Fundamentos y aplicaciones de

los métodos cromatográficos.

Conceptos básicos.

• Cromatograma.
• Tiempo de retención.
• Tiempo muerto.
• Constante de distribución.
• Factor de retención o factor de capacidad.
• Resolución cromatografica.
• Eficiencia en cromatografía.
 Fundamento de los métodos cromatográficos.
• El método se fundamenta en poner en contacto dos fases o
componentes mutuamente inmiscibles, que no reaccionen
químicamente, una de las cuales es móvil y la otra estacionaria.

• La fase estacionaria, esta contenida en un colector, formando una

columna.

• La fase móvil consiste en una disolución que se desea analizar en una

disolvente apropiado que no se absorba a la fase estacionaria.

• A medida que la fase móvil pasa a través de la fase estacionaria, se va

produciendo una absorción selectiva.
Fundamento de los métodos cromatográficos.

• Aquellos componentes de la fase móvil

que muestren mayor afinidad de
absorción con la fase estacionaria
quedaran retenidos en las capas
superiores de la columna.

• Aquellos que muestren menor afinidad

se absorberán mas tarde, mas abajo en
la columna.

• El resultado es una columna graduada o

cromatograma en donde cada especie
quimica se ha absorbido en una capa
concreta. Estas capas reciben el nombre
de platos.
Aplicaciones de los métodos cromatograficos.
Las técnicas cromatográficas están
ampliamente extendidas y su enorme
aplicación se debe a su elevada sencillez,
bajo coste y gran eficacia de separación.
• Análisis cualitativo.
• Análisis cuantitativo.
Análisis basados en la altura del pico.
Análisis basados en las áreas de los picos.
¿Que es la cromatografía de líquidos?
• Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizadas, la cual
permite separar físicamente los distintos componentes de una
solución por la adsorción selectiva de los constituyentes de una
mezcla.
• Contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase
estacionaria, y una móvil (fase móvil).
Clasificación de la cromatografía liquida.
Liquido, solido o de adsorción (LSC).
Mecanismo predominante: Adsorción sobre la
superficie.

Liquido (LLC).
Mecanismo predominante: Reparto entre fases
liquidas una móvil y una estacionaria.

Intercambio ionico.

Afinidad.
Mecanismo predominante: Uso de la estructura de
ligantes inmovilizados para unir bioselectivamente la
proteína deseada.
Cromatografía liquida de adsorción.

• La cromatografía líquida de adsorción se caracteriza por utilizar una

fase estacionaria sólida (Adsorbente) de carácter polar y una fase
móvil líquida (Eluyente) apolar, y se utiliza tanto con fines analíticos
(identificación de sustancias) como con fines preparativos
(aislamiento), siendo su limitación más importante la dificultad de
separar sustancias de polaridad parecida.
Disolventes mas utilizados en la cromatografía
de adsorción:
Cromatografía Liquido-Liquido.
• Técnica de separación cromatográfica basada en la partición de
solutos entre dos diversas fases líquidas que no consigue mezclada
junta. Las dos fases son fase movible y fase estacionaria .
• Utiliza columnas especiales pues ambas las fases son líquidos y no se
utiliza ninguna matriz sólida para conservar la fase estacionaria.
Principios y procesos del LLC
Los trabajos de la cromatografía basados
en el principio de la división de los líquidos
en los cuales los líquidos inmiscibles están
juntos y se separan varias veces. El
aislamiento de cada soluto individual se
hace en base del “coeficiente de la
partición” de esa composición
determinada presente en la fase solvente
comparado con la fase los diluente.
 Cromatografía de intercambio iónico.

Se emplea como fase estacionaria una resina de

intercambio iónico, de elevada masa molecular y
esencialmente insoluble.
Los procesos de intercambio iónico se basan en
los equilibrios de intercambio iónico entre los
iones de una disolución y los iones del mismo
signo que se encuentran en la superficie de la
resina.
Rellenos empleados.
• Rellenos tradicionales equeñas partículas
esféricas y porosas compuestas por
polímeros entrecruzados (de estireno y
divinilbenceno) que poseen grupos
funcionales ácidos o básicos unidos
químicamente.

• Un inconveniente de las partículas

poliméricas porosas es la baja velocidad
de difusión de las partículas de analito.
Para ello se han desarrollado nuevos
tipos de relleno más efectivos.
 Fases móviles en cromatografía de
intercambio iónico.
• Deben poder disolver la muestra y tener una
fuerza disolvente que proporcione tiempos
de retención razonables (valores
de k adecuados).

• Deben interactuar con los solutos de tal

forma que favorezcan la selectividad(valores
de α adecuados).
Aplicaciones de la cromatografía ionica.
• La cromatografía de intercambio
iónico se emplea tanto en
la separación de especies
inorgánicas como en la separación
de compuestos orgánicos.
• La cromatografía iónica se ha
aplicado a una gran variedad de
sistemas orgánicos y bioquímicos,
incluyendo fármacos, conservantes
alimentarios, azúcares y vitaminas,
entre otros.
Separación de aminoácidos mediante una
columna de intercambio iónico.
 Cromatografía de afinidad.
Se basa en la unión reversible entre el
analito de interés y un ligando específico,
inmovilizado en un soporte sólido inerte.
Cuando la muestra pasa por la columna,
sólo son retenidas las moléculas que se
unen de manera selectiva al ligando por
afinidad y las que no se unen avanzan con
la fase móvil. Los analitos retenidos
pueden ser arrastrados cambiando las
condiciones de la fase móvil.
Características de la cromatografía por
afinidad.
Matrices o soportes:
Matrices de polisacáridos .
Matrices sintéticas.
• Ligandos por afinidad característicos.
• La fase móvil desempeña dos funciones.
 Dos procedimientos generales de elución:
Elución bioespecifica.
Elución no especifica.
Selección de un método de cromatografía
liquida.
• El conocimiento de la estructura molecular de los componentes de la
muestra puede ser muy útil en la selección de un método de
cromatografía líquida.
• La cromatografía de absorción opera mejor en la separación por
clases de compuestos o para la separación de compuestos isoméricos.
• La técnica de cromatografía líquido – líquido es mejor para la
separación de homólogos.