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MÉTODOS BIOQUÍMICOS

ESPECTROSCOPIA
INTERACCIÓN RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA - MATERIA
ESPECTROFOTOMETRÍA

Técnica analítica que permite identificar


sustancias y determinar la concentración de
dicho compuesto en solución

Estudia la interacción de la radiación


electromagnética con la materia

La cantidad de luz absorbida depende de


forma lineal de la concentración

• Método científico utilizado para medir la cantidad de energía


radiante (luz) que absorbe una sustancia química, en función de
la longitud de onda de la radiación; midiendo la intensidad de la
luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra,
basándose en la Ley de Beer-Lambert
ESPECTROFOTOMETRÍA

• Determina la concentración de una sustancia,


valiéndose de la capacidad de absorber la luz a
determinadas longitudes de onda.
• Este método emplea una fuente de radiación:

La cantidad de luz
absorbida es
directamente
proporcional a la
concentración de la
sustancia
• La luz, considerada como onda, consiste en un
campo magnético y un campo eléctrico
perpendiculares entre sí. El haz de luz es un flujo de
fotones a diferentes longitudes de onda

• Cuando una de estas ondas encuentra una molécula,


puede ser dispersada (alterada su dirección de
propagación) o bien absorbida (su energía se
transfiere a la molécula), la probabilidad de estos
sucesos, depende de las propiedades de la molécula.
ESPECTRO DE ABSORCIÓN
ESPECTROFOTOMETRÍA
ESPECTROFOTOMETRÍA

• Fotocolorimetría:
Solo utiliza el espectro de luz visible

Ley de Bourguer-Lambert-
Beer o ley general de la
espectrofotometría :
Io permite hallar la
concentración de una
especie química a partir de la
It
medida de la intensidad de
luz absorbida por la muestra.

-Abs
Lectura de It/Io = 10
absorbancia o
densidad óptica
-

Cuando un haz de luz atraviesa un medio absorbente de espesor


constante, la cantidad de energía luminosa absorbida por el medio varia
en forma directamente proporcional a la concentración del absorbente en
el medio
ESPECTROFOTOMETRÍA

• La relación It / I0 se conoce como transmitancia, T.


• T = It / Io
• Log It/Io=-kLC
• -Log It/Io= kLC
• -Log T= kLC
• -Log T = Absorbancia o densidad
óptica. L=1 cm

• Ab= kC
ESPECTROFOTOMETRÍA

La solución estándar,
contiene una
concentración
conocida de la
sustancia que se
esta midiendo.

Abst=kCst

AbX=kCx

La relación
AbX kCx Cst/Abst= factor de
CX = Cst x AbX
Abst kCst calibración .
Abst
CX=Fc x AbX
ESPECTROFOTOMETRÍA

• Curva de calibración: también permite calcular la


CX.
• Se utiliza cuando son varias soluciones estándar.
• Cuyas concentraciones son conocidas.
• Cuyas absorbancias se miden con el fotocolorímetro
o espectrofotómetro.

Coeficiente de extinción molar= tang. a


a
ESPECTROFOTOMETRÍA

• Utilidad:

Identificar una
sustancia.
Concentracion
de las
sustancias.

https://www.youtube.com/watch?v=fXjP10sdmQU
https://www.youtube.com/watch?v=0NqqS67uIMw
https://www.youtube.com/watch?v=vVG95EXVCMY
ELECTROFORESIS
SIGNIFICA MOVER CON ELECTRICIDAD
ELECTROFORESIS

• Transporte de partículas que poseen carga eléctrica a


través de un disolvente mediante un campo eléctrico.
ELECTROFORESIS
• Utilidad: caracterizar una macromolécula
mediante la determinación de la velocidad con
que se mueve en el campo eléctrico.
Calcular el peso molecular de una proteína

Distinguir moléculas por su carga neta o su forma

Detectar cambios en aa, de restos polares o no


polares.

Para separar cuantitativamente distintas especies


moleculares.
Componentes:

• Fuente de
alimentación
ELECTROFORESI
S
• Dos electrodos:
• Ánodo (+)
• Cátodo (-)

• Tampón de
electroforesis

• Soporte
electroforético
ELECTROFORESIS
La velocidad de migración es:

Inversamente
proporcional al tamaño
de la molécula.

Inversamente proporcional a la
viscosidad del medio.

Proporcional a la fuerza
aplicada al campo.

