Sunteți pe pagina 1din 88

E DENUMIRE CULOARE

E100 Curcumina Colorant galben


E101 Riboflavina și riboflavin 5′-fosfatul Colorant galben
E120 Cochineal, acid carminic, carmin Colorant roșu
E140 Clorofile și clorofiline Colorant verde
E141 Complecși cu cupru ai clorofilelor Colorant verde
E150a Caramel I Colorant brun
E160a Caroteni (amestec de caroteni, β - Colorant galben-portocaliu
caroteni)
E160b Anatto, bixina, norobixina Colorant roșu portocaliu
E160c Extract paprika (oleorezina), capsantina, Colorant roșu-carmin
capsorubina
E160d Licopen Colorant roșu
E160e b -apo-8′-carotenal Colorant roșu-portocaliu
E160f Esterul etilic al acidului b- apo-8′- Colorant roșu-portocaliu
carotenoic
E160g Canthaxantina Colorant roșu
E161b Luteina Colorant galben
E162 Rosu de sfecla, betanina Colorant roșu
COLORANȚI NATURALI

I. CAROTENOIDE
DATE GENERALE

• 1940 – Comitetul de experți FAO emite


statutul legal al utilizării carotinoidelor
- sunt cuprinși în lista 1A
- sunt acceptați la colorarea produselor
alimentare
• Se numără printre coloranții cu cel mai ridicat
potențial tinctorial și sunt utilizați în general în
cadrul unei limite între 1 și 25 ppm
CAROTENOIDE
COLORANTI POLIENICI
• Coloranții polienici, carotenoidele, au răspândire
universală, atât în regnul vegetal cât ți în regnul animal.
Organismul animal nu poate sintetiza carotenoide; toate
carotenoidele găsite în organismele animale sunt de origine
vegetală și sunt introduse odată cu hrana.
• Clorofila din frunzele verzi este însoțită de doua
carotenoide: β-carotenul și xantofila.
• Carotenoidele sunt pigmenți galbeni, portocalii și roșii,
insolubili în apă, solubili în grăsimi, numiți de aceea și
coloranți lipocromi. Solubilitatea lor în grăsimi este limitată
dar crește mult cu esterificarea lor cu un acid gras.
• Carotenoidele formează cu proteinele lipoproteide
colorate; cea mai importantă este purpura vizuală din
retină, necesara vederii pe timpul nopții.
FUNCȚIA FIZIOLOGICĂ A CAROTENOIDELOR

• în plante carotenoidele servesc drept complecși de


exploatare a luminii LHC (light harvesting complexes)
având funcția majoră de a strânge energia solară și de a
o transfera centrilor de reacție pentru procesul redox
foto-indus (fotosintaza);

• la om joacă un rol esențial prin relația lor cu vitamina A


și cu substanțele din retină și reprezintă un factor
important pentru sănătate, prin acțiunea lor
antioxidantă și de regulatori ai sistemului imunitar
(cancer, boli cardiace, oftalmologice etc.).
PUPURA VIZUALĂ (Rodopsina)
• Organele microscopice din retină, sensibile la
lumină, se numesc după forma lor: conuri sau
bastonașe. Din bastonașe s-a izolat o substanță
intens roșie numită purpura vizuală sau
rodopsina. Această substanță sensibilă la lumină
este combinația aldehidei corespunzând
vitaminei A (retinina, Ret-CH=O) cu o proteină,
orseina (are o grupare NH2 liberă, Ors-NH2).

• Prin absorbția unei cuante de lumină, rodopsina


trece intr-un compus cu caracter de radical-ion,
așa-numitul “portocaliu trecător”, din care după
scurtă vreme se regenerează rodopsina.
biocurent pe creier ce permite formarea unei imagini
iar Rodopsina revine la starea fundamentala
H H H o
Ors-N=CH-Ret h Ors-N=CH-Ret Ors-N=CH-Ret Ors-NH2 +Ret=CHOtrans
+ + +
cis portocaliu trecator trans
Rodopsina Retinal
izomeraza
(baza Shiff)
H3O+
Ret-CHOcis
(in retina de regula este mediu acid)
CLASIFICAREA CAROTENOIDELOR DUPĂ
STRUCTURA CHIMICĂ

1.Hidrocarburi carotenoidice cu 40 atomi de carbon


(C40H56);
2.Derivați oxigenați ai carotenoidelor (conțin grupe
hidroxi, epoxi, furanoidice, cetonice);
3.Carotenoide cu mai puțin de 40 atomi de carbon
(aldehide, alcooli, acizi mono și bibazici);
4.Coloranți ceruri (ceruri polienice).
Derivați de izopren
Au fost izolate încă de mult, din cele mai variate materiale vegetale,
numeroase hidrocarburi izomere cu formula moleculară (C5H8)n .
Pentru:
n=2, C10H16 – terpeni;
n=3, C15H24 – sesquiterpeni;
n=4, C20H32 – diterpeni;
n=6, C30H48 – triterpeni;
n=8, C40H56 – tetraterpeni.

Se poate observa apartenența carotenoidelor la această mare clasă de


produși naturali cu schelet poliizoprenic. Examinarea structurală a
terpenilor arată că scheletul hidrocarbonat al acestor compuși este alcătuit
din unitați de izopren legate de obicei cap la coadă. S-a recunoscut astfel în
regula izoprenică un principiu general al biosintezei vegetale (L. Ruzicka,
1921). Regula izoprenică a devenit importantă în stabilirea structurii
terpenilor superiori și a derivaților lor.
ETAPE ÎN BIOSINTEZA CAROTENOIDELOR

• Pigmenții carotenoidici se formează din glucide


dar și din lipide și proteide, compuși capabili de a
fi catabolizați la acid acetic activat (schema pe
planșa următoare).

