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ESPECTROSCOPIA
INTERACCIÓN RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA - MATERIA
ESPECTROFOTOMETRÍA
La cantidad de luz
absorbida es
directamente
proporcional a la
concentración de la
sustancia
• La luz, considerada como onda, consiste en un
campo magnético y un campo eléctrico
perpendiculares entre sí. El haz de luz es un flujo de
fotones a diferentes longitudes de onda
• Fotocolorimetría:
Solo utiliza el espectro de luz visible
Ley de Bourguer-Lambert-
Beer o ley general de la
espectrofotometría :
Io permite hallar la
concentración de una
especie química a partir de la
It
medida de la intensidad de
luz absorbida por la muestra.
-Abs
Lectura de It/Io = 10
absorbancia o
densidad óptica
-
• Ab= kC
ESPECTROFOTOMETRÍA
La solución estándar,
contiene una
concentración
conocida de la
sustancia que se
esta midiendo.
Abst=kCst
AbX=kCx
La relación
AbX kCx Cst/Abst= factor de
CX = Cst x AbX
Abst kCst calibración .
Abst
CX=Fc x AbX
ESPECTROFOTOMETRÍA
• Utilidad:
Identificar una
sustancia.
Concentracion
de las
sustancias.
https://www.youtube.com/watch?v=fXjP10sdmQU
https://www.youtube.com/watch?v=0NqqS67uIMw
https://www.youtube.com/watch?v=vVG95EXVCMY
ELECTROFORESIS
SIGNIFICA MOVER CON ELECTRICIDAD
ELECTROFORESIS
• Fuente de
alimentación
ELECTROFORESI
S
• Dos electrodos:
• Ánodo (+)
• Cátodo (-)
• Tampón de
electroforesis
• Soporte
electroforético
ELECTROFORESIS
La velocidad de migración es:
Inversamente
proporcional al tamaño
de la molécula.
Inversamente proporcional a la
viscosidad del medio.
Proporcional a la fuerza
aplicada al campo.
Proporcional a la
carga neta de la
molécula
Inversamente proporcional al
coeficiente de fricción
ELECTROFORESIS
PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA:
• Parámetros externos
• Campo eléctrico
• Temperatura
• Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema
electroforético
• Viscosidad
• Fuerza iónica
• La naturaleza de los iones componentes
• El pH
• Parámetros relacionados con el soluto
• La carga
• La forma y
• tamaño de los iones
TIPOS DE ELECTROFORESIS
De frente
Zonal Continua
móvil
ELECTROFORESIS DE FRENTE MÓVIL
Se utilizan pequeñas
cantidades de muestra. El medio de soporte
absorbe algunas veces,
Soporte: evita las varias de las especies
perturbaciones moleculares.
mecánicas y las
corrientes de Actúa como tamiz
convección por molecular,
cambios de T° o por la contribuyendo también
densidad de la a la separación.
disolución.
ELECTROFORESIS ZONAL
Desventajas:
• En papel:
Si el papel es fino, se
BAJO VOLTAJE
ALTO VOLTAJE
proteicas. Utilidad: para la
separación de entre las proteínas y los
aa y péptidos. grupos hidroxilos de la
celulosa del papel, por lo
tanto la migración se
frena.
Calidad del papel: 90% de
celulosa absorción de
agua y conductividad
eléctrica.
Efecto electro osmótico
ánodo-cátodo
ELECTROFORESIS ZONAL
No hay
interacción
con las
proteínas.
ELECTROFORESIS ZONAL
• En gel:
Técnica barata,
Almidón fácil y rápida
Buena resolución.
Separación de moléculas
Agarosa grandes con r>5-10 nm
(virus. Ac. Nucleicos.
Lipoproteínas.
ELECTROFORESIS ZONAL
• En gel:
• Electroforesis en geles con SDS
• Aplicación:
https://www.youtube.com/watch?v=N
L1usCc0n38
CROMATOGRAFÍA
SEPARACIÓN DE LOS COMPONENTES DE UNA MEZCLA DEBIDO A LA
INFLUENCIA DE DOS EFECTOS CONTRAPUESTOS
CROMATOGRAFÍA
Retención. Efecto
producido sobre los
componentes de la
mezcla por una fase
estacionaria, que
puede ser un sólido o un
líquido anclado a un
soporte sólido
Desplazamiento. Efecto
ejercido sobre los
componentes de la
mezcla por una fase
móvil, que puede ser un
líquido o un gas.
CROMATOGRAFÍA
Según la naturaleza de la Según la interacción entre
fase estacionaria y de la la mezcla, la fase móvil y
fase móvil estacionaria
• C. sólido-líquido. La fase
estacionaria es un sólido y la
móvil un líquido. • Cromatografía de
adsorción.
• C. líquido-líquido. La fase
estacionaria es un líquido
anclado a un soporte sólido.
• Cromatografía de
• C. líquido-gas. La fase partición.
estacionaria es un líquido no
volátil impregnado en un sólido y
la fase móvil es un gas.
• Cromatografía de
• C. sólido-gas. La fase
estacionaria es un sólido y la intercambio iónico.
móvil un gas.
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
cromatografía de adsorción o
cromatografía líquido-sólido,
cromatografía gas-sólido
Separación por
adsorción/desorción La fase estacionaria es un
sólido polar capaz de
adsorber a los
componentes de la mezcla
mediante interacciones de
tipo polar.
