Respuestas de enzimas fisiológicas y

antioxidantes a la exposición
aguda y crónica de acuta Laeonereis
(Polychaeta, Nereididae) al cobre.
Introducción

Características
ecotoxicológicas

Es una especie
bentónica que tiene poca
movilidad

Polychaetaacuta Laeonereis
(Nereididae) fue seleccionado
como organismo de ensayo
para evaluar los efectos tóxicos
de cobre.
Programas de vigilancia
biológica, refleja la
contaminación local
Tiene la hemoglobina como
pigmento respiratorio
Objetivo

• Evaluar los efectos de la exposición crónica y aguda de

cobre en el sistema de defensa antioxidante enzimática y
algunas variables fisiológicas del gusano de estuario L.
acuta (Poliquetos, Nereididae).
 Materiales y métodos
1. Los especímenes de L. acuta
fueron recogidos en una zona no
contaminada en la Laguna de los
Patos, al sur de Brasil.
2. Transportados al laboratorio
en recipiente con hielo para
reducir su metabolismo.

3. Una vez en el laboratorio, se

Se mantuvieron las condiciones transfirieron a cajas de plástico
mencionadas (salinidad, pH, (52x33x9cm) que contienen arena y
temperatura, y fotoperiodo) por 7 agua salina (10‰)a pH 8.
días y cada 2 días se
alimentaban y se renovaba el
6. Continuó el protocolo agua.
4. La temperatura y fotoperiodo
con el fin de caracterizar se mantuvieron a 20 °C y 12 L:
la actividad de las 12 D respectivamente.
enzimas antioxidantes.
5. Después de 4 días, los gusanos se
transfirieron a placas de vidrio (6cm
de diámetro) sin arena (un Parte del día en que un ser
gusano por plato). vivo está expuesto a la luz.
 Materiales y métodos
Concentración de Cobre
10 individuos en cada
grupo fueron sometidos
Crónico: 14 Días C1: 31.25 µg/l a las mismas
Colectados en condiciones, pero uno
invierno 2000 C2: 62.50 µg/l en ausencia de Cobre.
7. Los gusanos
fueron expuestos
al cobre como
CuSO4 7H2O
C1: 250 µg/l 19 individuos en cada
Agudo: 48 hrs.
grupo fueron sometidos
Colectados en
C2: 500 µg/l a las mismas
Primavera 2000
condiciones, pero uno
en ausencia de Cobre.
Los gusanos no fueron alimentados y
el agua se renovó diariamente
durante el periodo de prueba.
 Materiales y métodos

Tanto para las determinaciones de la

actividad enzimática como para el
peróxido lipídico:

3-4 muestras analizadas

Al final los gusanos fueron

sacrificados por inmersión
en Nitrógeno Líquido.
Materiales y métodos
1. Se homogenizaron en
solución Tampón a 4 °C
((Tris-base 20 mM, EDTA 1 1
mM DLditiotreitol; Sigma, St.
Louis, MO)

2. Se centrifugaron por
30 min. a 900 X g
4. Ensayos preliminares mostraron que la
actividad enzimática no se vio
afectada por la congelación y
3. El sobrenadante se
descongelación de los sobrenadantes
almacenó a 20 °C durante
antes de las mediciones.
no más de 1 semana.
 Materiales y métodos
Se determinó:
Catalasa (CAT) por el
método de Bleuter (1975)
Superóxido dismutasa (SOD)
por el método McCord y
Fridovich (1969)
Glutatión S-transferasa (GST)
Por el método de Habig y
Jakoby (1981).
Se expresan en
unidades CAT.
Se basa en la tasa de
descomposición de H2O2
Mide la disminución de
absorbancia por min. a 240 nm.
Se basa en la generación de
aniones superóxido O2− que Se expresan en
reducen el citocromo C. Se unidades SOD.
midió la disminución de
absorbancia a 550 nm.
Se basa en la conjugación de
glutatión con 1 mM de 1-
cloro-2,4 benceno dinitro. Se
Se expresan en
midió la disminución de unidades GST.
absorbancia a 340 nm.
 Resultados
Ensayo Crónico

Después de 2 semanas de la prueba, la mortalidad fue del 10% (1 de 10), 20% (2 de 10) y 20% (2
de 10) para los grupos Cc, C1, and C2 Respectivamente.