• În decursul catabolizării carotenoidelor rezultă o


serie de metaboliți: vitaminele A, retinoidele,
acidul trisporic, acidul abscisic și metaboliți cu un
număr de sub 20 atomi de carbon, care au rol de
fitohormoni.
BIOSINTEZA CAROTENOIDELOR
ȘI A ALTOR COMPUȘI CU STRUCTURĂ TERPENICĂ
CH3-Co S-CoA Scualen→Steroide
Acetilcoenzima A C15
Carotenoide
Izopentenil-pirofosfat (C5)

Geranil-pirofosfat Carotenoide
Terpenoide
Farnesil-pirofosfat(C15) C20 Tocoferoli
Filochinone
Geranil-geranilpirofosfat(C20)

Carotenoide incolore(C40)
CAROTENOIDE INCOLORE (C40)
(C30-C50) Metaboliți terpenoidici
Fernochinone
Ubichinone
Ubicromenoli Retinoli (C20) → Retinoide
Plastochinone (vitamina A)
Plastocromenoli
Izoprenoide polimere Apocarotinoide
(C20-C40)

Carotenoide superioare
CAROTENOIDE (C45-C50)
(C40)
1. Carotenoide cu 40 atomi de carbon
• În 1831 Wackenroder izolează colorantul din morcov pe care îl numește
caroten (carotină). Pana în 1933 au fost izolate carotine din foarte multe
plante, ele fiind permanent însoțitoarele clorofilei din frunzele și părțile
verzi ale plantelor, conținutul în carotine crescând treptat de la începutul
vegetației până la înflorire și scăzând până la căderea frunzelor.
• În afară de morcov de la care provine numele, carotinele se găsesc în cele
mai variate vegetale: tisă, lăcrămioară, măceș, răsură, trandafir, narcisă,
tomate, ardei, piersici, caise, portocale, mandarine, lămâi, grep, grâu,
porumb, alge brune, urzici etc. Carotinele sunt responsabile și de coloritul
anumitor păsări (flamingo, canar), insecte și chiar animale (creveți,
homari, somon).
• Cantitatea totală de carotenoide produse în natură a fost estimată la
108t/an, din care cea mai mare pondere o au: fucoxantina (alge marine),
luteina, violaxantina și neoxantina .
• Deasemenea carotenoidele liposolubile sunt insoțite de vitamine
hidrosolubile C, B1 si B2.
• Carotina extrasă constituie în cele mai multe cazuri un amestec de
izomeri C40H56. Separarea izomerilor, laborioasă, implică metode
cromatografice iar caracterizarea lor se face cel mai bine prin spectrele de
absorbție.
2,9
6,6%
β-Caroten
mg/100g
5,3

O
2 5,1

1,6
 - ionona 4,9

0,6  Cristalizează din benzen-metanol în prisme hexagonale de culoare


violet-închis, iar din eter de petrol în plăci rombice de culoare roșu- 3,5
închis.
0,5  Este conținută în toate părțile verzi ale plantelor, ca un însoțitor 2
permanent al clorofilei.
 Conține: - 11 duble legături (determinate prin hidrogenare
1,5
0,4 catalitică);
- 2 inele β–iononice marginale unite prin catena formată
de patru resturi izoprenice (determinare prin oxidare cu
KMnO4). Aceste inele β–iononice conferă caracterul de 1,5
0,2
provitamină A.
 Formula a fost confirmată prin sinteză pe mai multe căi.
0,5
0,1
0,4
0,2 0,5 5,9
• Fructul Gac de origine vietnameza și uleiul de palmier brut
au cel mai mare conținut de β-caroten din orice fruct sau
leguma cunoscute, chiar de 10 ori mai mare decât
morcovii, de exemplu. Cu toate acestea, fructul Gac este
destul de rar și necunoscut în afara regiunii sale native din
Asia de Sud-Est, iar uleiul de palmier brut este, de obicei,
procesat înainte de vânzare pentru a elimina cartenoidele,
cu scopul de a îmbunătăți astfel anumite proprietati ale
uleiului, precum culoarea și claritatea [6].
[6] A.N. Mustapa, Z.A. Manan , C.Y. Mohd Azizi , W.B. Setianto, A.K. Mohd Omar,
(2011). Extraction of b-carotenes from palm oil mesocarp using sub-critical R134a. Food
Chemistry, 125, 262-267
UTILIZĂRI
Uz medical
• Până în prezent, studiile nu au confirmat nici un beneficiu în prevenirea
cancerului de la suplimentele de beta-caroten, consumate în mod individual.
Cu toate acestea, introducerea de beta-caroten în dieta de zi cu zi, împreună
cu alți antioxidanți, inclusiv vitaminele C și E, a condus la creșterea protecției
împotriva unor tipuri de cancer. De exemplu, β-carotenul este folosit pentru a
ajuta la prevenirea cancerului de sân.
• În cazul fumătorilor sau consumatorilor de alcool, este recomandat ca acest
supliment să fie utilizat sub supravegherea unui medic, deoarece s-a observat
că suplimentele de beta-caroten pot creșe riscul de boli de inimă și cancer în
cazul celor care fumează sau beau foarte mult.
Efectele secundare ale uzului excesiv de beta-caroten includ:
- decolorarea pielii (îngălbenirea care în cele din urmă dispare);
- vânătăi;
- dureri articulare.

Uz alimentar
• agent de colorare pentru produsele alimentare, cum ar fi margarina, muștar
sau diferite băuturi răcoritoare. Ca și colorant alimentar, este înregistrat sub
numele de E160a
Uz alimentar
• Face parte din categoria "E-uri inofensive".

• Este permisă utilizarea în toate tipurile de produse alimentare, conform


cantităţilor prevăzute de reţete, cu excepţia celor destinate sugarilor şi
copiilor mici. Doza zilnică admisă pentru consumul uman este de până la 5
mg/kg corp.

• Nu se cunosc efecte secundare la concentraţiile folosite în alimente.

• Studiile au sugerat ca dozele mari de beta-caroten pot ajuta in scăderea


sensibilitatii la radiațiile solare.

• Concentraţii mai mari pot duce la o culoare galbenă a pielii. Deoarece


carotenul este o sursă de vitamina A, concentraţii mărite pot provoca
simptome ale toxicităţii vitaminei A (afectiuni ale pielii şi ficatului,
afectarea oaselor, dureri de cap etc.) [13].
Exemple de produse alimentare și
cosmetice care contin β-caroten
Sos de maioneza
(European Food )
Crema de zahar ars
(Danone – Danette)

• Muștar Clasic (Regal)

Cappy Pulpy
• Unguent de galbenele
(Hipocrate Cosmetics)
α – Carotina
O

 - ionona

• A fost descoperită la cromatografierea carotinei brute. Este aproape


tot atât de răspandită ca și β-carotina dar se găsește întotdeauna în
proporție mai mică decât aceasta (de la urme până la 25% față de β-
caroten).
• Conțne: - 11 duble legături ( în spectrul de absorbție banda
principală este deplasată spre lungimi de undă mai mici
deoarece nu toate dublele legături sunt conjugate);
- un inel β – iononic și un inel α – iononic marginal (ox.
KMnO4).
• Încălzită la 100-110oC cu etoxid de sodiu trece în β-caroten.
γ-Carotina

• A fost descoperită la cromatografierea carotinei


brute (1% față de β-carotină în morcov).
• Se găsește relativ rar în natură: în stigmatele
florilor de șofran, în părțile cărnoase ale fructelor
de cais.
• Are acțiune provitaminică.
Licopina E160d

• Se prezintă sub formă de cristale de culoare roșu-violet.


