lui Planck (6.626068 × 10-34
m2 kg / s),  - frecvenţa radiaţiei (Hz - Hertz), c – viteza luminii (m/s),  - lungimea
de undă (m şi submultipli ex. nm=10-9m), - număr de undă (1/m sau 1/cm) 3
b. Tipuri de radiaţii electromagnetice

Sensul de creştere a energiei radiaţiilor electromagnetice E, a frecvenţei  şi a


numărului de undă 

Sensul de creştere a lungimii de undă  4


c. Efectul
EFECTUL RADIAŢIILOR produs de radiaţiile
ELECTROMAGNETICE LA
electromagnetice la nivel molecular
NIVEL MOLECULAR

5
Spectrometria UV-VIS

1.PRINCIPII 2.ANALIZA CALITATIVĂ


CUPRINS 3.ANALIZA
4.INSTRUMENTE CANTITATIVĂ

6
CLASIFICAREA METODELOR UV-VIS

METODE ÎN UV VIS BAZATE PE


INTERACŢIUNI CU PARTICULE

EMISIE ATOMICĂ

ABSORBŢIE

ATOMICĂ MOLECULARĂ

LUMINISCENŢĂ

FLUORESCENŢĂ FOSFORESCENŢĂ CHEMILUMINISCENŢĂ


ATOMICĂ MOLECULARĂ
METODE SPECTRALE UV VIS BAZATE PE
INTERACŢIUNI CU PARTICULE

SPECTROMETRIE
Au loc interacţiuni între
radiaţia UV VIS cu atomii şi
ATOMICĂ ionii din probă la nivel de
electroni de valenţă

Au loc interacţiuni între


radiaţia UV VIS cu
MOLECULARĂ moleculele din probă la nivel
de electroni de legătură

Când radiaţia UV VIS interacţionează cu atomii, ionii sau


moleculele sunt afectate nivelele energetice ale
electronilor de valenţă, respectiv legătură
PRINCIPII

Radiaţie Radiaţie
reflectată refractată

Radiaţie
Radiaţie transmisă
Probă
incidentă

Radiaţie
împrăştiată Radiaţie
emisă
• Fenomene care pot descrie interacţiunea unei
9
radiaţii electromagnetice cu materia:
reflexia, absorbţia, împrăştierea, refracţia radiaţiei
şi emisia de radiaţii
PRINCIPII

• Interacţia unui foton al sursei luminoase(hν) cu o moleculă ABSORBŢIE


=tranziţia electronilor din starea fundamentală în starea excitată superioară

Absorbţie Emisie

Energia în exces este rapid disipată- EMISIE


RELAXAREA- Poate lua multiple forme:procese radiative, termice sau conversie internă

10
PRINCIPII

• Spectrometria de absorbţie moleculară în domeniul UV(185-


380 nm) şi VIZIBIL(380-800nm) este o tehnică curentă de
control şi analiză
• Aplicaţii : grupelor de atomi(molecule, ioni,polimeri) care
absorb radiaţii electromagnetice din domeniul UV-VIS

11
PRINCIPII

• Radiaţiile UV-VIS:
• Acţionează asupra electronilor de legătură
• Electronii implicaţi în legături chimice trec în stare superioară de energie
(stare excitată)

SPECTROMETRIA UV-VIS = SPECTROMETRIA ELECTRONICĂ


Spectrometria UV-VIS  tehnică de măsurare a spectrelor de
absorbţie a radiaţiilor UV-VIS de către materie
12
ENERGIA MOLECULEI. TRANZIŢII ENERGETICE

Energia totală a moleculei este suma energiei electronice,


vibraţionale şi rotaţionale

Et  Ee  Ev  Er
Et  h e  h v (v  1)  hcBJ ( J  1)
e – frecvenţa radiaţiei optice care provoacă tranziţia energetică
electronică
v – frecvenţa radiaţiei optice care provoacă tranziţia energetică
vibraţională
v – numărul cunatic vibraţional (v = 0, 1, 2, 3,......n)
J – numărul cunatic rotaţional (J = 0, 1, 2, 3,.......n)
B – constanta
ORIGINEA SPECTRELOR DE ABSORBŢIE
MOLECULARĂ IN UV VIS
Moleculele au trei nivele energetice cuantificate

NIVELE ENERGETICE
CUANTIFICATE PENTRU MOLECULE

ELECTRONICE Ee

Creşte energia
VIBRAŢIONALE Ev

ROTAŢIONALE Er

Pentru fiecare nivel electronic molecula are mai multe nivele


energetice vibraţionale şi pentru fiecare nivel vibraţional mai multe
nivele rotaţionale.
ABSORBŢIA RADIAŢIILOR DIN DOMENIUL UV-VIS ŞI FACTORII DE
CARE DEPINDE ACEASTA

