ENZIMAS

J. Jorge Huamán Saavedra

Doctor en Medicina, Magister en Bioquímica
Patólogo Clínico 2018

Bioquímica Médica. J.Huamán S 1

Contenido

 Enzimas. Naturaleza
 Propiedades
 Energía de activación
 Especificidad
 Clasificación
 Importancia de las enzimas
 Grupos prostéticos
 Cofactores: coenzima, metal
 Sitio activo.
 Factores
 Enzimas en clínica
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Cuestionario

 1. Qué son las enzimas?

 2.¿Cuáles son las propiedades de las enzimas?
 3. ¿Cuál es la importancia de las enzimas?
 4. ¿Qué es un cofactor?
 5.¿Qué es una coenzima?
 6. ¿Qué es el sitio activo?

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ENZIMAS

 Polímeros biológicos que catalizan

las reacciones químicas haciéndola
compatible con la vida
 Biocatalizadores biológicos de miles
de reacciones bioquímicas:
desintegración de los nutrientes
para liberar energía y las unidades
estructurales y luego utilizarlo para
síntesis de propias macromoléculas
, intercambio iónico, contracción
muscular, etc.

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ENZIMAS

 PROPIEDADES
 Naturaleza: la mayoría son proteínas,
excepción de las ribozimas (RNA)
 Catalizadores muy eficaces: aumentan la
velocidad de reacción de 106 a 1012 respecto
a la no catalizada y varias veces las
catalizadas por químicos.
 Ej Anhidrasa carbónica 7.7x106
 AMP nucleosidasa: 6.0x1012
 No se consumen ni se modifican en forma
permanente
 *Harvey R, B ioquímica 5ta ed. 2011
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Número de recambio

 El número de recambio o kcat es el número de moléculas

de sustrato convertidas en producto por molécula de
enzima por segundo
 Suele ser 102 a 104 s-1*
 Harvey R, B ioquímica 5ta ed. 2011

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ENZIMAS

 Condiciones de reacciones adecuadas a la vida:

temperatura corporal, presión atmosférica, pH neutro o
próximo (la mayoría).
 Disminuyen la energía de activación y no alteran la
constante de equilibrio
Los catalizadores químicos requieren altas temperaturas,
presión elevada y pH extremo

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ENZIMAS

 GRAN ESPECIFICIDAD:
 de su reacción : una determinada, ej.
deshidrogenasa
 de sus productos: no dan productos
colaterales
.Los c. químicos pueden actuar sobre varias
reacciones, diferentes reactantes y dan
productos colaterales
* Murray R y col. Harper.Bioquímica ilustrada, 30 ed,
2016

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Especificidad de sustrato

 uno como la glucosa en la Glucocinasa o glucosa

oxidasa,
 pocos como la glucosa, manosa, fructosa en la
hexocinasa .
 Estereoespecificidad: Como se unen a sustratos por lo
menos en tres puntos pueden distinguir
estereoisómeros : D de L azúcares , L de D aminoácidos
Convierten sustratos aquirales a productos quirales(con
C asimétrico)*

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ENZIMAS

 Capacidad de regulación: de su actividad (alosterismo,

modificación covalente), de su síntesis(inducción ,
represión) , de su degradación (aumento o disminución
de su proteolisis)

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Clasificación de las enzimas
(IUB)
Oxidoreductasas
Transferasas
Hidrolasas
Liasas
Isomerasas
Ligasas
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Clasificación

 Oxidoreductasas: catalizan oxidaciones y reducciones.

Ejemplo: Deshidrogenasa láctica
 Transferasas: transferencia de grupos funcionales. Ej:
aminotransferasas, fosfotransferasas
 Hidrolasas: ruptura hidrolítica de los enlaces C-C, C-O,
C-N, P-O y otros como de tipo anhidrido Ej:enzimas
digestivas

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Clasificación

 Liasas: ruptura de los enlaces C-C, C-O,

C-N y otros enlaces mediante eliminación,
dejando enlaces dobles o también adición
a dobles enlaces.Ej. Citrato liasa
 Isomerasas: isomerización,
interconversión de isómeros , cambios
geométricos o estructurales en la misma
molécula. Ej: Fosfohexosa isomerasa
 Ligasas: unión de dos moléculas acoplada
a la hidrólisis de ATP o similar. Ej. DNA
ligasa

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Nomenclatura

 Antes de la IUB: diversos nombres según

sustrato, tipo de reacción, etc. Pepsina,
tripsina. Alcohol deshidrogenasa.
 IUB:2 nombres: común y el
sistemático(sustrato seguido por el tipo de
reacción terminado en asa) y cuatro números:
clase, subclase, subsubclase, orden de
descubrimiento
 Hexocinasa es ATP:D-hexosa 6
fosfotransferasa E.C.2.7.1.1. 2: transferasas
7: fosfotransferasas, 1: alcohol es el aceptor
del fosforilo