• Este colorantul din pătlagelele roșii. Se găsește în mai mult de 70 de specii
vegetale, mai ales în fructe (pepene, grapefruit, papaya) iar în speciile
animale în unt, ser sanguin și ficat omenesc.
• Culoarea închisă se datorează numarului mare de duble legături conjugate
(13).
• Molecula licopinei este alcătuita din două jumătăți identice, simetrice. Fiecare
jumătate este compusă din patru resturi izoprenice legate cap - coadă; la
jumatatea moleculei se inversează modul de legare.
• Licopina este un antioxidant care absorbit în corp ajută la prevenirea
îmbolnavirilor și la repararea celulelor bolnave. Are efectul cel mai protector
împotriva radicalilor liberi dintre toate carotenoidele.
• Se recomanda consumul a doua pahare de suc de roșii (40mg licopină) pe zi;
roșiile gătite sau prelucrate conțin mai multă licopină iar aceasta este
convertită termic într-o formă ce avantajeaza absorbția ei de către organism.
•Băuturi răcoritoare
Utilizări •Fructe de pădure congelate
•Înghețate, sosuri, gemuri
•Jeleuri
•Icre de pește
•Pește afumat
•Suplimente alimentare
•Supe instant
•Băuturi alcoolice
•Vin aromatizat
•Cereale

Dozele admise diferă :


Cârnați, pateuri, supe – 20mg/Kg
Băuturi – 100mg/Kg
Brânză topită, pastă de pește, crustacee – 100mg/Kg
Deserturi, produse lactate aromare – 150mg/Kg
 Fructe și legume confiate, produse fine de brutărie – 200mg/Kg
Muștar, produse de cofetărie – 300mg/Kg
Ornamente, sosuri, condimente, saramuri – 500mg/Kg
Efecte benefice
Efecte antitumorale – prostată, sân, vezică, pancreas, plămâni,
piele, cervical, ovarian, uterin, intestinal

Reduce semnificativ riscul arterosclerozei

Incidența infardului miocardic scade cu 20-50%

Boli cardiovasculare, degenerescența maculară, cataractă

Previne apariția osteoporozei

Scade colesterolul

Antioxidant de 10 ori mai puternic decât vitamina E,


de 2 ori mai puternic decât carotenul
2. Derivați oxigenați ai carotenoidelor
cu 40 de atomi de carbon

• Acești compuși se caracterizează prin prezența


grupelor: hidroxilice, carbonilice, hidroxi-
cetonice, carboxilice, epoxidice, furanoidice,
eterice.
a) Cu schelet de α – carotină
Luteina sau xantofila (3,3`- dihidroxi – α-carotina) E161b
OH

HO

• Formează cristale galbene prin transparență și violet metalic prin


reflexie.
• Numele de xantofilă a fost dat de Berzelius pigmentului galben din
frunzele îngălbenite. Ulterior s-a dovedit ca xantofila este derivatul
principal din frunzele galbene, cu structură identică cu luteina
conținută în gălbenușul de ou. Numele de xantofilă s-a menținut
pentru a indica grupa alcoolilor cu schelet carotenoidic.
• Luteina este una dintre cele mai răspândite carotenoide din natura
însoțind β-carotina și clorofila în toate plantele verzi.
Utilizări
•Unul dintre cei mai folosiți coloranți ca supliment
alimentar sau tratament farmaceutic

•Se găsește în cantități mari în varza de Bruxelles și în


spanac

•Luteina din – plante – sub formă esterificată


- ouă – sub formă liberă- se absoarbe mai ușor
de organism
DZA – 0-2mg/Kg corp

•Absoarbe razele UV și neutralizează radicalii liberi din


retină -reduce riscul degenerării Maculei (pata galbenă)
b) Cu schelet de β-carotină
• Criptoxantina (3-hidroxi- β-Carotina)

HO

• Zeaxantina (3,3`-dihidroxi- β-Carotina)


OH

HO
O

• Cantaxantina E161g
O

Colorant alimentar roșu-portocaliu


-mai aproape de roșu în medii protice
-mai aproape de galben în solvenți aprotici
Stabil la pH 2-7

A fost izolată din:


ciuperci comestibile (Cinnabarius Cantharellus-1950),
alge albastre-verzi.

Se găsește în: bacterii, crustacee, specii de pești (crap, somon, păstrăv).

DZA: 0,03mg/Kg corp-SINGURUL CAROTENOID PENTRU CARE S-A STABILIT


Sinteza cantaxantinei
a. Oxidarea (±) izo-zeaxantinei
b. Condensarea unei fosforilide cu o dialdehidă
OH

Ox.
OH clorat, bromat/CHCl3
O
a. H2SO4 diluat

O
b.
CH CH C CH CH PPh3 OHC C C C C C C CHO
H H H H
CH3 + CH3 CH3
2

O
Utilizări

• Colorant pentru medicamente


• Hrana animalelor – Dmax-80-20mg/Kg
pește (somon, păstrăv)
păsări - ouă (40%)
- piele (10%)
• Colorarea tenului (bronz artificial), vitiligo(și
pe cale orală)
Toxicitate

• anemie, greață, diaree, crampe abdominale,


mâncărimi, acnee
• Leziuni hepatice
• Retinopatie (formarea de depozite galbene pe
retină-FDA 2003)
• CE-directivă în 2003 –reducerea nivelului de
cantaxantină în hrana animelelor
-2007 –limita max. în gălbenuș-25-30μg/g
3.Carotenoide cu mai puțin de 40 de
atomi de carbon
3.1.Aldehide
• Au fost izolate aldehide carotenoidice din fructe de citrice, măceșe,
legume verzi, spanac etc.
• Unul din inelele iononice se păstrază la un capăt al lanțului iar
celălalt inel suferă un proces de oxidare urmat sau nu de scăderea
succesivă a numărului atomilor de carbon. La oprirea procesului
oxidativ, la un capăt al lanțului se află o grupare aldehidică ce intră
în conjugare cu lanțul polienic (efect batocrom) în timp ce
concomitent, scurtarea lanțului polienic provoacă un efect
hipsocrom.
β-Apo-8`-carotenalul
este o aldehidă provenită de la β-caroten, folosită drept colorant
alimentar (se obține și pe cale sintetică):