• Energia necesară schimbării distribuţiei electronilor implicaţi în legături chimice este


de ordinul a câţiva electronvolţi şi, în consecinţă, fotonii absorbiţi sau emişi în timpul
unui astfel de fenomen sunt din regiunea ultraviolet şi vizibil situată între 190 şi 700
nm (~1-7 eV). Culoarea percepută de ochiul uman este rezultatul unor tranziţii
electronice produse în urma absorbţiei radiaţiei din domeniul VIS. Există situaţii în
care schimbarea distribuţiei electronilor poate fi suficient de puternică încât să
determine ruperea legăturii chimice, deci disocierea moleculei, producându-se o
reacţie fotochimică.

15
O bandă de absorbţie
corespunzătoare unei tranziţii
electronice este formată dintr-un
număr de benzi suprapuse, unite sub
forma uneia singure în cazul probelor
aflate în stare condensată (lichidă,
solidă). Explicaţia acestei structuri
este în legătură cu producerea mai
multor tipuri de fenomene în cursul
unei tranziţii electronice. Nucleele
atomilor dintr-o moleculă se află
într-o permanentă mişcare
oscilatorie, unul faţă de celălalt,
această deplasare purtând numele
de vibraţie. Distanţa internucleară a
atomilor implicaţi în legături chimice
este guvernată de forţele
coulombiene care acţionează asupra 16
lor.
• Orice tranziţie electronică este
însoţită şi de o schimbare a
vibraţiei moleculei, din această
cauză ea se mai numeşte şi
tranziţie vibronică. În urma unei
tranziţii electronice, are loc o
redistribuire a electronilor în
moleculă, având drept
consecinţă schimbarea forţelor
coulombiene care acţionează
asupra nucleelor.

17
• Nucleele răspund acestei
schimbări prin vibraţie, o
parte din energia absorbită
pentru redistribuirea unui
electron fiind de fapt utilizată
pentru stimularea vibraţiilor
moleculelor probei. Prin
urmare, în spectru, în locul
unei singure benzi electronice
înguste, se observă o bandă
largă cu un maxim, rezultată
prin suprapunerea mai multor
benzi de absorbţie
vibraţionale 18
• Explicarea formei unei benzi de
absorbţie are la bază principiul Franck-
Condon: deplasarea electronilor într-o
moleculă are loc mai rapid decât
variaţiile distanţelor internucleare
(vibraţii), electronii având o masă mult
mai mică decât nucleele. Tranziţiile
electronice cele mai intense au loc
practic fără schimbarea distanţei
internucleare. Cea mai intensă
(favorizată) tranziţie electronică este
cea care are loc între acele vibraţii din
stările fundamentală şi excitată
corespunzătoare momentului în care
nucleele în stare excitată se află în
poziţii staţionare (poziţia de întoarcere a
oscilaţiei), distanţa internucleară fiind
aceeaşi în momentul absorbţiei, atât în
starea iniţială, cât şi în cea excitată 19
Este important de menţionat faptul că o tranziţie electronică nu se produce dacă
în timpul acesteia nu are loc o modificare a momentului de dipol, deoarece este
impusă condiţia existenţei unui „cuplaj” între câmpul electric al radiaţiei
electromagnetice şi dipolmomentul moleculei.
În urma absorbţiei de radiaţie electromagnetică UV-VIS, electronii de valenţă trec
dintr-un orbital de legătură într-unul de antilegătură, de energie mai mare.

20
PRINCIPII

Fiecare electron într-o moleculă are o singură stare fundamentală şi nivele


excitate specifice
Tranziţiile( salturile de energie) posibile pentru electronii unei molecule date
sunt: previzibile şi în număr finit

Grad de
absorbţie

E*
Natura radiaţiei (
sau )
Absorbţie
Spectru de absorbţie
h În figură este un spectru cu 2 maxime de
E0
absorbţie, deci sunt absorbite cu intensitate
Radiaţie Probă Radiaţie mare 2 tipuri de radiaţii
transmisă
incidentă
21
Sunt absorbite acele radiaţii a căror energie este egală cu diferenţa de energie dintre două
stări energetice ale moleculei:
PRINCIPII

• Un spectru reprezintă intensitatea absorbţiei la diferite lungimi de undă


A=f(λ)
• Un spectru UV-VIS este un spectru de benzi(/molecule) caracterizat printr-
un maxim de absorbţie (λmax) şi un minim de absorbţie (λ min)

22
Maxime de
PRINCIPII absorbţie

23

Exemplu de spectru de absorbţie


ANALIZA CALITATIVĂ

Semnal
măsurat

Informaţii
cantitative
Lungime de
undă /
frecvenţă /
Informaţii număr de undă
calitative