Proporcional a la
carga neta de la
molécula
Inversamente proporcional al
coeficiente de fricción
ELECTROFORESIS
PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA:
• Parámetros externos
• Campo eléctrico
• Temperatura
• Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema
electroforético
• Viscosidad
• Fuerza iónica
• La naturaleza de los iones componentes
• El pH
• Parámetros relacionados con el soluto
• La carga
• La forma y
• tamaño de los iones
TIPOS DE ELECTROFORESIS

•Las macromoléculas •La disolución a tratar se •La muestra se aplica


están dispersas en toda aplica como una también en una zona
la disolución y se mancha, o banda, y las pero se añade
mueven en forma libre partículas migran a continuamente a lo
en el medio. través de un disolvente, largo del proceso
utilizando un medio
soporte (papel o ciertos
tipos de geles)

De frente
Zonal Continua
móvil
ELECTROFORESIS DE FRENTE MÓVIL

• Las sustancias a separar se


introducen en un tubo en
forma de U, disueltas en un
tampón de pH y fuerza iónica
adecuados.
• Se colocan los electrodos en
sumergidos en cada brazo
del dispositivo, entre los que Determinación
se crea un campo eléctrico, de la movilidad
provocando que las
moléculas (proteínas) y punto
cargadas migren hacia los isoeléctrico de
electrodos de polaridad las proteínas.
opuesta.
• Su posición se determina en Poca utilidad
función del tiempo por óptica de la
de Schlieren.
determinación
cuantitativa.
ELECTROFORESIS ZONAL

• Se coloca una mancha o fina capa de muestra en


contacto con un medio semisólido o gelatinoso, se
aplica un campo eléctrico y las partículas migran a
través del soporte.

Se utilizan pequeñas
cantidades de muestra. El medio de soporte
absorbe algunas veces,
Soporte: evita las varias de las especies
perturbaciones moleculares.
mecánicas y las
corrientes de Actúa como tamiz
convección por molecular,
cambios de T° o por la contribuyendo también
densidad de la a la separación.
disolución.
ELECTROFORESIS ZONAL
Desventajas:
• En papel:
 Si el papel es fino, se
BAJO VOLTAJE

puede desgarrar con


20 V/cm. 200 V/cm, la facilidad.
Utilidad: para el velocidad de  Si el papel es grueso, las
separación
análisis de
aumenta.
bandas se distorsionan.
mezclas  Se produce interacción

ALTO VOLTAJE
proteicas. Utilidad: para la
separación de entre las proteínas y los
aa y péptidos. grupos hidroxilos de la
celulosa del papel, por lo
tanto la migración se
frena.
 Calidad del papel: 90% de
celulosa absorción de
agua y conductividad
eléctrica.
 Efecto electro osmótico
ánodo-cátodo
ELECTROFORESIS ZONAL

• En tiras de acetato de celulosa: La mayor parte


de los grupos
hidroxilo de la
celulosa están
esterificados con
residuos acetato

No hay
interacción
con las
proteínas.
ELECTROFORESIS ZONAL

• En gel:
 Técnica barata,
Almidón fácil y rápida

 Útil para proteínas y pequeñas


moléculas de RNA.
 Mejor efecto como tamiz
molecular.
 Proporciona control del tamaño de
Poliacrilamida sus poros utilizando Polímeros de red
concentraciones distintas de tridimensional
monómeros
 Presenta adsorción despreciable
de proteínas.
 De alta resolución.
 Sus componentes son tóxicos

 Buena resolución.
 Separación de moléculas
Agarosa grandes con r>5-10 nm
(virus. Ac. Nucleicos.
Lipoproteínas.
ELECTROFORESIS ZONAL

• En gel:
• Electroforesis en geles con SDS

• Los pesos moleculares de la mayoría de las proteínas pueden


ser determinados midiendo la movilidad en geles de
poliacrilamida con el detergente dodecilsulfato sódico (SDS).

• Las proteínas multicatenarias se unen al SDS y se disocian, por lo


que se pierde su estructura secundaria.
ELECTROFORESIS

• Aplicación:

https://www.youtube.com/watch?v=N
L1usCc0n38
CROMATOGRAFÍA
SEPARACIÓN DE LOS COMPONENTES DE UNA MEZCLA DEBIDO A LA
INFLUENCIA DE DOS EFECTOS CONTRAPUESTOS
CROMATOGRAFÍA

Retención. Efecto
producido sobre los
componentes de la
mezcla por una fase
estacionaria, que
puede ser un sólido o un
líquido anclado a un
soporte sólido

Desplazamiento. Efecto
ejercido sobre los
componentes de la
mezcla por una fase
móvil, que puede ser un
líquido o un gas.
CROMATOGRAFÍA
Según la naturaleza de la Según la interacción entre
fase estacionaria y de la la mezcla, la fase móvil y
fase móvil estacionaria