O
bixin-dialdehida
• Prin oxidarea licopinei cu dioxid de crom se obține bixin-
dialdehida (intermediar se formează monoaldehida –
licopinalul)

+ Cr2O3

O
+ OHC

Metilheptenona Licopinal + Cr2O3

CHO +
OHC O

Bixin-dialdehida
Metilheptenona
3.2. Alcooli
• Vitamina A (Retinol, Axeroftol)

CH2OH

Vitamina A a fost izolată din porțiunea nesaponificabilă a uleiului gras din


ficatul de pește, sub forma unui ulei gălbui, optic inactiv, foarte ușor
oxidabil, solubil în grăsimi. Compusul este relativ stabil la incălzire (se
descompune la peste 200oC). Cu SnCl2 dă o colorație albastru-intens.
• Vitamina A2

CH2OH

Dublele legături din inelul marginal participă la conjugare – efect batocrom.


Schema oxidării β-carotenului la coloranți alimentari

• În organismele furnizoare de astfel de compuși aceste


procese sunt catalizate enzimatic.

ox.

O
2
ox.

COOH
HOOC
3

COOH
HOOC
4
3.3.Acizi
• α -Crocetina (C20H24O4), acid dicarboxilic polienic, cu 4 grupe metil, se
găsește în crocină, un ester cu doua molecule de gentobioză, produs izolat
din stigmatele florilor de șofran (Crocus stativus).

COOH
HOOC

Se cunosc și β-crocetina – esterul monometilic al α-crocetinei și γ-


crocetina, esterul dimetilic al α-crocetinei. Toate crocetinele au fost
izolate din șofran.
• 1Kg de șofran uscat (pulbere aromată, galben-aurie) se obține din
aproximativ 200 000 de flori.
Șofranul este utilizat în industria alimentară drept colorant dar și pentru
aroma sa.
Crocus stativus

Vechimea lui datează de 3000 de ani î.Hr. când apar menționate deja valorile
terapeutice în papirusul egiptean al lui Eber, de asemenea este menționat în Biblie sau
în scrierile clasice încă din anul 1500 î.Hr

Șofranul conține mai mult de 150 compuși volatili, dar și componente nevolatile dintre
care multe sunt carotenoide, inclusiv zeaxantina, licopenul, α si β carotenul. Culoarea
galbenă a plantei este data de crocina si crocetina. Aroma provine de la compuși
oxidați carotenoidici (picrocrocina). În 1982 Pfander & Schurtenberger spun că
biogeneza culorii și aromei provin din bio oxidare.
Crocetina (componenta de culoare) este o carotenoidă ușor solubilă în apă, ceea
ce face ca șofranul să fie folosit cu ușurință în alimentație, medicină sau ca și
colorant natural. Pe lângă crocetină șofranul are în compoziție și pigmenți
antocianici. Picrocrocina este componenta de gust. Safranalul (componenta
parfumată) este un ulei volatil care dă șofranului aroma deosebită. Acest ulei este
eliberat când șofranul este supus acțiunii enzimatice.
Bixina
COOH
H3COOC

Bixina, esterul monometilic al norbixinei se


extrage din fructul roșu al arborelui tropical Bixa
Orellana și se foloseste drept colorant alimentar
sub denumirea de anatto.

Singurul colorant natural (orlean) care vopsește direct toate tipurile de fibre, în portocaliu.
METODE DE EXTRACȚIE,
SEPARARE, IDENTIFICARE ȘI
DOZARE A CAROTENOIDELOR DIN
PLANTE
Considerații generale
• Pigmenţii carotenoidici sunt sensibili la lumină, caldură,
oxigen, acizi şi baze alcaline. Din acest motiv, trebuie
respectate anumite condiţii, pentru păstrarea materialului
supus analizei.

• Prin expunerea la lumină, în mod deosebit la lumina


solară directă sau la lumina UV, se realizează
fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la
fotodistrugerea lor.

• De aceea, materialele biologice ce conţin carotenoide sau


soluţiile lor trebuie ferite de acţiunea luminii.
Considerații generale
• Multe carotenoide sunt termolabile, în special xantofilele,
încălzirea lor realizânduse doar în situația când este
absolut necesar acest lucru.

• Separarea carotenoidelor trebuie realizată la temperatura


camerei, pâna la 200C și la întuneric.

• În cazul saponificării la cald, soluțiile trebuie protejate prin


utilizarea solvenților cu puncte de fierbere nu foarte
ridicate (30-600C).
Considerații generale
• În prezența oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe
carotenoide pot fi oxidate, ele fiind foarte sensibile la
oxigen în stare adsorbită (în cromatograme, pe coloană
și pe strat subțire).

• Este necesar să se lucreze în stare inertă (în atmosferă


de azot sau vacuum).

• Oxidarea în timpul extracției și saponificării poate fi


minimă prin utilizarea unei atmosfere de azot.
Considerații generale
• Prin expunerea carotenoidelor sau a materialelor
biologice acțiunii acizilor, au loc o serie de
transformări, cum sunt:
 descompunerile oxidative;
 izomerizarea cis-trans;
 izomerizarea 5,6-epoxizilor la 5,8-epoxizi.

• Înlaturarea acestor inconveniente se realizează prin


neutralizarea cu CaCO3, piridină sau dimetilalanină.
Considerații generale

• Se lucrează cu solvenți purificați și proaspăt


distilați, indeosebi derivații clorurați, cum este
diclorometanul, care conține în mod frecvent
HCl.
Considerații generale

• Depozitarea pigmenților carotenoidici se


realizează la întuneric, sub atmosferă de azot sau
în vacuum, la o temperatura de 200C.
Cel mai bine se pastrează în stare cristalină.