Utilitatea analitică a spectrelor de absorbţie 24


ANALIZA CALITATIVĂ

Absorbţia unei radiaţii din domeniul UV-VIS are loc dacă energia acesteia este
suficientă pentru a produce tranziţii electronice în molecula de interes :

s antilegătură
Energie
p antilegătură

n nelegătură

p legătură

s legătură
ANALIZA CALITATIVĂ

Electronii implicaţi în absorbţia radiaţiilor UV-VIS sunt:


• electronii s - sunt electronii implicaţi în legăturile simple, cum
ar fi legăturile C-C sau C-H din alcani, şi necesită energii mari
pentru a trece într-o stare superioară de energie (ultraviolet
de vid 100 – 200 nm)
• electronii n – sunt electronii neimplicaţi în legături chimice,
cum ar fi perechile de electroni neparticipanţi ai O, N şi S
(tranziţii n  p*). De exemplu absorbţia de intensitate joasă a
grupării carbonil de la aproximativ 280 nm se datorează unei
tranziţii n  p*. Conjugarea cu electroni p (auxocromi)
determină intensificarea absorbţiei .
• electronii p - sunt electronii mobili ai legăturilor multiple. Sunt
implicaţi în tranziţii p  p* care au loc în regiunea 180 – 200
nm. 26
ANALIZA CALITATIVĂ

Cromofori:
• Grupe de atomi la nivelul cărora se produce absorbţia
radiaţiilor UV-VIS

Compus Cromofor max [nm]

Etenă C=C 185


Butadienă C=C-C=C 217
Crotonaldehida C=C-C=O 217
Sulfanilamida în
HN-O2S-C6H4-NH2 251
soluţie alcalină
27
Sulfanilamida în 218
H2NO2S-C6H4-N+H3
soluţie de HCl 265
ANALIZA CALITATIVĂ

Deplasarea lungimii de undă a maximului de absorbţie, max, şi


modificarea intensităţii benzii de absorbţie a unui cromofor, exprimată
prin coeficientul molar de absorbţie max , sunt determinate de
ambianţele atomice din molecula din care face parte , interacţiunea cu
solventul, deplasarea echilibrelor de ionizare în soluţie, etc.
Variaţiile mici de temperatură nu modifică spectrele electronice în
soluţie. Pentru a descrie aceste influenţe şi modificări spectrale se
lucrează cu câteva noţiuni specifice:
• grupare auxocromă – grupare saturată de atomi, -OH, -NH2, -S-, -Cl, -
N+H3, care ataşată unui cromofor modifică lungimea de undă max la
care are loc absorbţia şi intensitatea maximului de absorbţie
• deplasare batocromă „spre roşu” – deplasarea maximului de
absorbţie la lungimi de undă mai mari (energii de excitaţie mai mici)
• deplasare hipsocromă „spre albastru” - deplasarea maximului de
absorbţie la lungimi de undă mai mici (energii de excitaţie mai mari)
• efect hipocrom – scăderea intensităţii absorbţiei
• efect hipercrom – creşterea intensităţii absorbţiei
28
Tipuri de deplasări ale unei benzi de absorbţie
(Abs – grad de absorbţie,  stare iniţială,  stare
finală)

Abs. Abs.
Efect Efect
batocrom hipsocrom

Lungime de undă Lungime de undă

Abs. Abs
Efect Efect
hipercrom hipocrom

Lungime de undă Lungime de undă


29
ANALIZA CALITATIVĂ

30
ANALIZA CALITATIVĂ

Informaţii calitative:
• Stabilirea prezenţei unui cromofor
• Un spectru UV-VIS nu permite determinarea structurii complete a substanţei
de analizat!!!
Factori care influenţează poziţia şi intensitatea maximelor de
absorbţie
Ambianţa atomică Interacţiunea cu Factori fizico-
(efecte electronice) solventul chimici.

 max 
31
Semnal
măsurat 31
la max
ANALIZA CALITATIVĂ

• Ambianţa atomică
(efecte electronice)

Ex. Delocalizarea electronilor π conform cu teoria mezomeriei facilitează mişcarea acestora


de-a lungul moleculei ceea ce în spectru se va traduce prin apropierea nivelelor de energie-
efect batocrom hipercrom
Cuantificarea influenţei grupărilor adiacente – predicţia zonelor de absorbţie maximă

n λ (nm) ε,10-4 (L.mol-1.cm-1)


1 174 1,6
2 227 2,4
4 310 7,7
32
6 380 14,7

Efect batocrom şi hipercrom


ANALIZA CALITATIVĂ

• Ambianţa atomică
(efecte electronice)