 Los gusanos mostraron ausencia de su

capa de moco después de 48 h (C2) y 96
h (C1).

 No se observaron cambios en el
comportamiento animal.

 La actividad de la enzima antioxidante

(CAT, SOD y GST) fue significativamente
(* p <0.05) afectados por la exposición
de cobre.
Resultados
• CAT y SOD fueron significativamente
mayores en los gusanos expuestos a
ambas concentraciones de cobre
ensayados que en los gusanos de
control, Fig. 1a

• GST fue significativamente mayor sólo

en gusanos expuestos a la
concentración de cobre superior en
comparación con los otros grupos
probados, Fig. 1c
Resultados
• Ninguna de las variables fisiológicas
analizadas (consumo de oxígeno, la
concentración de metahemoglobina, y
la peroxidación lipídica) se vio afectada
por la exposición de cobre in vivo
(p>0.05, Fig. 2)

Notación:
(a) El consumo de oxígeno
(b) Contenido de metahemoglobina
(c) Peroxidación de lípidos

Letras iguales indican ausencia de

diferencias significativas entre los medios
(p>0,05).

Los datos se expresan como la media.

 Resultados
Ensayo Agudo

La mortalidad después de 48 h de exposición a cobre fue de 0%, 0%, y 10.5%

(2 de 19) para los grupos Ac, A1 y A2 respectivamente.

 Al igual que en el ensayo crónico, se

observó ausencia de una capa de moco y
una mayor actividad de natación en
gusanos expuestos al cobre durante 24 h.

 48 h se observaron edemas visibles en cerdas musculares

la pared del cuerpo de los gusanos de Figura 3
cobre expuestas
Moco: Secreción pegajosa utilizada para la
locomoción, la lubricación y la protección contra
partículas extrañas (Barnes,1986).
Resultados

 La actividad de la enzima
antioxidante no fue significativamente
( p>0,05) afectados por cobre aguda,
Fig. 4a y b

 En la actividad GST se observó una

inducción de la actividad de la
enzima en A1 en comparación con los
grupos Ac y A2 (Fig.4c)
Resultados
 Por otro lado, el consumo de oxígeno fue
menor en los gusanos expuestos a la mayor
concentración de cobre que en los expuestos
a la menor concentración ensayada ,Fig. 5a

La peroxidación lipídica fue mayor (*p <0,05)

en los grupos A1 y A2 que en el grupo de
control, Fig. 5b

Notación:
(a) El consumo de oxígeno
(b) Peroxidación de lípidos
 Discusión
 Se observó ausencia de secreción de moco a
una concentración inferior de cobre (31.25 µg/l
en el ensayo crónico) que los que se habían
reportado en estudios anteriores.

 Se observaron notables diferencias bioquímicas,

 Ninguna de las variables de
fisiológicas y morfológicas entre los gusanos de
efecto (peroxidación de
forma aguda y crónicamente expuestos al cobre.
lípidos, contenido de
metahemoglobina, y consumo
de oxígeno) fue influenciado
 Teniendo en cuenta el aumento de la actividad por la exposición crónica al
de las enzimas antioxidantes observadas en el cobre.
ensayo crónico se podría concluir que este
sistema de defensa fue inducida como
consecuencia del metabolismo que produce el
cobre en especies reactivas del oxígeno.
 Discusión
En el ensayo agudo, se observaron menores tasas de
consumo de O2 en gusanos expuestos a 500 µg Cu/l, en
comparación con gusanos expuestos a 250 µg Cu/l.

Al analizar la actividad antioxidante enzima (CAT,

SOD y GST) en los gusanos de control a partir de los
ensayos de crónicos y agudos, algunas diferencias
surgieron, que pueden estar relacionadas ya sea
para un efecto estacional o al tiempo de exposición
empleado.

Gusanos de control recogidos en invierno mostraron

una actividad SOD inferior(Fig. 1b) y los valores de LPO
más altos empleado.

Fig. 1b