• Păstrarea sub formă de soluție se realizează în


eter de petrol, hexan sau benzen.
Generalități privind metodele
generale de extracție
• Distribuția într-o mare varietate de materiale și lichide biologice a
compușilor biologic activi a făcut să nu se poată adopta o metodă
general-valabilă de extracție care să poată fi aplicabilă în mod
universal și adoptată ca o tehnică standardizată.

• Acest lucru se datorează structurii diferite a compușilor biologic


activi, chiar și cei din aceeași clasă deosebindu-se între ei prin
lungimea catenei, prin grupări funcționale specifice sau
configurație, solubilizării diferite în solvenți etc.

• Metoda de extracție se alege în funcție de natura materialului


vegetal, de ușurinta extracției cu solvenți, de cantitatea și
proprietățile compușilor supuși extracției (solubilitate,
termolabilitate) etc.
Generalități privind metodele
generale de extracție
• Extracția carotenoidelor din produsul vegetal se realizează
cu solvenți organici nepolari, de regulă eter etilic sau
cloroform, prin macerare, agitare mecanică sau prin
refluxare pe baia de apă, la fierbere.

• Se impune un grad de marunțire avansat, deoarece


solventul nepolar nu pătrunde prin membrana celulară
pentru a dizolva carotenoidele.

• Materialul vegetal supus extracției poate fi în stare


proaspată sau uscată.
Generalități privind metodele
generale de extracție
• Dacă materialul supus extracției se află în stare proaspătă,
acest lucru implică și existența apei în țesuturi, pentru
îndepartarea ei fiind necesară uscarea prealabila a
materialului vegetal prin extracția cu solvenți miscibili cu apa
(acetonă, metanol, etanol), materialul trebuind să fie suficient
de deshidratat pentru a se preta extracțiilor ulterioare cu
solvenți neapoşi.

• În cazul materialului uscat, extracția se realizează cu solvenți


nemiscibili cu apa.
• Soluția extractivă organica conține derivați carotenoidici
nativi, alături de numeroase substanțe balast, cum ar fi
clorofila.
Schema 1.
Schema generală de izolare a carotinoidelor

MATERIAL BIOLOGIC (CRUD) MATERIAL BIOLOGIC DESHIDRATAT

Extractie cu Extractie cu solventi


solventi miscibili miscibili sau nemiscibili
cu apa cu apa
EXTRACT PRIMAR

EXTRACT
eter de petrol sau eter etilic Spectrofotometrare

Repartitie
intre eter de Saponificare
petrol-etanol

Carotenoide Carotenoide Carotenoide cu Carotenoide cu


hipofazice epifazice caracter neutru caracter acid

Repartitie

Carotinoide Carotenoide
epifazice hipofazice

Cromatografiere

Recromatografiere

Cristalizare

CAROTINOIDA PURA Caracterizare structurala


Metoda I
• Materialul vegetal este mărunțit foarte fin și omogenizat cu
acetonă, timp de 1-2 minute, în atmosferă de azot.
• Omogenatul este filtrat, iar reziduul este supus extracției
ulterioare cu acetonă, până când omogenatul devine incolor.
• Extractele acetonice se reunesc și se concentrează la volum
mic prin evaporare la rotavapor.
• Peste extractul acetonic se adaugă un volum egal de eter
etilic proaspat distilat, omogenizând amestecul și spălându-l
apoi cu o soluție de NaCl (pentru ca eterul etilic să se
îndeparteze ușor și pentru a se evita emulsionarea
amestecului) până la îndepartarea completă a acetonei.
• Această metodă este foarte utilizată în cazul în care se
realizează extracții ale țesuturilor verzi ale plantelor, florilor
și fructelor.
Metoda II
• Această metodă este utilă în cazul în care se lucrează cu cantități mici de
substanță. Țesutul este marunțit și triturat cu Na2SO4 anhidru, până se obține o
pudră foarte fină, care este apoi supusă extracței cu acetonă, urmată de eter etilic.

• Extractul se centrifughează, precipitatul obținut extragându-se în continuare până


la incolor, soluțiile supernatante reunindu-se și concentrându-se, transferându-se
apoi într-un volum egal de eter etilic, ca și în cazul metodei I.

• Pentru ambele metode este necesară saponificarea, care permite îndepartarea


substanțelor balast, mai ales a clorofilei, și hidroliza esterilor xantofilei.
Saponificarea se realizeazăprin adăugarea de KOH 15% peste extract (1:10, v/v).
Această saponificare se poate realiza în doua moduri:
 încalzirea amestecului alcalin timp de 10-15 minute pe baie de apă în
atmosferă de azot, la întuneric;
 păstrarea la temperatura camerei sau la 5oC, la întuneric, timp de 10-15
ore.

• Este de preferat utilizarea metodei de saponificare prin răcire, datorită faptului că