Compus λ (nm) ε (L.mol-1.cm-1)


Fenol 270 1450
λ (nm) ε (L.mol-1.cm-1) Anilină 280 1430
33
B 254 204 p-nitrofenol 375 16000

Substituţia unui hidrogen= efect batocrom şi hipercrom


ANALIZA CALITATIVĂ

• Interacţiunea cu
solventul

Natura solventului(polaritatea)- tranziţia electronică corespunde unei modificări a


polarităţii moleculei
Modificarea poziţiei relative a orbitalilor prin stabilizarea sau destabilizarea produsă de
solvent- solvatocromie
Solvenţii pot influenţa: poziţia benzilor de absorbţie, intensitatea acestora precum
şi forma prin: polaritate respectiv pH.
 Influenţa polarităţii:
Solvent polar- interacţiunea solut/solvent lărgirea benzilor
Solvent nepolar îngustarea benzilor
 Influenţa pH-ului- ionizarea cromoforului variaţii în benzile de absorbţie
Un bun solvent nu trebuie să absoarbă/ interfereze cu analitul/analiţii la lungimea de
undă de studiu
34
ANALIZA CALITATIVĂ

• Interacţiunea cu solventul

Ce trebuie reţínut atunci când alegem solventul pentru determinarea unei probe?

1. Transparenţa: în domeniul de absorbţie al solutului, solventul nu trebuie să


absoarbă sau absorbţia lui să fie nesemnificativă

2. Posibilele interacţiuni solvent-solut: un solvent polar(ex. apa, alcoolul) poate


modifica puternic spectrul de absorbţie prin efectele batocromice şi hipsocromice.
Dizolvarea solutului în hexan de ex.(solvent apolar) conduce la obţinerea unui
spectru cu structură mult mai fină decât cel obţinut cu un solvent polar.
Pe de altă parte, variaţia pH-ului soluţiilor apoase sau hidroalcoolice poate
determina apariţia de specii ionice sau moleculare distincte, cu spectre de absorbţie
diferite.
Este cazul indicatorilor de culoare în care forma acidă HIn şi bazică In- au culori
diferite. Proporţia fiecărei forme în funcţie de pH se poate determina prin măsurarea
35
absorbanţei la maximul de absorbţie al fiecărei forme, putându-se ajunge în acest
mod la determinarea valorii pK a indicatorilor.
ANALIZA CALITATIVĂ

• Factori fizico-chimici.

Influenţa mediului:
Modificarea semnalului de măsurat- efect de matrice
Prezenţa substanţelor absorbante parazite- măsurarea simultană a absorbanţei,
erori de măsurare

36
ANALIZA CANTITATIVĂ

Legea Lambert-Beer

 I0 
A  log    a lc
 IT 
Cuvă cu soluţia
probă unde:
A - absorbanţă
a - absorbtivitate sau coeficient de
absorbţie  o constantă pentru o
I0 IT substanţă dizolvată într-un solvent dat
l - lungimea cuvei în care se află soluţia
c c - concentraţia substanţei în soluţie
I0 – intensitatea radiaţiei incidente
37
l IT – intensitatea radiaţiei transmise
37
ANALIZA CANTITATIVĂ

• a   coeficient de absorbţie molar sau absorbtivitate molară,


atunci când concentraţia c se exprimă molar

• a  A1cm1% absorbanţa specifică atunci când concentraţia c se


exprimă în g la 100 ml soluţie, simbolizată %(m/V)

• a – caracterizează natura substanţei de determinat şi


ambianţa (matricea) în care aceasta se află în probă (natura
solventului, pH etc.)

38

38
ANALIZA CANTITATIVĂ

I0
A  log A - Absorbanţa
IT
 IT   IT 
T    ; T %    100
 Io   Io 
T – Transmitanţa
T% - Transmitanţa procentuală 39
ANALIZA CANTITATIVĂ

Legea Lambert-Beer este lineară în următoarele condiţii:


 Soluţia de analizat are concentraţii mici(sub 0,01M) şi constante pe parcursul
determinării
 ε este constant- lumină monocromatică
 l este constant – fasciculul radiaţiei incidente este perpendicular pe cuva cu probă
 Soluţia este transparentă
 Soluţia de analizat nu este fluorescentă
 Soluţia de analizat este stabilă din punct de vedere fotochimic
 Nu există reacţii în soluţia de analizat

40
ANALIZA CANTITATIVĂ

• Informaţii cantitative:
• Pornind de la legea Lambert-Beer
• Metode:
• Pe baza coeficientului de absorbţie
• Metoda standardului extern
• Metoda curbei de calibrare etc.