• C. sólido-líquido. La fase
estacionaria es un sólido y la
móvil un líquido. • Cromatografía de
adsorción.
• C. líquido-líquido. La fase
estacionaria es un líquido
anclado a un soporte sólido.
• Cromatografía de
• C. líquido-gas. La fase partición.
estacionaria es un líquido no
volátil impregnado en un sólido y
la fase móvil es un gas.
• Cromatografía de
• C. sólido-gas. La fase
estacionaria es un sólido y la intercambio iónico.
móvil un gas.
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
cromatografía de adsorción o
cromatografía líquido-sólido,
cromatografía gas-sólido

Separación por
adsorción/desorción La fase estacionaria es un
sólido polar capaz de
adsorber a los
componentes de la mezcla
mediante interacciones de
tipo polar.

característica particular : es su capacidad


para diferenciar compuestos isómeros de
mezclas
Fase estacionaria Sustancias que separan
Alúmina Moléculas orgánicas
pequeñas, proteínas
Gel de sílice Esteroles, aa, lípidos
Carbón activado Péptidos, aa, azucares
Fosfato de calcio Proteínas, poli
nucleótidos
Hidroxiapatita Ácidos nucleicos
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN

La separación se dá
por la partición del
soluto entre dos
fases líquidas
(solubilidad relativa)
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

Fase estacionaria: papel


Identificación de sustancias:
Relación de frente ( Rf)

Rf distancia recorrida por la sustancia


distancia recorrida por el solvente

=Rf = sustancia

ascendente

descendente
https://www.youtube.com/watch?v=ZS
gR4WABMIA
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

• Fase estacionaria: lamina de 0,25 a 0.5 mm sobre


una placa de vidrio o plástico
• Gel de sílice
• Oxido de aluminio
• Silicato de magnesio
• Celulosa
• Poliamida
• Polietileno en polvo
 Mayor poder de
Utilidad: resolución
 Identificar sustancias  Mayor velocidad
de bajo peso de separación
molecular (aa,  Fácil aislamiento de
azucares, péptidos, la sustancia
nucleótidos, lípidos)
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO O DE
PARTICIÓN
CROMATOGRAFÍA DE GASES

• Fase estacionaria: liquida


• Fase móvil: gaseosa (helio, argón, nitrógeno)
• Las sustancias a analizar deben volatizarse.

Utilidad:
 Identifica alcoholes,
esteres, ac. Grasos,
aminas.
-12
 Muy sensible (10
gramos
 Muy rápida
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
 fase sólida: contiene grupos
sulfónicos o carboxílicos (para
la separación de cationes) o
grupos amino cuaternarios,
ternarios o secundarios (para
la separación de aniones)
 fase móvil: los iones (NaHCO3 La fase estacionaria
y Na2CO3) (cambiadores de iones)
tiene una superficie
cargada iónicamente, con
cargas iónicas opuestas a
las de los eluyentes
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
• Elección del intercambiador iónico:
• Aniónico o catiónico.
• Elección de la porosidad y tamaño de la matriz:
• Las moléculas pequeñas se separan mejor con tamaño de poro
pequeño.
• Las macromoléculas necesitan tamaño de poro mayor.
• Elección del pH, tampón y condiciones iónicas:
• Tampón catiónico para intercambiador aniónico
• Tampón aniónico para intercambiadorIntercambiadores
catiónico
iónicos:
Dextrano, celulosa,
estireno-divinil-
benceno, acrílica,
fenólica, epoxi amínica
CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN
GEL (EXCLUSION MOLECULAR)

Geles:
 Sophadex: polímero de
dextrano
 Agaraso: polímero
La separación se basa
en el tamaño lineal de galactosa
molecular. La fase  Poliacrilamida
estacionaria es un
material de tamaño de
poro definido

Utilidad:
Separación de
Capacidad del soluto de penetrar en los moléculas que se
poros de la fase estacionaria, las moléculas diferencian en su
con menor tamaño atraviesan la columna y PESO MOLECULAR.
son retenidos. Los solutos demasiado
grandes no son retenidos
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Condiciones:
 La matriz no debe adsorber por si
misma moléculas.
 El ligando debe unirse a la matriz sin
alteración de sus propiedades .
 Debe escogerse un ligando cuya
unión sea fuerte.
 Debe ser posible la elución sin
destrucción de la muestra.
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

• Utilidad: Purificación de
enzimas

Purificación de anticuerpos
Purificación de
proteínas de
transporte
Purificación de
membranas
Purificación de
glicoproteínas

