PRÁCTICA NO.

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DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA
POR ELECTROFORESIS CAPILAR

BENITEZ SANTANDER LIZBETH GIOVVANA

 INTRODUCCIÓN

Electroforesis: Migración de iones en

solución bajo la influencia de un campo
eléctrico
 APLICACIONES
La electroforesis capilar es una técnica analítica utilizada en diferentes
áreas de la investigación, la cual permite la separación y cuantificación de
una amplia gama de analítos (iones, péptidos, proteínas, carbohidratos,
esteroides, ácidos nucleicos, vitaminas, fármacos, células, etcétera)
Puede separar:
Proteínas
Ácidos nucleicos
Biomoléculas (insulina, lipoproteínas, enzimas)

Permite determinar:
Peso molecular de proteínas
Punto isoeléctico
Distinguir moléculas por su carga neta
PRINCIPIOS DE SEPARACIÓN
• La separación se basa en las diferentes movilidades
electroforéticas adquiridas por los analítos dentro del capilar al
aplicar un campo eléctrico.
• El flujo electrosmótico (FEO) es el movimiento de los iones
• Se aplica a moléculas con carga o neutras, en una solución, donde
se encuentran dos electrodos: se aplica un voltaje elevado (KV),
los cationes migran para el cátodo y los aniones para el cátodo.
 SISTEMA DE DETECCIÓN

La detección de los analítos se realiza dentro del capilar,

es decir que el mismo capilar actúa como celda de
detección, removiendo una sección del polímero
permitiendo el paso de luz la luz ultravioleta visible a
distintas longitudes de onda, hacia el detector.
• Utiliza detectores de alta
sensibilidad, y el uso de
capilares de sílice fundida (SiO2)

• Estos capilares están recubiertos de un polímero (poliamidas)

que les confiere alta flexibilidad facilitando su manipulación.
El aparato para electroforesis capilar (EC) Está constituido por una fuente de
poder (FP) de alto voltaje (20 a 30 Kv) y de 0 a 200µA, y un capilar de sílica de
25 a 75 µm de diámetro interno y de 100 a 200 µm de diámetro externo.
VENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS:

• Tiene la capacidad para separar aniones y cationes en una sola

corrida
• Es adecuada para separar de 1 - 10 μL de mestra
• Esta técnica permite obtener resultados en un corto tiempo, una
alta eficiencia de separación y una alta sensibilidad con un
mínimo consumo de muestra.

Representación gráfica de las especias

separadas por electroforesis capiAlar.
TIEMPO V ABSORBANCIA
DESVENTAJAS

Los factores principales que pueden afectar la eficiencia de la

separación de los analítos son:

• el calor de Joule generado

• la absorción de la muestra a las paredes
• la concentración de los analítos en la muestra
• la fuerza iónica
• el pH de las soluciones amortiguadoras
• la temperatura
La cafeína es una sustancia amarga que se encuentra en el café, el
té, bebidas gaseosas, chocolate y ciertas medicinas. Tiene muchos
efectos en el metabolismo del cuerpo, incluyendo la estimulación
del sistema nervioso central. Ésta puede hacerlo sentirse más
alerta y aumentar su energía.
 OBJETIVO

Al finalizar la práctica, el alumno podrá explicar los conceptos en

los que se basa la electroforesis capilar y aplicará dichos
conocimientos en la separación y cuantificación de especies de
interés.
MATERIAL
Cantidad Material o equipo Especificaciones
2 Vasos de precipitados 100 mL
3 Jeringa desechable 5 o 10 mL
5 Matraces volumétricos 2 mL
2 Matraces volumétricos 10 mL
4 Matraces volumétricos 25 mL
1 Embudo de filtración
1 Pipeta Pasteur
1 Papel filtro
5 Filtro Millipore de jeringa 0.45 mm
1 Varilla de vidrio
1 Baño degasificador
6 Viales para electroforesis 2 mL
1 Espátula
1 Pesafiltro
1 Equipo de electroforesis capilar
1 Potenciómetro con electrodo de
pH
 REACTIVOS Y
SOLUCIONES

Volumen/Cantidad Reactivos/solución Especificaciones

Gotas HCl Concentrado

10 mL Búfer de boratos Na2B2O7 0.02 M+HBO2
0.1 M pH 8.65
10 mL NaOH 0.1 M
10 mL Agua destilada desionizada

Ácido acetilsalicílico Estándar

10 g Café Soluble
10 g Café descafeinado Soluble
10 sobres Té negro
1 Refresco de cola Lata o de 600 mL
1 Refresco de cola dietético Lata o de 600 mL
 PARTE
EXPERIMENTAL
Preparación de soluciones.
Para la realización de la práctica necesitará de las siguientes
soluciones:
a) Estándares de cafeína: 2.5 ppm, 5 ppm, 7.5 ppm, 10 ppm y
12.5 ppm (preparar en fase móvil). Colocar en baño ultrasónico
durante 5 min.

b) Té y café: Pesar y diluir a volumen conocido

cada uno. En matraces volumétricos de 25 ml
colocar por separado 2.5 ml de café y 5 ml de té.
Aforar cada matraz con la fase móvil y colocar en
el baño ultrasónico por 5 minutos.
 c) Bebidas de cola:
Las bebidas de cola requieren ser descarbonatadas previamente. Para
ello se agitan fuertemente durante 15 minutos y se calientan por otros 15
min.

Posteriormente . En
matraces
volumétricos de 25
ml colocar 10 ml de
una bebida de cola y
aforar con la fase
se colocan en un baño ultrasónico móvil.
durante 30 minutos
A las soluciones de cafeína estándares y a las bebidas, se les
adiciona un estándar interno de ácido acetil salicíliico a una
concentración de 10 ppm.

2. Determinación de cafeína.
a) Preacondicionar el capilar lavando al inicio de la sesión con NaOH
0.1 M por 10 min a 20 psi y enjuagar con agua desionizada por 5 min a
20 psi.

b) Equilibrar el capilar lavando con el buffer de corrida durante 20 min a

20 psi.
c) Analizar los estándares y las soluciones problema con el buffer,
aplicando 20 kV (polaridad normal) a una temperatura de 25 °C,
inyección hidrodinámica 3 psi x 5 s, detector a 254 nm.

d) Realizar la curva de calibración de los estándares y con ello calcular

la concentración de cafeína en las muestras problema.
 CONCLUSIONES

Se concluye que las muestras a analizar tienen el

contenido de cafeína de acuerdo a la literatura.

La aplicación de la electroforesis capilar en el laboratorio permite contar

con una herramienta técnica de gran versatilidad.

Es completamente automático, tiene una gran sensibilidad, acorta el tiempo

por cada análisis que realiza disponiendo el profesional a cargo emplearlo
para analizar con tranquilidad los resultados y validarlos y/o realizar otras
tareas dentro del laboratorio.
REFERENCIAS

• Principios básicos de electroforesis capilar:

técnica analítica de separación de analitos,
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-
2012/ir122g.pdf

• Electroforesis capilar Juan Miguel

Castagnino 1 Adaptación de la Conferencia
presentada en el Congreso CUBRA IV,
1997, San Miguel de Tucumán, Argentina.
Reimpresión del artículo publicado en Acta
Bioquímica Clínica Latinoamericana Vol.
XXXIII, No. 3, 297-329, 1999.,