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COFACTORES ,COENZIMAS,
GRUPO PROSTETICO
 Muchas enzimas para ser activas requieren además
de la parte proteica (apoenzima) la presencia de
un cofactor, y el conjunto se llama holoenzima *
 Cofactor: Componente no proteico necesario para
la actividad de alguna enzimas.
 El cofactor puede estar libre en el medio o unido
como grupo prostético
 El cofactor por su naturaleza química puede ser
inorgánico( generalmente un ión metálico) u
orgánico ó coenzima.
 Harper considera tres tipos: cofactor o ión
metálico libre, coenzima y grupo prostético- que
puede ser a su vez un metal o una coenzima
* Lehninger, Bioquímica,
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Cofactor

Sin cofactor Cofactor

Unido:
Libre Grupo
Prostético

Ión metálico Coenzima Ión metálico Coenzima

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Cofactores. Coenzima

 Molécula orgánica, ionizable.

 Muchas enzimas requieren
coenzimas:grupos 1,2,5 y 6 de IUB
 Puede estar libre (difusible) o unida
como grupo prostético

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Coenzimas y complejo B

Vitamina Coenzima
Nicotinamida NAD, NADP
Riboflavina FAD, FMN
Acido pantoténico Coenzima A
Tiamina Tiamina difosfato
Piridoxal (B6) Piridoxal fosfato
Acido fólico Varias formas
Vitamina B12 Hidroxicobalamina

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GRUPO PROSTETICO

 Grupo prostético:es una coenzima o un metal

fuertemente unido a la enzima sea por enlace covalente
o no covalente. Ejemplo de coenzimas como GP: fosfato
de piridoxal, FMN, FAD. Los metales son los grupos
prostéicos más frecuentes dando lugar a las
metaloenzimas

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Coenzimas que transfieren
grupos distintos al H
Fosfato de azúcar
CoA SH
Pirofosfato de tiamina
Fosfato de piridoxal
Coenzimas del folato
Biotina
Coenzima de Cobalamida
Acido lipoico
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Coenzimas

 2. Transferencia de Hidrógeno
 NAD+
 NADP+
 FMN
 FAD
 Acido lipoico
 Coenzima Q

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SITIO ACTIVO

 Lugar de unión del sustrato y de catálisis de la

reacción
 Forma de bolsa o hendidura sobre la superficie de
la enzima (la mayoría) o para algunas enzimas
multiméricas en la interfaz entre subunidades*
 Formado por aminoácidos de diversas regiones que
se juntan por inducción del sustrato :modelo de
ajuste inducido (Koshland )
 Estudios biofísicos confirman el modelo del ajuste
inducido
 Modelo antiguo: llave y cerradura (Fisher)
 Aminóacidos fijadores y catalíticos
*Rodwell V y col. Harper.Bioquímica ilustrada, 30 ed, 2016

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Bioquímica Médica. J.Huamán S 23
COMPLEJO ENZIMA SUSTRATO
 Unión transitoria de la E al S, generalmente no
covalente –en oportunidades covalente-reversible, cuya
desintegración constituye la etapa limitante de la
reacción cuando la concentración del sustrato es
saturante

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COMPLEJO ENZIMA SUSTRATO

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Fuerzas que participan en
el E-S
 enlaces de hidrógeno
 atracciones iónicas
 enlaces hidrofóbicos,
 fuerzas de Van der Waals

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Estado de transición

 Las enzima disminuyen la energía de activación de la

reacción. La necesaria para que esta se produzca
 El estado de transición representa al estado activado de
los reactivos unido(s) a la enzima es decir cuando se ha
alcanzado la energía de activación

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Energía de activación y
estado de transición

Bioquímica Médica. J.Huamán S 28

Factores que afectan la
actividad enzimática

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Concentración de sustrato
Concentración de sustrato

 Ecuación de Michaelis-Menten
 Reacciones con un solo sustrato
 Velocidad inicial. Reacción en un solo sentido.
Gráfico de Lineweaver-Burk
Efecto de la temperatura
sobre la actividad enzimática
Temperatura extremas

 Las bacterias termófilas resisten altas temperaturas

 Se aplica en el PCR
 El aumento de la temperatura con la fiebre afecta la
actividad de las enzimas
 La disminución de la temperatura disminuye la actividad
de las enzimas.
pH