Separación de células
animales específicas
RADIOISÓTOPOS
RADIOISÓTOPOS

Descubrió accidentalmente
la existencia de unos rayos
Becquerel desconocidos que provenían
de una sal de uranio

Identificaron que el Polonio


y Radio también emitían Pierre y
radiación espontanea. Madame
Acuñan termino:
RADIOACTIVIDAD
Curie

Irene
Curie y Descubrieron la
Frederic radioactividad ARTIFICIAL
Joliot
RADIOISÓTOPOS
RADIOISÓTOPOS

• Emiten tres tipos de radiación:

Radiación Alfa Radiación Beta Radiación Gamma


• Carga + • Electrones con carga - • Es de naturaleza
• 2 protones y 2 neutrones (negatrones) o con electromagnética
• velocidad: 10 -9 cm carga + (positrones • Disminuye su energía
/seg • Un neutrón se por emisión de fotones
• Escasa penetración transforma en un protón • Mayor penetración
, electrón y un neutrino • Menor ionización
• Mayor ionización
RADIOISÓTOPOS

Utilidad: TRAZADORES:
Para marcar compuestos químicos e introducirlos en
organismos vivos y determinar sus transformaciones
químicas, para dilucidar vías metabólicas

AUTORRADIOGRAFÍA:
Se marca una biomolécula con un precursor
isotópico y luego se detecta la imagen por
emulsión fotográfica

RADIOINMUNOENSAYO O
RADIOINMUNOANALISIS:
Cuantificación de sustancias en muy bajas
concentraciones mediante la unión de
sustancias radioactivas a anticuerpos
RADIOINMUNOENSAYO: RIA

FUNDAMENTO
Se mezcla una cantidad constante de antígeno
marcado
radioactivamente y una cantidad constante de un
anticuerpo
para ese antígeno
Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y
anticuerpo (Ac)
Se separa la fracción de antígeno que se ha unido de
la que
permanece libre (hay varias formas de hacerlo. En la
figura
inferior se utiliza un 2º anticuerpo dirigido contra el
primero)
se determina la radioactividad
Si la muestra contiene además antígeno frío (no
Esta técnica fué desarrollada por Solomon A. Berson y Rosalyn Yalow
en 1960 para determinar la concentración de insulina en el plasma
sanguíneo. Por ese motivo, R. Yalow recibió el Nobel de Medicina en
1977 (Berson murió en 1972). Hoy en día, esta técnica se utiliza para
detectar y cuantificar sustancias que se encuentran en cantidades
muy pequeñas y mezcladas con muchas otras. Es por tanto una
técnica muy sensible y muy específica. Utilizando anticuerpos de
gran afinidad se pueden detectar hasta picogramos de antígeno. (1
pg = 10-12 g).
RADIOINMUNOENSAYO: Solomon A. Berson y Rosalyn
Yalow: 1960
SISTEMA Añadido del Añadido del
CONTROL primer segundo
anticuerpo anticuerpo
específico

Antígeno Todo el complejo


marcado antígeno
radioactivamente anticuerpo
resultará
radioactivo
En ausencia de antígeno frío (no radioactivo), todos los
complejos Ag-Ac serán radioactivos. La radioactividad medida
es máxima
Añadido del
MUESTRA primer Añadido del
Antígeno no anticuerpo segundo
marcado “frio” específico anticuerpo

Antígeno
Se establece una Sólo la mitad del
marcado competencia entre complejo antígeno
radioactivamente el antígeno anticuerpo
radioactiva y el resultará
antígeno frio radioactivo

En presencia de antígeno frío (no radioactivo), éste compite con el


antígeno radioactivo para unirse al anticuerpo. Por tanto la
radioactividad medida es menor. El descenso es proporcional a la
concentración de Ag frío presente en la muestra
Construcción de la curva de
Se construye una curva de calibración
calibrado (color rojo) que relacione la medida de
radioactividad (cpm)
con la concentración de antígeno frío en la muestra

Si se realiza el ensayo con una muestra que contiene una cantidad desconocida del
antígeno no
marcado y se mide la radioactividad asociada a los anticuerpos, por interpolación
sobre la curva de

Radioactividad Ag-Ac
CPM del sistema
calibrado se puede estimar la concentración del antígenocon
fríolaen la muestra.
muestra

Cantidad de
antígeno en la
muestra

(CPM)
Concentración de antígeno
(nM)
Hormonas:
Prolactina, Glucagon , Insulina, Gonadotrofina Coriónica humana,
Corticotropina, TSH, etc
Otras sustancias:
Morfina , vitaminas, Barbitúricos, Prostaglandinas, cAMP, , Antígenos virales
, marcadores tumorales, etc.

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