unii pigmenți carotenoidici (cum sunt xantofilele) sunt labili termic, existând
posibilitatea degradării.
Extracția din alge
• În cazul extracției carotenoidelor din alge nu se mai aplică metoda generala
prezentata mai sus, datorită faptului că, pentru o extracție eficientă, este necesară
o disrupție mecanică sau un pretratament. De asemenea, extracția carotenoidelor
din alge se realizeazî cu solvenți mai polari decât acetona (etanol sau amestec
acetonă:etanol), datorită faptului ca au polaritate mare și permit efectuarea
saponificării pe extractul inițial.
• Pretratamentul poate consta in suspendarea algelor în apă distilată și răcirea timp
de 5-8 ore înaintea extracției propriu-zise, apoi extracția cu metanol. Un alt
pretratament consta in decolorarea preliminară cu vapori de apă sau tratarea cu
apă fierbinte, timp de 2-3 minute, apoi răcirea rapidă cu gheață. Acest ultim
procedeu înlesnește extracția carotenoidelor, dar are și un inconvenient, și anume
posibilitatea distrugerii enzimelor care acționează asupra carotenoidelor și
clorofilelor.
• Pentru o izolare eficientă a carotenoidelor din alge, acestea pot fi supuse uscării,
deși, prin acest procedeu, unii compuși pot suferi modificări, și pot exista diminuări
ale randamentelor de extracție.
• Un procedeu care implică uscarea prealabilă a algelor a fost utilizat la extracția
carotenoidelor din Fucus serratus, când algele sunt uscate timp de câteva zile,
măcinate, apoi pudra este amestecata cu apă (800 ml apă la 500 g pudră), după
care amestecul este eluat într-o coloană prin percolare cu amestec benzen:metanol
(1:10, v/v). Eluatele de culoare verde se îndepartează, iar zona brută se eluează cu
mult solvent, se concentrează și se cromatografiază pe coloană de CaCO3.
Separarea prin repartiția lichid-lichid
• Un sistem de repartiție - eter de petrol : metanol.
-se pot separa hidrocarburie carotenoidice de xantofile.
• Separarea este utilizată ca o fază preliminară cromatografiei pe coloană sau
în strat subțire. Separarea prin repartiție între două lichide poate fi o
alternativă a saponificării în vederea îndepărtării clorofilei din extractele ce
nu se pot saponifica prin adăugare de baze, datorita existenței
carotenoidelor sensibile la aceste substanțe. Acest procedeu implică
trecerea xantofilelor în hipofaza metanolică, clorofilele trecând în epifază. O
alta varianta este extracția, unei soluții metanolice a unui pigment, cu eter
de petrol, până când clorofilele sunt indepărtate. în ambele cazuri,
xantofilele din hipofază sunt trecute în eter etilic și apoi spălate cu apă.
 Acest procedeu este din ce in ce mai puțin utilizat datorită sensibilității
metodelor cromatografice, prin repartiție randamentul de separare fiind
destul de redus, carotenoidele, din cauza solubilitatii diferite, putându-se
găsi în ambele fracțiuni de repartiție. În cazul unei carotenoide ce posedă
solubilitate doar în unul din cei doi solvenți (glicozid sau acid), acest
procedeu se poate aplica, preferandu-se, totusi, metodele cromatografice.
Separarea prin metoda distribuției în
contracurent
• Constă în repartiție repetată între cei doi solvenți
metanol:eter de petrol, ajungându-se la metoda denumită
“distribuția în contracurent”.
Dupa un numar suficient de mare de repartiții, amestecul
original este separat în fracțiuni ( având fiecare o anumită
solubilitate):
- hidrocarburi carotenoidice;
- xantofile mono- și dihidroxilate etc.
Acest procedeu este urmat de o fracționare prin
cromatografie pe coloană, prin adsorbție diferită datorată
grupărilor specifice fiecărei grupe de carotenoide.
Acest procedeu este util in cazul separarii xantofilelor foarte
polare, care sunt puternic adsorbite.
Separea prin metode cromatografice

• Cromatografie în strat subțire (TLC)

• Cromatografie pe coloană
Cromatografia în strat subțire
• Cromatografia în strat subțire - o tehnică foarte utilizată în
separarea și purificarea carotenoidelor.

• Gradul de purificare prin această metodă este mult mai


mare, comparativ cu cromatografia pe coloană.

• În funcție de natura carotenoidului se vor alege faza


staționară, faza mobilă și sistemul de eluare.

• Precauții la aplicarea probei:


 aplicarea rapidă a probei;
 aplicarea probei la lumina slabă;
 developarea imediată a cromatogramei;
 developarea la întuneric a cromatogramei;
 utilizarea unei atmosfere de azot.
Alegerea fazei staționare

• Adsorbanți utilizați pentru cromatografia în strat subțire a


carotenoidelor:
1. Al2O3
2. Celuloza
3. CaCO3:MgO:Ca(OH)2 (30:6:5, m/m/m/)
4. Ca(OH)2
5. Ca(OH)2:silicagel (1:1, m/m)
6. Kieselguhr
7. Manitol
8. MgO
9. MgO:celită (1:2, m/m)
10. MgO:silicagel (1:1, m/m)
11. Silicagel
12. Zaharoza
13. ZnCO3
TLC-Alegerea solventului
• Solvenții utilizați în separarea carotenoidelor
prin cromatografie în strat subțire sunt eluanți
slabi, cum ar fi eter etilic, benzen, precum și
amestec de solvenți acetona-eter etilic, etanol-
eter etilic, acetat de etil-benzen etc. Solvenții
care dau o înaltă rezoluție, datorită proprietăților
lor, sunt alcoolii terțiari.
• Cloroformul este în general evitat datorită
urmelor de acid clorhidric pe care le conține și
care pot conduce la transformări ale
carotenoidelor.
• Acidul acetic este utilizat doar in cazul
carotenoidelor puternic adsorbite pe adsorbant.
Sistemele cele mai utilizate în
cromatografia în strat subțire
Faza staționară: Eluent:
silicagel eter de petrol (+5% eter etilic)
MgO benzen: eter de petrol (9:1)
ZnCO3 amestec hexan: alcool
Rezoluții foarte bune pentru xantofile
CaCO3, MgO și Ca(OH)2 Separarea:
hidrocarburilor carotenoidice,
xantofilelor
Identificarea prin TLC
Eluarea carotenoidelor din cromatoplăci

 În funcție de stratul adsorbant și de polaritatea


carotenoidelor:

1. Suport - silicagel G
Eluent - eter etilic sau eter etilic + 5-10% etanol
(carotenoide polare);
2. Suport - MgO
Eluent - acetonă
(hidrocarburi carotenoidice și xantofile).
Identificarea vizuală a carotenoidelor
• Datorită faptului ca acești pigmenți sunt colorați, se
poate realiza și identificarea vizuală a lor (până la 0,05
μg β-caroten).
• Carotenoidele - se decolorează rapid pe placa
cromatografică –necesară stropirea cromatoplăcii cu o
soluție de parafină în eter de petrol.
• Unele carotenoide carbonilice sau produșii de
descompunere oxidativă
 soluţie de rodamină 1% în acetonă
 stropirea cu o soluţie de SbCl3 în cloroform
• Cea mai sensibilă metodă
 identificarea cu vapori de iod (se formează spoturi de
culoare brună) prin această metodă identificându-se și
eventualele impurități. Compușii incolori pot fi detectați
prin vizualizarea fluorescenței verde caracteristică la
absorbție în ultraviolet.
Identificarea carotenoidelor prin metode
spectroscopice

Metodele spectroscopice utilizate frecvent în


identificarea carotenoidelor:
spectroscopia de absorbție în vizibil;
Spectroscopia în infraroșu;
spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară;
spectroscopia protonică;
spectroscopia de masă.
Identificarea prin spectroscopie în
vizibil
• Această metodă a fost prima utilizată în identificarea carotenoidelor și a
metaboliților lor. Caracterizarea cu precizie a cromoforului carotenoidic este
posibilă datorită corelației între structura electronică și absorbție, poziția
maximelor de absorbție fiind o funcție a numărului dublelor legaturi
conjugate din moleculă. Maximele de absorbție depind și de solventul
utilizat

