ANTICUERPOS ANTI-HLA

Madelyn Vallejo Bolaños

R1 Patología Anatómica y Clínica
Universidad Nacional de Colombia
Noviembre 2018
 TRASPLANTE DE ÓRGANOS EN COLOMBIA

ÓRGANOS
CORAZÓN, PULMONES, INTESTINO, HIGADO, RIÑONES Y PANCREAS

TEJIDOS
CÓRNEA, PIEL, HUESOS, TENDONES, CARTILAGOS, VALVULAS CARDIACAS, MEDULA OSEA, VASOS
SANGUINEOS.
 TRASPLANTE DE ÓRGANOS EN COLOMBIA

En el último año el número de trasplantes realizados en el país creció 21 %, pasando de 1.068

trasplantes en 2016 a 1.287 en el último año.

Instituto Nacional de Salud. Boletín de prensa. 9 de febrero de 2018.

 TRASPLANTE DE ÓRGANOS EN COLOMBIA
Actualmente, hay 2.585 personas en lista de espera para recibir un trasplante.
Los órganos más solicitados después del riñón (2.477), son hígado (147), pulmones (36), corazón
(21), páncreas (5) e intestino (1).

Instituto Nacional de Salud. Boletín de prensa. 9 de febrero de 2018.

Abbas A.K. Lichtman A. H. y Pober J. S. 8º Ed. “Inmunología celular y molecular”. Sanunders-Elsevier. (2015).
 COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (CMH)
• Complejo de antígenos leucocíticos humanos (HLA, human leukocyte antigen)
• Es una región de 4 megabases (Mb) situada en el cromosoma 6 (6p21.3)
• Los genes más conocidos son los del HLA clases I y II.
 NOMENCLATURA HLA

.
TIPIFICACION HLA
Nomenclatura serológica de baja resolución
HLA B27

HLA: región del gen

B: locus en particular
B27: Antígeno HLA
 TIPIFICACIÓN MOLECULAR

• PCR- SSP: reacción en cadena de la polimerasa utilizando primers o cebadores,

específicos de secuencia.

• PCR-SSOP reversa, Luminex: reacción en cadena la polimerasa utilizando sondas

de oligonucleótidos específicos de secuencia. Técnica de fase solida con
metodología Luminex.

• SBT: Tipificación basada en la secuenciación.

 TIPIFICACIÓN MOLECULAR: PCR-SSP
En un microtubo se pone:
ADN GENÓMICO +
DESOXINUCLEOTIDOS(dNTP): d-adenina, d-guanina, d-citosina, d-timina
PRIMERS ESPECIFICOS DE SECUENCIA +
TAQ POLIMERASA +
BUFFER DE REACCIÓN +
AMPLIFICACION DE LOS ALELOS HLA EN EL TERMOCICLADOR
CORRIDA ELECTROFORETICA EN UN GEL DE AGAROSA
TINCIÓN DEL GEL Y VISUALIZACIÓN EN TRANSILUMINADOR
PCR-SSP
Resolución baja, mediana o alta
HLA-B*27

HLA: región del gen

B: locus en particular
*: separador usado en técnicas moleculares
27: grupo de alelos que codifican para el antígeno B27
TIPIFICACIÓN MOLECULAR: PCR-SSOP
Tipificación molecular: PCR-SSOP, Multiplex
PCR-SSOP, LUMINEX
Resolución media o alta
HLA-B*27:01

HLA: región del gen

B: locus en particular
*: separador usado en técnicas moleculares
27: grupo de alelos que codifican para el antígeno B27
01: variante alélica del alelos B27
 TRASPLANTE DE ÓRGANO SOLIDO

• Para la identificación de donante-receptor para el trasplante de órgano sólido, adicionalmente a los

estudios HLA, se requiere demostrar que los pacientes no se han sensibilizado y hayan desarrollado
anticuerpos contra los antígenos HLA.

• Las pruebas de sensibilización previa, son fundamentales para evitar las reacciones de rechazo
hiperagudas, agudas y crónicas en los pacientes a trasplantar.