 Log de la inversa de la concentración de iones

hidrógeno
 Escala de 1 a l 14
 Acidez 1 a 6.99
 Neutro : 7
 Alcalino 7.1 a 14
 Ph fisiológico : 7.35. a 7.45 Medio: 7.4
 Acidosis : <7.35
 Alcalosis: >7.45
Efecto del pH
(Baynes 4ta ed.2015)
 Efecto del pH
 Toda enzima tiene un pH óptimo, puesto que en las reacciones catalíticas
participan aminoácidos ionizables, como histidina, glutamato y cisteína
 Las enzimas citosólicas tienen un pH óptimo en el intervalo de pH 7-8.
 La pepsina, que es secretada por las células gástricas y que actúa en el jugo
gástrico, tiene un pH óptimo de 1,5-2,0;
 la tripsina y la quimotripsina tienen un pH óptimo alcalino, compatible con
su actividad digestiva en el jugo pancreático alcalino
 las enzimas lisosomales suelen tener un pH óptimo ácido.
 La sensibilidad al pH de las enzimas se debe al efecto del pH sobre la carga
iónica de las
 cadenas laterales de aminoácidos de las enzimas.
 Diversos solutos, como sustratos, productos, iones metálicos y moléculas
reguladoras,
 también afectan a la velocidad de las reacciones enzimáticas.
Efecto del pH
pH óptimo
Efecto de la concentración de
la enzima
 A mayor concentración de enzima mas actividad
enzimática, siempre y cuando se tenga sustrato a
concentración 10 Km.
 Se aplica al campo clínico
Efecto de la concentración de
inhibidores
 La presencia de inhibidores sea fisiológicos o externos
afectan la actividad de la enzima
 Aplicaciones de las
enzimas en medicina

Bioquímica Médica. J.Huamán S 42

Principios básicos de
enzimología clínica
 En el plasma existen dos tipos de
enzimas: funcionales y no funcionales
 Funcionales: están en altas
concentraciones y cumplen su función en
el plasma. Ejemplos: Coagulación
trombin, lipoprotein lipasa,etc
 No funcionales: baja concentración, se
originan en tejidos, no cumplen función.
Se elevan cuando existe daño en órganos
y tejidos
Bioquímica Médica. J.Huamán S 43
Enzimas en el diagnostico
clínico
 Estas enzimas no funcionales son las que se usan
habitualmente en el diagnóstico.
 Elevación en el plasma es por daño en órgano ó
tejido. Alteración de la permeabilidad de la
membrana celular o necrosis
 En principio a mas daño más liberación, más
actividad en el plasma
 Se libera primero del citosol y luego las
mitocondriales
 Problema: especificidad por su amplia distribución
. Para ello se emplean las isoenzimas. Hay perfiles
de aplicación. Enzimas específicas. Fosfatasa
acida prostática
 Cinética de aparición y desaparición. Ej CPK y LDH44
Bioquímica Médica. J.Huamán S
Metodología

 Medidas de la actividad enzimática.

1. Sustrato residual: amilasa sérica
2.Producto final: transaminasas
3. Cambios en coenzimas: producción de
NADH a 340nm, producción de FAD a 450
nm. Directos a o acoplados a otra enzima
. Las enzimas se miden a 5-10 veces Km de
sustratos y coenzimas en condiciones
óptima de pH y temperatura
Bioquímica Médica. J.Huamán S 45
Metodologia

 Punto final: una sola lectura al final de la prueba

 Cinético: o más lecturas en un espectrofotómetro
Colorimetría : intensidad de color medida por
absorbancia a una determinada longitud de onda. Ley
de Lamberth y Beer

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Isoenzimas

 Enzimas que catalizan la misma reacción química pero

difieren en estructura
 Se encuentran en diferentes tejidos
 Por lo general tienen varias subunidades iguales o
diferentes
 Se separan por electroforesis
 Pueden tener algunas diferencias en propiedades
catalíticas: Km

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LDH

 Se emplea en el diagnóstico tardío de infarto de

miocardio
 Actividad Total
 Isoenzimas: en infarto LDH1>LDH2
 En enfermedad hepática: aumento de LDH5

Bioquímica Médica. J.Huamán S 48

LDH

 Se emplea en el diagnóstico tardío de infarto de

miocardio
 Actividad Total
 Isoenzimas: en infarto LDH1>LDH2
 En enfermedad hepática: aumento de LDH5

Bioquímica Médica. J.Huamán S 49

Isoenzimas CK

Isoenzima estructura Distribución

CK BB BB Cerebro

CKMB MB Corazón
M.esquelético:
menos
CKMM MM M. esquelético

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Perfiles enzimáticos

Perfiles por Enzimas

órganos
Cardiaco: IMA Aspartato aminotransferasa o GOT.
CK total y CKMB
LDH. Total e isoenzimas

Hepático Alanina aminotransferasa o GPT : daño hepatocito

Aspartato aminotransferasa o GOT: daño hepatocito
Fosfatasa alcalina: colestasis Isoenzimas: dif oseo
Gammaglutmiltranspeptidasa: colestasis y drogas,otras
Ceruloplasmina: enf. Wilson