41
ANALIZA CANTITATIVĂ

Principiul determinării cantitative pe baza absorbtivităţii

Absorbanţa, A
cx la lungimea de
undă , cuva de
l cm A
Soluţia c x ,% (m/V)  f
probă 
Coeficientul de ! F =Factor numeric –
absorbţie,  se ţine cont de diluţiile
Tabele de sau A1cm1%, la efectuate, modul de
specialitate lungimea de exprimare a
undă  şi în concentraţiei, corecţia 42
datorată lungimii
cuva de l cm
cuvei – dacă este
cazul etc.
ANALIZA CANTITATIVĂ

Principiul determinării cantitative pe baza


standardului extern

Absorbanţa
Ap la
lungimea de
undă , în Apc s
Cuva cu
probă
cuva de l cm cx  f
As
Absorbanţa
AS la
lungimea de Unde cx şi cs sunt
undă , în concentraţia probei şi,
Cuva cu respectiv, a soluţiei
soluţia cuva de l cm
standard 43
standard
ANALIZA CANTITATIVĂ

Principiul determinării cantitative prin metoda standardelor externe


(metoda curbei de calibrare)

Ax
cx Absorbanţă

Absorbanţă
probă
Probă Ax
Concentraţie
probă
A1 A2 A3 … Ai
c1 c2 c3 ci cx
Concentratie
Serie de 44
soluţii
standard
ANALIZA CANTITATIVĂ

• Metoda se aplică atunci când se verifică legea Beer – Lambert


şi există substanţă de referinţă cu puritate adecvată. Este des
aplicată în monografiile din farmacopei.
• Dacă pentru un sistem dat, reprezentarea grafică a legii Beer –
Lambert conduce la o dreaptă care nu trece prin zero (valoarea
intercepţiei dreptei cu ordonata este semnificativă), se
utilizează două soluţii standard, o soluţie cu concentraţia mai
mare csM şi cea de a doua cu o concentraţie mai mică csm decât
concentraţia aşteptată în probă.

45
ANALIZA CANTITATIVĂ

Principiul determinării cantitative prin metoda standardului intern

Se măsoară absorbanţa Ax a soluţiei cu


concentraţia necunoscută Cx şi cu volumul
Vx.
Se adaugă acesteia un volum( mult mai mic
decât Vx) – ΔV dintr-o soluţie standard cu
concentraţia cunoscută Cs.
Absorbanţa măsurată se notează cu Axs iar
concentraţia Cx se va determina cu ajutorul
formulei de mai jos.
Metoda are avantajul că ţine cont de efectul
de matrice.

46
ANALIZA CANTITATIVĂ

Dozarea substanţelor în probe cu mai multe componente

• Există câteva metode ce pot fi aplicate la determinări cantitative


din amestecuri, principiul determinării bazându-se pe două
postulate:
• - absorbanţa unei soluţii este suma absorbanţelor
componentelor individuale;
• - absorbanţa măsurată este diferenţa dintre absorbanţa
totală a soluţiei şi absorbanţa soluţiei de referinţă.

47
ANALIZA CANTITATIVĂ

1.În cazul în care nu există


interacţiuni chimice,
absorbanţa soluţiei este
suma absorbanţelor fiecărei
componente la acea lungime
de undă.
Ex. Un amestec de două
substanţe, J şi R:
Metoda grafică
Metoda sistemului de
ecuaţii:

48
ANALIZA CANTITATIVĂ

2 A.Dacă interferenţa celorlalte componente este mare sau


contribuţia lor la absorbanţa totală nu poate fi estimată, atunci
este nevoie de separarea interferenţilor absorbanţi printr-un
procedeu de extracţie cu solvenţi. Acesta este indicat pentru
substanţele medicamentoase cu caracter slab acid sau bazic al
căror grad de ionizare şi, deci, coeficientul lor de repartiţie depind
de pH-ul celor două medii: mediul apos şi mediul organic
nemiscibil cu apa.
• Prin alegerea corectă a pH-ului se poate face separarea
completă a interferenţilor de analit, a cărui concentraţie poate fi
apoi estimată printr-o simplă măsurătoare de absorbanţă.
49
ANALIZA
ANALIZA CANTITATIVĂ
CANTITATIVĂ

2B.Dacă compusul interferent e


cunoscut, cu un spectru definit(albastru),
eroarea introdusă de acest compus la
lungimea de undă analitică(λ1) poate fi
eliminată selecţionând o lungime de undă
de referinţă(λ2) la care interferentul are
aceeaşi absorbanţă(A2) ca şi la lungimea
de undă analitică (λ1).
A2 se va scădea din A1( absorbanţa
măsurată-analit+interferent).
A(absorbanţa analitului) va fi:
A= A1-A2