• Entre estas pruebas se encuentran los estudios P.R.A. (Panel de anticuerpos Reactivos), P.R.A single
antigen (Panel de anticuerpos reactivos contra antígenos individuales), las pruebas cruzadas
(Crossmatch) y las pruebas D.S.A (Anticuerpos Donante Específico)
 DETECCION ANTICUERPOS ANTI- HLA

• Casi un tercio de los pacientes en lista de espera para trasplante

pueden tener un grado de anticuerpos anti-HLA detectado.
• La ruta habitual de sensibilización hacia los antígenos HLA ocurre en
tres casos: Embarazo, post transfusión de sangre y trasplante previo.
• Cuando la prueba cruzada es negativa, incluso los títulos bajos de
DSA pueden llevar a un rechazo temprano o tardío mediado por
anticuerpos.

World J Transplant 2017 December 24; 7(6): 339-348. Human leukocyte antigen typing and crossmatch: A comprehensive review
Ensayos de Fase sólida: Tecnología Luminex
A)La tecnología luminex utiliza unas microesferas de látex, en cada
una de las cuales se acopla una determinada molécula. Cada esfera
tiene dos colorantes (rojo e infrarojo), la relación entre estos dos
colores permite diferenciar 100 tipos de microesferas.

B) los anticuerpos se unen a una molécula específica que esta en una

determinada microesfera, luego se usa un detector de anticuerpo
con ficoeritrina.
C) Las esferas y el detector del AC se leen con el citómetro Luminex LABScan 100, provisto de dos
sistemas de láser, uno identifica el código de color de las esferas y el otro el del detector del
anticuerpo.

D) Los resultados se analizan mediante un programa informático que los ordena por intensidad
creciente o decreciente. La intensidad de los AC se mide mediante ―MFI(Intensidad de
fluorescencia media).
Fases de detección de AC por tecnología Luminex
Según las recomendaciones de la casa comercial One Lambda®, se utilizan 3 fases consecutivas de
especificidad creciente: ―Labscreen mixed, ―Labscreen PRA y ―Singel Antigen Beads.
a)Labscreen Mixed:
• Realiza un primer filtro de detección de anticuerpos anti-HLA, informando sobre la existencia o
no de éstos, siendo posible diferenciar de que clase son (clase I o II).
• Para esta técnica se utilizan 11 microesferas de látex diferentes recubiertas con mezclas de
antígenos HLA, de clase I (HLA-A, HLA-B y HLA-C) y de clase II (HLA-DR, HLA-DQ Y HLA-DP), las
esferas con antígenos de clase I tienen 3 identidades y las de clase II tienen 5 identidades. Si la
prueba es negativa no es necesario avanzar a las siguientes fases.
• Se han interpretado como positivos los MFI superiores a la cuarta parte del MFI correspondiente
al control positivo. Actualmente y con posterioridad a la lectura de las determinaciones
realizadas para esta tesis, se consideran MFI positivos por encima de 1500.
b)Labscreen PRA:

Consiste en una segunda fase que utiliza un panel de 57 microesferas recubiertas con antígenos
HLA de clase I y 37 para clase II. Se puede hacer de forma independiente para ambas clases de AC
(PRA I y PRA II). Informa del porcentaje de reactividad y de la especificidad de los AC, de forma
más sensible que Labscreen mixed.
Si el PRA I es positivo se pasa a ―Single antigen de clase I. Si PRA II es positivo se pasa a ―Single
antigen de clase II.
c)Single Antigen Beads (SAB):
Es la tercera fase de esta técnica. Permite detectar con gran precisión las identidades HLA.
Cada microesfera está recubierta por solo un antígeno de clase I o de clase II, permitiendo
identificar los alelos para todos los 11 locus HLA. (A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1, DQB1,
DPBA1, DPB1) (Pei 2003, Taylor 2009) Algunos de estos no podían ser identificados mediante las
pruebas anteriores, de esta forma el SAB ha puesto de manifiesto el rol de los anticuerpos contra
epítopos específicos como HLA-Cw, HLA-DQA, HLA-DPA/B en el rechazo contra el injerto (Dunn
2011, Billen 2010).
Plataforma de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas:
En este método, las moléculas de HLA purificadas se aplican a las plataformas de ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y se unirán individualmente al anticuerpo HLA
después de la adición del suero receptor.
Luego se agregan anticuerpos conjugados con enzimas a IgG (humanos) para detectar la presencia
de anticuerpos HLA en el suero que se une al antígeno. La detección se realiza mediante lectura de
densidad óptica
 ANTICUERPOS ANTI- HLA DE DONANTE ESPECIFICO
(DSA)
• Se utiliza para la detección cualitativa de anticuerpo IgG específicos del donante
de clase I y II.
• Pruebas pre y post trasplante .
• Los beats magnéticos se unen a las proteínas HLA extraídas de los linfocitos del
donante (lisado de Lin de sangre periférica o del bazo) y se enfrentan después al
suero del receptor.
• MFI positivo si es mayor a 2000
 CROSSMATCHING (XM)
• La prueba cruzada identificará si un receptor tenía anticuerpos contra un
donante específico de interés.