La separación se dá
por la partición del
soluto entre dos
fases líquidas
(solubilidad relativa)
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
=Rf = sustancia
ascendente
descendente
https://www.youtube.com/watch?v=ZS
gR4WABMIA
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Utilidad:
Identifica alcoholes,
esteres, ac. Grasos,
aminas.
-12
Muy sensible (10
gramos
Muy rápida
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
fase sólida: contiene grupos
sulfónicos o carboxílicos (para
la separación de cationes) o
grupos amino cuaternarios,
ternarios o secundarios (para
la separación de aniones)
fase móvil: los iones (NaHCO3 La fase estacionaria
y Na2CO3) (cambiadores de iones)
tiene una superficie
cargada iónicamente, con
cargas iónicas opuestas a
las de los eluyentes
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
• Elección del intercambiador iónico:
• Aniónico o catiónico.
• Elección de la porosidad y tamaño de la matriz:
• Las moléculas pequeñas se separan mejor con tamaño de poro
pequeño.
• Las macromoléculas necesitan tamaño de poro mayor.
• Elección del pH, tampón y condiciones iónicas:
• Tampón catiónico para intercambiador aniónico
• Tampón aniónico para intercambiadorIntercambiadores
catiónico
iónicos:
Dextrano, celulosa,
estireno-divinil-
benceno, acrílica,
fenólica, epoxi amínica
CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN
GEL (EXCLUSION MOLECULAR)
Geles:
Sophadex: polímero de
dextrano
Agaraso: polímero
La separación se basa
en el tamaño lineal de galactosa
molecular. La fase Poliacrilamida
estacionaria es un
material de tamaño de
poro definido
Utilidad:
Separación de
Capacidad del soluto de penetrar en los moléculas que se
poros de la fase estacionaria, las moléculas diferencian en su
con menor tamaño atraviesan la columna y PESO MOLECULAR.
son retenidos. Los solutos demasiado
grandes no son retenidos
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Condiciones:
La matriz no debe adsorber por si
misma moléculas.
El ligando debe unirse a la matriz sin
alteración de sus propiedades .
Debe escogerse un ligando cuya
unión sea fuerte.
Debe ser posible la elución sin
destrucción de la muestra.
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
• Utilidad: Purificación de
enzimas
Purificación de anticuerpos
Purificación de
proteínas de
transporte
Purificación de
membranas
Purificación de
glicoproteínas
Separación de células
animales específicas
RADIOISÓTOPOS
RADIOISÓTOPOS
Descubrió accidentalmente
la existencia de unos rayos
Becquerel desconocidos que provenían
de una sal de uranio
Irene
Curie y Descubrieron la
Frederic radioactividad ARTIFICIAL
Joliot
RADIOISÓTOPOS
RADIOISÓTOPOS
Utilidad: TRAZADORES:
Para marcar compuestos químicos e introducirlos en
organismos vivos y determinar sus transformaciones
químicas, para dilucidar vías metabólicas
AUTORRADIOGRAFÍA:
Se marca una biomolécula con un precursor
isotópico y luego se detecta la imagen por
emulsión fotográfica
RADIOINMUNOENSAYO O
RADIOINMUNOANALISIS:
Cuantificación de sustancias en muy bajas
concentraciones mediante la unión de
sustancias radioactivas a anticuerpos
RADIOINMUNOENSAYO: RIA
FUNDAMENTO
Se mezcla una cantidad constante de antígeno
marcado
radioactivamente y una cantidad constante de un
anticuerpo
para ese antígeno
Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y
anticuerpo (Ac)
Se separa la fracción de antígeno que se ha unido de
la que
permanece libre (hay varias formas de hacerlo. En la
figura
inferior se utiliza un 2º anticuerpo dirigido contra el
primero)
se determina la radioactividad
Si la muestra contiene además antígeno frío (no
Esta técnica fué desarrollada por Solomon A. Berson y Rosalyn Yalow
en 1960 para determinar la concentración de insulina en el plasma
sanguíneo. Por ese motivo, R. Yalow recibió el Nobel de Medicina en
1977 (Berson murió en 1972). Hoy en día, esta técnica se utiliza para
detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades
muy pequeñas y mezcladas con muchas otras. Es por tanto una
técnica muy sensible y muy específica. Utilizando anticuerpos de
gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de antígeno. (1
pg = 10-12 g).
RADIOINMUNOENSAYO: Solomon A. Berson y Rosalyn
Yalow: 1960
SISTEMA Añadido del Añadido del
CONTROL primer segundo
anticuerpo anticuerpo
específico
Antígeno
Se establece una Sólo la mitad del
marcado competencia entre complejo antígeno
radioactivamente el antígeno anticuerpo
radioactiva y el resultará
antígeno frio radioactivo
Si se realiza el ensayo con una muestra que contiene una cantidad desconocida del
antígeno no
marcado y se mide la radioactividad asociada a los anticuerpos, por interpolación
sobre la curva de
Radioactividad Ag-Ac
CPM del sistema
calibrado se puede estimar la concentración del antígenocon
fríolaen la muestra.
muestra
Cantidad de
antígeno en la
muestra
(CPM)
Concentración de antígeno
(nM)
Hormonas:
Prolactina, Glucagon , Insulina, Gonadotrofina Coriónica humana,
Corticotropina, TSH, etc
Otras sustancias:
Morfina , vitaminas, Barbitúricos, Prostaglandinas, cAMP, , Antígenos virales
, marcadores tumorales, etc.