• Carotenoidele prezintă trei maxime fundamentale în domeniul vizibil,


spectrul lor având o structură fină. Pentru determinarea structurii chimice
este foarte important de știut în ce măsură este influențat spectrul de
existența anumitor grupări existente în moleculă. Astfel, legaturile duble
C=C si C=O influențează foarte mult spectrele electronice, în acest fel
putându-se stabili o legatură între spectrele electronice și sistemele
cromofore. În cazul existenței legăturilor duble conjugate, lungimea de undă
maximă va crește, această creștere nefiind constantă. Prin comparația λmax a
unei carotenoide necunoscute cu valorile λmax a unei carotenoide cunoscute,
martor, se poate estima numărul de duble legaturi din cromofor.
Identificarea prin spectroscopie în IR

• Datorită faptului că spectrele de absorbtie în


infraroșu (IR) prezintă un numar mai mare de
benzi, și, deci, prezintă un material informativ mai
bogat, ele sunt avantajoase în determinarea
structurii.
• Cu ajutorul spectrelor IR se pot stabili atât
prezența și poziția diferitelor grupări funcționale
în moleculă, cât și natura sistemului polienic.
Pentru a nu apărea interferențe, carotenoidele
sunt tabletate în fază solidă în KBr sau solubilizate
în diverși solvenți (CCl4, CHCl3, CS2 etc.).
Identificarea prin spectroscopie RMN
 Cu ajutorul metodei rezonanței magnetice nucleare (RMN) s-a putut stabili
structura carotenoidelor.
 Solvenții cei mai utilizați: deuterocloroformul, cloroformul si tetraclorura
de carbon, utilizându-se ca martor intern tetrametilsilanul.
 Prin metoda RMN se pune în evidență prezența protonilor prin semnalele
care apar în spectru, mărimea acestor semnale depinzând de structura
carotenoidei, de aranjarea atomilor invecinați și de natura și numărul
protonilor ce se află într-o anumită grupare.
 Sursa de protoni o constituie grupările: CH3, -CH2-, -OH, -OCH3, - CHO etc.
 Se obțin spectre cu semnale de mărimi diferite, ceea ce permite punerea
lor în evidență.
 Intensitatea cea mai mare o vor avea semnalele date de grupările CH3,
deoarece sunt cele mai bogate în protoni, acest fapt conducând la
posibilitatea determinării atat a numărului și a tipurilor grupărilor -CH3,
precum și a protonilor proveniți de la alte grupări.
Identificarea prin spectrometrie de
masă
• Metoda constă în fragmentarea foarte precisă și
caracteristică a diferitelor tipuri de carotenoide,
în ioni moleculari.
• Toate carotenoidele dau un maxim de intensitate
mare care este situat la valoarea masei lor
moleculare, cauzat de ionul molecular M+ sau
[carotenoidă]+.
• Datorită faptului că acești pigmenți sunt instabili
și cu volatilitate redusă, pentru volatilizarea lor și
realizarea de ioni moleculari este necesară
încalzirea până la 300oC.
Metode chimice de elucidare a
structurii carotenoidelor
Carotenoidele dau reacții de culoare cu:
♦ triclorura de stibiu (reacția Carr-Price)-soluție
saturată în cloroform - colorație albastră care trece
repede în roșu-purpuriu;
♦ acidul sulfuric concentrat (reacția Winterstein) –
colorație albastră-verzuie sau verde-albastruie;
♦ acidul clorhidric concentrat - monoepoxizii și oxizii
furanoidici - o colorație verde-albăstruie.
Identificarea grupărilor funcționale
ale carotenoidelor
• Identificarea hidroxicarotenoidelor -acetilarea cu anhidridă acetică
in piridină, la rece.
 Reactia furnizeaza informatii privind natura gruparii OH (primara sau
secundara).
 Prin aceasta reactie se poate separa acetatul carotenoidei de alți
pigmenti din amestec, datorită diminuării polarității moleculei.
Spectrul RMN va furniza în continuare informații privind poziția
hidroxilului.
• Hidroxicarotenoidele cu hidroxil terțiar - formarea eterului
trimetisililat și deshidratare cu oxiclorura de fosfor.
• Hidroxicarotenoidele ce poseda HO- alilic secundar au o mare
reactivitate chimica:
 oxidare la cetocarotenoide cu Ag2O
 eliminare grupare OH prin tratare cu HCl cloroformic ( trec în
retrodehidrocarotenoide), aceste transformari se pun în evidență prin
citirea λmax.
Identificarea grupărilor funcționale
ale carotenoidelor
Identificarea cetocarotenoidelor și a carotenoidelor aldehidice

 Cetocarotenoidele
- reducere cu NaBH4 la hidroxicarotenoide - identificare prin
metode spectroscopice.
- condensare cu orto-fenilendiamină- sunt puse în evidență
grupările α-dicetonice prin formare de derivați fenazinici, colorați
specific (albastru). Monocetonele nu dau această reacție, ceea ce
demonstreaza specificitatea reactivului.

 Carotenoidele aldehidice -cu 2-fenil-1,3-indandion-1-hidrazona-


formează complecși stabili.
Această reacție are loc și cu cetocarotenoidele.

 Grupările carbonilice - clorhidrat de hidroxilamina în piridină –


oxime (crește polaritatea - deplasare hipsocromă a λmax.).
Identificarea grupărilor funcționale
ale carotenoidelor
Identificarea carotenoidelor cu grupari epoxidice

 tratarea cu HCl - 5,8-epoxicarotenoidele – colorație


albastră

 reacția cu clorura mercurică - complex colorat, ce


poate fi identificat prin spectre de absorbtie

 reacția cu TiCl4 în soluție benzenică -5,6 – și 5,8 -


epoxicarotenoide - complex de culoare albastru-
închis ( λmax cu absorbție puternic batocromă)
Metode de dozare a carotenoidelor
• Metoda spectrofotometrică
metoda generală pentru determinarea
cantitativă a carotenoidelor
Solvenți utilizați pentru dozare
carotenoide hidrocarburice
eter de petrol
hexan
xantofile
 solvenții polari.
PROCEDEE DE OBŢINERE A
CONCENTRATELOR
CAROTENOIDICE
Concentrat carotenoidic din tomate

• Sursa de materie primă este coaja de tomate,


reziduu de la prelucrarea tomatelor.
• Cojile de tomate se tratează cu soluţie
alcoolică 0,1N HCl ;
• extractul se filtrează, se concentrază
obţinându-se un concentrat carotenoidic.
Concentrat carotenoidic din
sparanghel

• Sursa de materie primă sunt fructele de


sparanghel.
• Acestea se tratează cu apă de var si se supun
extracţiei cu etanol sau acetonă.
• Se concentrează şi se obţine concentratul de
carotenoide.
Concentrat carotenoidic din fructe de
scoruş

• Fructele de scoruş se macină şi se storc.


