Results and Discussion

2.1. El gen varS participa en la

regulación de HapA en la cepa
2740-80 de V. cholerae.
CepaV. cholerae 2740-80
• No toxigénica.
• Serotipo El Tor Inaba.
• Mayor actividad de HapA (ensayo de azocaseína)  hapA podría
estar dirigida por un promotor altamente activo en esta cepa.
• CtxB-Tn se transpuso aleatoriamente a 2740-80 : crear el gen ctxB
impulsado por el promotor de hapA   producción de CtxB.
• Se encontró mutantes de inserción defectuosa de HapA (placas de
azocaseína), aislaron siete cepas defectuosas de HapA.
PCR para determinar sitio de inserción
• Sitio de inserción de Tn: análisis de PCR arbitrario y secuenciación.
• 2 PCR (1. usó 3 cebadores, 2. se uso el producto de la primera como
plantilla y dos cebadores).
PCR 1 PCR 2
5'-CAGGGACACCAGGATTTAT-3’,
5'GGCCACGCGTCGACTAGTACNNN
5'-CTTCCGTCACAGGTAGGCG-3 'y
NNNNNNNNGATAT-3 ', y 5'-
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 '
GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNN
NNNNNNACGCC-3 '
 Chromosomal
Strain Insertion sequence b Disrupted gene; ORFc
locationa
VCA0865; Hemagglutinin/
1 7513 (+) I GTCTCCTGCAACATTGTCCA
protease
VCA0865; Hemagglutinin/
2 6995 (+) II CGTGACTATTTCATTGTCCA
protease
VC2453; Sensor histidine
4 7412 (+) I TAAAGCTGTACCATTGTCCA kinase/response regulator
(VarS)
VCA0865; Hemagglutinin/
5 6183 (-) II GCCCAACCTTGCATTGTCCA
protease
VC2453; Sensor histidine
Tabla 2
6 8961 (-) I CCCTACCTACTAATTGTCCA kinase/response regulator
(VarS)
Sitios de
inserción de Tn VC2725; General secretion
en V. cholerae 7 3674 (+) I AGAGTGACGCCAATTGTCCA
pathway protein L
2740-80.
Resultados
• Estos resultados indican que la expresión de hapA en V. cholerae
está involucrada en VarS posiblemente a través de la regulación del
circuito sensorial VarS / VarA, como se propuso. Ninguno de estos
mutantes produjo el CtxB.
2.2. Construcción del mutante
varS, 2740-80-VS
Mutante varS de 2740-80 (2740-80-VS)
• Caracterizar mejor el papel de VarS en la regulación de la expresión
de HapA en V. cholerae.
• Usando pCVD-VarS2.
• 1.6 kb medios del gen varS de 2.8 kb se eliminaron mediante
digestión con AccI.
• Generó un codón de parada TGA justo detrás del sitio AccI.
• La eliminación de varS de 1,6 kb en 2740-80-VS se confirmó mediante
amplificación por PCR y secuenciación.