50
ANALIZA CANTITATIVĂ

Tipuri de probe şi principii practice de lucru

• Tipuri de probe:
• Lichide -Soluţii lichide
• Gazoase – mai rar
• Concentraţiile soluţiilor analizate – astfel alese încât valoarea
absorbanţei A să fie cuprinsă între 0,2 şi 0,9 (legea Lambert-Beer se
respectă doar dacă absorbanţa se încadrează între aceste valori); la
spectrometrele vechi A trebuie să fie între 0,3 şi 0,7
• Solvenţii probelor lichide se aleg a.î. aceştia să nu absoarbă
semnificativ la lungimea de undă maximă la care se fac măsurătorile.
• Măsurarea probelor se face faţă de un martor – o soluţie preparată în
acelaşi solvent ca proba şi care conţine aproape toţi compuşii probei,
cu excepţia substanţei de analizat. Prin folosirea martorului, se scade
din absorbţia probei, absorbţia datorată celorlalţi compuşi prezenţi în
probă. 51
ANALIZA CANTITATIVĂ

Tipuri de probe şi principii practice de lucru (continuare I)

• Cuvele în care se introduc probele:


• Sunt confecţionate din materiale care nu absorb în UV-VIS. Ex.:
• Sticla – domeniul VIS
• Cuarţ sau materiale plastice – domeniul UV-VIS
• Mărimea (lăţimea) cuvelor – de regulă, 1 cm, dar se pot folosi
cuve mai mici, dacă proba este într-un volum mic sau este prea
concentrată, sau mai mari, dacă probele sunt prea diluate. !!! Nu
toate spectrometrele sunt dotate cu suporturi pentru cuve cu
dimensiuni variate. !!! Nu întotdeauna există volum suficient de
probă şi atunci se folosesc cuve de lăţimi mici (5 mm, 2 mm, 1
mm)
52
ANALIZA CANTITATIVĂ

Tipuri de probe şi principii practice de lucru (continuare II)

• Etape în analiza cantitativă spectrometrică UV-VIS:


• Se înregistrează spectrul de absorbţie pe domeniul UV-VIS
• Dacă în spectru sunt mai multe benzi de absorbţie, se alege ca lungime
de undă de lucru max cea mai mare, cu condiţia ca banda
corespunzătoare să fie intensă
• Se evită să se lucreze la  situate în jurul valorii de 200 nm deoarece în
această zonă absorb aproape toate substanţele (determinările în această
zonă sunt total nespecifice); dacă substanţa are un singur maxim de
absorbţie situat în acest domeniu, martorul trebuie pregătit extrem de
riguros şi pentru aceasta trebuie să se cunoască cu precizie natura
tuturor compuşilor posibili în probă
• Se procedează apoi conform metodelor cantitative descrise anterior. 53
SPECTROMETRIA DERIVATĂ
Dacă un spectru se consideră ca fiind reprezentarea grafică a absorbanţei (A) în funcţie
de lungimea de undă (λ), spectrele derivate ale acestuia sunt descrise de ecuaţiile:
 Derivata de ordin 0
A  f ( )
 Derivata de ordin 1
dA
 f ' ( )
d
 Derivata de ordin 2
d2 A
 f ' ' ( )
2
d
 Spectrele derivate sunt întotdeauna mai complexe decât spectrele iniţiale,
denumite deseori spectre de ordin 0.
Derivatele cele mai des folosite în practică sunt cele de ordin 2 şi 4. Cea mai
importantă caracteristică a derivatei de ordinul 2 este banda negativă cu minimul la
aceeaşi lungime de undă λmax ca şi maximul din spectrul de ordin 0. Această derivată
prezintă şi două benzi satelit de fiecare parte a benzii principale. 54
Derivata de ordin 4 are o bandă pozitivă cu maximul la aceeaşi lungime de undă cu a
maximului din spectrul iniţial.
55
Aşa cum legea Beer - Lambert se aplică la spectrele de ordin 0 şi în cazul derivatelor
există o relaţie de linearitate între concentraţie şi amplitudine:

dn A dn 
 lc
dn dn
la lungimea de undă λ, unde A este absorbanţa, ε coeficientul molar de extincţie, l
lungimea stratului absorbant şi c concentraţia molară a probei.
Dintre tehnicile care permit dozarea substanţelor în amestec fără folosirea unor
procedee de separare prealabilă a acestora, spectrofotometria derivată are avantajul
simplităţii, rapidităţii şi exactităţii rezultatelor.
Spectrometria derivată a condus la progrese în spectrometria UV - VIS în
comparaţie cu spectrometria convenţională (denumită spectrofotometrie de ordin 0).
Spectrele derivate sunt folosite pentru a sesiza mai bine diferenţele dintre anumite
spectre, pentru a rezolva cazul benzilor suprapuse în analiza calitativă şi, cel mai
important, pentru a reduce efectele interferenţelor datorate împrăştierii luminii, absorbţiei
matricei sau a altor compuşi în analiza cantitativă.