Pancreático Amilasa: pancreatitis aguda

Lipasa: pancretitis aguda

Muscular CK total

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Prostático Fosfatasa ácida prostática

Perfil cardiaco

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Perfil hepático: Transaminasas

Son marcadores de daño en los hepatocitos y

son las más útiles para detectar
enfermedades hepatocelulares agudas como
la hepatitis.
Aspartato amino transferasa (AST) o
Transaminasa Glutámico Oxalacética o GOT
Alanina aminotransferasa (ALT) ó
Transaminasa Glutámico Pirúvica o GPT. Màs
especìfica del hìgado

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Transaminasa glutàmico pirùvica o Alanina
Transaminasa (ALT)

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Fosfatasa alcalina

Enzima marcadora de colestasis u obstrucción

total o parcial del flujo biliar intra o
extrahepática
Aumento :
Discreto <3 veces normal: hepatitis
aguda.Hepatitis crónica. Hepatitis alcohólica,
cirrosis
Marcado :frecuentemente >4 veces normal.
Ictericia obstructiva y obstrucción parcial
Enfermedades óseas
Embarazo

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Gamaglutamiltranspeptidasa

Se emplea para confirmar el aumento

solitario de la fosfatasa alcalina que
podría deberse a problemas
extrahepáticos.

Otras:alcoholismo, drogas

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Enzimas en diagnóstico
por biología molecular
 PCR: reacción de la polimerasa en cadena. Tag
polimerasa resistente al color produce miles de
copias de DNA original. Aplicaciones en
enfermedades infecciosas: carga viral de VIH,
hepatitis C, diagn´stico de TBC, CMV, etccc. No
infecciosas: paternidad, alteraciones genéticas.
 Detección de polimorfismo de longitud del
fragmento de restricción usando enzimas
específicas: drepanocitosis, talasemias,
fenilcetonuria

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Enzimas como reactantes
en kits diagnósticos
 Glucocinsa, hexocinasa y peroxidasa : determinación de
glucosa
 Colesteroloxidasa: determinación de colesterol
 Lipasa: triglicéridos
 Puede ser en tecnología líquida o sólida como las tiras

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ELISA

 Inmunoensayo
 Metodología que combina la especificdad de la
reacción antígeno-anticuerpo con la de la reacción
enzima-sustrato-producto, al final se mide el
producto que guarda relación directa o inversa con
el antígeno o anticuerpo que se quiere medir
 "Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay" Ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas
 Aplicación: Infecciones: detección de anticuerpos
VIH, Hepatitis B, C, D, A, Detección de antígenos:
Superficie HVB, p24. No infecciosas: marcadores
tumorales, hormonas, drogas
 Derivados del ELISA. Enzimoinmunoensayos.
Fluorescencia. Quimioluminiscencia
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Enzimas como agentes
terapeúticos
 Estreptoquinasa: producido por estreptococos. Disolver
coágulos o trom bolisis en infarto de miocardio. Activa
al plsminógeno que se convierte en plasmina
 Activador del plasminógeno E coli recombinante. Lisis
de coágulo
 Asparraginasa: en quimioterapia de leucemia. La
asparragina es necesaria para su metabolismo

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 Tipos de inhibición enzimática.
Tipo Subtipo Unión del Cinética
Inhibidor

Reversible Competitiva I+E Compite con

Sitio C: SUS Sustrato
Aumenta Km

No competitiva I+E ò I+ES No compite con
No SUS Sustrato
Disminuye Vmax

Acompetitiva I+ES No compite con

No SUS Sustrato
Disminuye Vmax y
Km

Irreversible Venenos Gr.funcionaldel No Compite con

Enzimàticos Sitio C Sustrato

Inhibidores Al SUS Producto se une

suicidas covalente CC
Regulación alostérica

 Definición: proceso por el cual una enzima al unirse a

un modulador o modificador(alostérico) en un lugar
distinto(sitio alostérico) al sitio catalítico ,sufre un
cambio conformacional que lo lleva a modificar su
actividad inicial.
 Activación alostérica: aumenta actividad
 Inhibición alostérica: disminuye actividad
Modificación covalente de las
enzimas
 Puede ser irreversible o reversible
 La modificación covalente irreversible (proteólisis)
convirtiendo proenzimas a enzimas
 Reversible: las enzimas de regulación pueden sufrir
adición reversible de moléculas y aumentar o disminuir
su actividad.
 La fosforilación-defosforilación es el sistema más usado
en las enzimas.Generalmente es fosforilación (por
cinasas) o defosforilación (por fosfatasas)
 Otro mecanismo: acetilación y desacetilación

Bioquímica Médica. J.Huamán S 64