• La prueba cruzada citotóxica de células T tuvo una tasa de falsos positivos del
20% y una tasa de falsos negativos del 4%. Por lo tanto, es insuficiente para
identificar todos los anticuerpos relevantes, y además de eso, puede excluir
innecesariamente a pacientes del trasplante.

• La prueba de anticuerpos en fase sólida debe usarse junto con los resultados de
pruebas cruzadas para identificar aquellos que son inmunológicamente
relevantes.
Prueba cruzada de citotoxicidad dependiente del complemento CDC-XM

• Se interpreta como positiva si se destruye un número considerable de linfocitos después de la

incorporación del complemento. Esto sugiere que un DSA significativo se ha unido a la superficie celular.
• Se puede realizar para los linfocitos B y T.
• La técnica CDC-AHG (modificación de la técnica clásica), utiliza la adición de la reacción de un anticuerpo
anti-cadena ligera humana κ (antiglobulina) para amplificar la reacción de citotoxicidad .
• La sensibilidad es limitada si el anticuerpo relevante está en títulos bajos, pero esto se puede superar
aumentando el tiempo de incubación, el uso del método mejorado con AHG y los pasos de lavado
adicionales.
• Los anticuerpos que están presentes en títulos más bajos son clínicamente significativos, ya que una
prueba negativa tiene una pérdida de injerto del 18% en 1 año en comparación con una prueba positiva
que se asocia con el 36%
Citometría de flujo prueba cruzada (FCXM)

 Detecta DSA independientemente de la fijación del complemento. Detecta con precisión la

presencia o ausencia de IgG DSA en los linfocitos del donante.
 En este método, el suero del receptor se mezcla con los linfocitos del donante y luego se marca
con un Anticuerpo anti-IgG conjugado con fluorocromo.
 Se pueden agregar varios anticuerpos con fluorocromos separados particulares a las proteínas
de la superficie de los linfocitos B y T
 Con el uso de citometría de flujo, los linfocitos B y T pueden identificarse fácilmente y hacer que
sus DSA sean evaluados individualmente.
PRUEBAS CRUZADAS VIRTUALES
Tanto la tipificación de HLA del donante como la selección de anticuerpos en fase sólida se utilizan
juntos.

"mezclar" las especificidades de anticuerpos identificadas del suero receptor con antígenos HLA
del donante.
• Los títulos, las especificidades y la presencia o ausencia de anticuerpos podrían variar
significativamente con el tiempo.
• El VXM debe realizarse considerando todos los resultados de suero disponibles, incluyendo al
menos uno reciente en menos de 3 a 6 meses para un paciente determinado.
DEFINIR RIESGO
Gebel et al estratificaron a los posibles pacientes con trasplante renal en varias categorías según el riesgo inmunológico en
los trasplantes renales.

Alto riesgo inmunológico

En el momento del trasplante, existen altos títulos de anticuerpos circulantes específicos para el HLA del donante (DSA).
Esto puede llevar al rechazo hiperagudo. La presencia de DSA excluye el trasplante. Sin embargo, hay informes de
regímenes innovadores de desensibilización antes del trasplante para reducir este riesgo.

Riesgo inmunológico intermedio.

En el momento del trasplante, hay un título bajo de DSA, y el DSA histórico no es detectable. Puede ser aceptable
considerar la inmunosupresión intensificada así como el monitoreo inmunológico en el período posterior al trasplante.

Riesgo inmunológico estándar

Donde no hay evidencia de sensibilización dirigida por el donante al HLA.