56
Cea mai utilizată derivată în determinări cantitative este derivata de
ordinul 2. Indiferent de tipul derivatei, măsurarea semnalului derivat se
poate face prin trei metode : metoda tangentei, t, metoda pic-pic, p, şi
metoda pic-zero, z.

57
ABATERI DE LA LEGEA LAMBERT-BEER

Pentru o serie de soluţii cu concentraţii diferite


ale unui analit dat, legea Beer-Lambert (B-L)
stipulează directa proporţionalitate A  c la o
anumită lungime de undă, atunci când lăţimea
cuvei şi solventul nu se modifică de la o
măsurătoare la alta
Nu totdeauna linearitatea descrisă de această
lege este aplicabilă. La concentraţii mici, sub
0,01 M, legea funcţionează foarte bine pentru
cele mai multe dintre substanţe. Deviaţii
aparente de la legea Beer - Lambert au loc la
concentraţii mari şi se datorează schimbărilor la
nivelul proprietăţilor soluţiei sau ale speciilor
absorbante.
Factorii care cauzează deviaţii de la linearitatea
absorbanţă – concentraţie se împart în funcţie
de natura lor în: A. Factori fizici şi chimici 58
B. Factori instrumentali
A. Factori fizici şi chimici

La concentraţii mari există o diferenţă între indicii de refracţie ai soluţiei şi


solventului folosit ca martor. O situaţie similară se întâmplă şi atunci când proba este
dizolvată într-un amestec de solvenţi organici şi apă şi din această cauză trebuie ca
martorul faţă de care se apreciază absorbanţa probei să conţină aceiaşi solvenţi, în
aceeaşi proporţie ca şi proba.
Solventul poate, de asemenea, să afecteze absorbtivitatea analitului. Uneori,
specii neabsorbante pot interacţiona cu specii care absorb în UV-VIS, alterându-se astfel
absorbtivitatea aparentă a soluţiei.
Absorbanţa este, de asemenea, afectată prin folosirea unor solvenţi cu
transmisie mică sau a unor soluţi fluorescenţi.
Cele mai întâlnite cazuri de deviaţii chimice sunt cele în care în soluţia probă
se stabilesc echilibre chimice. Cea mai bună cale de a minimaliza acest tip de deviaţii
constă în utilizarea soluţiilor tampon, ajustarea tăriei ionice, adăugarea unei cantităţi
mari de agent complexant, etc. Dacă substanţa este un acid slab şi cele două specii în
echilibru absorb la lungimi de undă diferite, atât timp cât soluţia este tamponată sau
este foarte acidă, raportul între forma acidă şi forma bazică rămâne constant, indiferent
59
de concentraţia totală. Utilizarea unei curbe de calibrare într-un domeniu de
concentraţii adecvat corectează cele mai multe din aceste deviaţii.
B. Factori instrumentali

Există întotdeauna o anumită eroare sau o nereproductibilitate în efectuarea


unei măsurători spectrofotometrice.
Incertitudinea unei valori de absorbanţă dată de aparat depinde de un număr
de factori instrumentali precum şi de domeniul de valori ale absorbanţei în care
se lucrează şi, de aici, de domeniul de concentraţii. Pentru a evita erorile de
citire instrumentală, pentru spectrofotometre cu detector de tip
fotomultiplicator sau fotodiode domeniul de lucru este între 0,1 şi 1,5 unităţi de
absorbanţă.
În concluzie:
Acurateţea şi precizia unei măsurători spectrofotometrice depind de
intensitatea radiaţiei incidente şi de condiţionarea probei (solvent, concentraţie
şi lungimea stratului străbătut de radiaţie), precum şi de parametrii
instrumentali (lungime de undă, deschiderea fantei şi viteza de înregistrare).

60
APLICAŢII ALE SPECTROMETRIEI UV-VIS

DETERMINAREA COEFICIENTULUI DE REPARTIŢIE

În principiu, determinarea coeficientului de repartiţie


presupune agitarea solventului organic nemiscibil cu apa
împreună cu faza apoasă şi, după stabilirea echilibrului,
determinarea cantităţii de substanţă medicamentoasă în cele
două faze prin spectrometrie UV-VIS. Dacă se folosesc drept fază
apoasă soluţii tampon cu diverse pH-uri, variaţia coeficientului
de repartiţie în funcţie de pH permite determinarea, pe altă cale,
a valorii pKa a unei substanţe medicamentoase.