• Faza solidă se spală cu apă de două ori, se usucă şi se
mărunţeşte fin.
• Coloranţii carotenoidici se extrag cu ulei vegetal timp de
12h.
• Concentratu uleios obţinut conţine un amestec de α-, β- şi
neo-β-carotinoide.
• Conform unui alt procedeu, fructele de scoruş se extrag cu
dicloro-difluorometan, timp de trei ore, apoi se separă, se
distilă solventul şi se adaugă ulei vegetal. Se obţine un
preparat cu un conţinut de carotenoide de 140-160 mg% .
Concentrat carotenoidic din nămol

• Sursa de materie primă este nămolul de apă


stătătoare.
• Acesta se supune extracţiei cu cloroform;
se filtrează, se neutralizează cu alcalii şi se
spală cu apă până la reacţie neutră.
• Produsul final conţine 0,98 – 1,01x10-3 %
carotenoide.
Concentrat carotenoidic « carotolin »

• Ca sursă de carotenoide se folosesc materiale


vegetale.
• Acestea se mărunţesc, se usucă apoi se extrag cu
clorură de metilen în raport gravimetric material
vegetal : solvent de 1,8 :1,0.
• La extract se adaugă ulei de floarea soarelui
rafinat în raport de 1 : (1,5 -1,75).
• După îndepărtarea clorurii de metilen (60-70oC)
preparatul se usucă în condiţii menajante.
Concentrat carotenoidic din crustacee

• Crustaceele sau reziduurile de la prelucrarea lor


se tratează cu acid acetic în raport de 1:1 – 1:2, la
temperatura de 30-50oC, timp de 30-40 min. Se
presează pentru separarea fazei solide de cea
lichidă.
• Faza solidă se tratează cu solvent organic, se
separă, se concentrează şi se răceşte la 0-3oC
pentru separarea sedimentului. Solventul se
distilă şi colorantul carotenoidic se usucă în
absenţa aerului.
Concentrat carotenoidic din morcov

• Procedeul constă în amestecarea sucului de morcov cu


pectină în raport de 1:(0,26-0,4) în decurs de 30-40 min.
Produsul final se decantează sau se supune uscării prin
pulverizare.
Se obţine un colorant carotenoidic rezistent la păstrare.

• Conform unui alt procedeu, morcovul:


se spală, se mărunţeşte, se stoarce.
Sucul se încălzeşte la 82-97oC, timp de 55-70 min.
Carotenoidele coagulează, conţinutul lor în coagulant fiind
de 11,9%.
Extracția carotenoidelor

• Surse bogate în esteri de carotenoide sunt petalele de crăiţe


(Tagetes erecta), cătina albă (Hippophae rhamnoides), păpălau
(Physalis alkekengi), fructele de Capsicum anuum
• Carotenoidele totale au fost extrase din 10 g of Physalis alkekengi
(caliciu uscat), 20 g fructe de Hippophae rhamnoides si 20 g Tagetes
erecta, petale uscate.
• Carotenoidele totale au fost extrase din 10 g Physalis alkekengi
(caliciu uscat) cu un amestec de metanol/acetat de etil/eter de
petrol, cu adaos de BHT ca şi antioxidant. Aceeaşi procedură a fost
aplicată şi pentru extracţia şi dozarea carotenoidelor totale din 20 g
de fructe de Hippophae rhamnoides ca şi complex caroteno-
lipoproteic.
Extracția licopenului

Apă/55oC/pH=7,5-9
Enzimatică:
celulază
pectinază
Precipitare/pH=4,8

Creștere /celulază-429μg/g
Optimizarea parametrilor: Creștere /pectinază-1104μg/g
•Concentrația
•Timpul de incubare
Creștere /celulază-
132μg/g
Creștere/pectinază-
108μg/g
ESTERI CAROTENOIDICI
• Studii recente au arătat că în țesuturile vegetale carotenoidele
sunt preponderant esterificate iar formele libere au o stabilitate
relativ redusă în raport cu formele esterificate.
• Hidroxicarotenoidele, cunoscute și sub numele de xantofile, apar
în plantele superioare atât în forme libere cât mai ales în forme
esterificate. Uzual, grupările hidroxil sunt acilate cu acizi grași
saturați, cum ar fi: lauric (C12), miristic (C14), palmitic (C16) și stearic
(C18).
• Datele de literatură sunt foarte puțin legate de esteri de
carotenol deoarece extractele carotenoidice sunt, în general,
saponificate înaintea procedurilor analitice de separare. Hidroliza
alcalină a extractelor carotenoidice duce la ruperea legăturilor
esterice dintre xantofile și acizi grași și eliberarea xantofilelor
libere. În acelașii timp, în timpul saponificării poate apărea
fenomenul de degradare și oxidare al acestora.
PIAȚA CAROTENOID LA NIVEL MONDIAL este estimat la 786 milioane $ , din care cererile de produse
alimentare reprezinta 209 milioane $ , cererile de furaje 462 milioane $ și aplicații farmaceutice
pentru 115 milioane $ .
Cele mai importante tipuri de carotenoide sunt astaxantina (cu 28 % din totalul vânzărilor), și b -
caroten , cu o cotă similară . Cea de a treia cea mai mare carotenoidă este canthaxantina (cu 19 % din
totalul vânzărilor). Toate celelalte carotenoide au volumele de vânzări în intervalul de 10 milioane $ la
80 de milioane $ .
Piața globală a carotenoidelor ar trebui să crească la peste 900 milioane $ în 2005.

DEVELOPMENT OF GLOBAL MARKET VALUES OF CAROTENOIDS BY APPLICATION SEGMENT, 2005


($ Millions)