61
ELIBERAREA SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE DIN FORME FARMACEUTICE
Spectrometria UV este folosită uzual la monitorizarea eliberării unui
principiu activ din formulări farmaceutice, dacă se demonstrează ca
excipienţii sau celelalte principii active nu afectează determinările în
condiţiile specifice realizate. În cazul formulărilor farmaceutice cu un singur
component, în general situaţia este mai simplă. Se monitorizează absorbanţa
la lungimea de undă a maximului de absorbţie a analitului max, la diferite
intervale de timp. Absorbanţa este convertită în concentraţie şi se reprezintă
grafic curba de dizolvare prin reprezentarea procentului de substanţă cedată
în timp.
Dacă nu se poate realiza condiţia de specificitate în raport cu
interferenţii prin spectrometrie simplă UV-VIS, atunci se apelează la metode
cromatografice de separare, de exemplu metoda cromatografiei de lichide
de înaltă performanţă cu detecţie UV. 62
DETERMINAREA SOLUBILITĂŢII

Solubilitatea unei substanţe într-un solvent, de exemplu în


apă, poate fi determinată prin agitarea substanţei adăugate în
exces în solventul ales până la stabilirea echilibrului de solubilitate
şi apoi determinarea concentraţiei substanţei rămase în soluţie.
Dacă substanţa prezintă grupări ionizabile, se prepară soluţii de
diferite concentraţii din sarea substanţei de analizat şi se acidifică,
dacă sarea provine de la un acid, sau se alcalinizează dacă soluţia
conţine sarea unei baze, până la trecerea sării în forma neionizată.
Atunci când se depăşeşte limita de solubilitate, are loc precipitarea
substanţei, gradul de turbiditate putând fi determinat prin
spectrometrie UV măsurând lumina împrăştiată la aproape oricare
lungime de undă.
63
UTILIZAREA SPECTROMETRIEI UV-VIS PENTRU
DETERMINAREA VALORILOR pKa

În cazul substanţelor cu caracter acido-bazic ale căror spectre UV-VIS


sunt influenţate semnificativ de pH, spectrometria UV-VIS reprezintă
tehnica instrumentală de alegere în vederea determinării valorilor pKa
ale acestora.
Constanta de aciditate a unui acid slab HA este dată de expresia:

sau

La trecerea dintr-o formă în alta prin schimb de protoni, se


produc modificări ale efectelor electronice în moleculă care se pot
reflecta în modificarea formei şi intensităţii spectrului de absorbţie .
64
În cazul unui acid slab la un pH mic, există aproape exclusiv
forma HA, iar la pH mare, spectrul este dat de forma ionizată A-. La
valori intermediare de pH, există un echilibru între cele două forme, iar
absorbanţa observată la o anumită lungime de undă este suma
absorbanţelor celor două specii care intervin în echilibru:

A  AHA  AA-

Combinând cu legea Lambert - Beer, ecuaţia devine

 
ε c l  εHA [HA]  ε A  [A  ] l

unde  este absorbtivitatea molară aparentă, c  HA  A  este concentraţia


-

totală, l lăţimea cuvei, iar HA şi A- sunt absorbtivităţile molare ale celor două forme
-
conjugate (HA şi A ).

65
Împărţind ecuaţia cu A- şi rearanjând termenii se obţine
:

[HA] ε A   ε


[A ] ε  εHA

66
În practică se prepară trei soluţii ale substanţei studiate cu aceeaşi
concentraţie, dar la trei nivele de pH: un pH la care să predomine
forma HA, un altul la care să existe practic numai forma ionizată A- şi
un pH intermediar între aceştia. Lungimea de undă se alege astfel
încât să existe cea mai mare diferenţă între absorbţiile celor două
specii. Este important de menţionat şi următoarele aspecte:
-trebuie să se cunoască aproximativ domeniul în care se află valoarea
pKa pentru a alege corect pH-ul intermediar la care se măsoară A şi
care trebuie să fie în domeniul  1 al valorii pKa
-pentru determinări de acurateţe, experimentul se măsoară la mai
multe valori de pH apropiate
-dacă prin creşterea pH-ului spectrul acidului sau bazei slabe studiate
suferă o deplasare hipso- şi hipocromă, termenul cu logaritm se
elimină; această situaţie este puţin comună substanţelor
medicamentoase
67
APARATURA

Principiul spectrometrului UV-VIS


monofascicul clasic 68
APARATURA

Schema unui spectrometru UV-VIS cu


69
fascicul dublu
APARATURA

Schema unui spectrometru UV-VIS 70


cu şir de diode
APARATURA

71
Spectrometru UV-VIS cu calculator încorporat
APARATURA

Cuve de diferite tipuri folosite în spectrometria UV-


VIS 72