Los virus son parásitos intracelulares obligados y por tanto requieren células

vivas para su multiplicación hasta mediados del siglo pasado los animales y
huevos embrionados eran los sistemas mas comúnmente utilizados para
asilarlos.
Desde 1950 se empezaron a utilizar cultivos celulares a partir de una variedad
de tejidos humanos y de animales este método ha sido reemplazado.
Aunque el aislamiento viral es el estándar de oro para la el diagnostico de la
mayoría de las infecciones virales, en la practica rutinaria solo se utilizan en
laboratorios de referencia por razones de costo, tiempo de respuesta, riesgo
bilógico y sobre todo, por la necesidad de personal especialmente entrenado en
estas estas técnicas.
De igual forma el aislamiento del virus tiene una sensibilidad y especificidad
muy alta. Debido a que solo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin
disminuir la especificidad.
Sin embargo, existen algunas desventajas en el
aislamiento del virus:
El proceso suele ser lento, ya que demanda días a
semana la identificación , y en consecuencia puede no
estar disponible a tiempo para la atención del paciente.
Además es un proceso laborioso y caro.
El aislamiento viral se clasifica en cultivo in vivo y cultivo
in vitro.
Dentro de los cultivos in vitro tenemos a los cultivos celulares
y dentro del cultivo in vivo están los cultivos en animales de
experimentación y los huevos embrionados.
Aislamiento en animales de experimentación: los ratones
lactantantes fueron muy usados para el aislamiento viral, pero
su uso tiende a disminuir ante el desarrollo de los cultivos
celulares; sin embargo, se siguen usando para algunos virus
como para el grupo Coxsackie A que no crecen en otros
medios. Otros virus solo crecen en ciertos especies de
animales como simios o en mosquitos; estos procedimiento se
utilizan con fines de investigativos.
Asilamiento en huevos embrionados los virus pueden
inocularse en diferentes estructuras de huevo embrionado
de pollo o de pato. La replicación viral puede evidenciarse
por la muerte del embrión o mediante la detección.
Este sistema tiene la ventaja de ser bacteriológicamente
estéril, carecer de respuesta inmune y ser de fácil
manipulación.
Este presenta ventaja para las cepas de influenza A, que
pueden aislarse mas fácilmente en este sistema que en los
cultivos celulares.
 Cultivos celulares
 Monocapa celular
 Líneas celulares diploides
 Líneas celulares continuas
 Hemadsorcion
 Hemaglutinación viral
 CULTIVOS CELULARES

es una técnica que

Los cultivos celulares
permite el
son los biosusbtratos
mantenimiento de las
empleados para la
células
propagación de los
In vitro manteniendo al
virus. Un cultivo celular
máximos su
es obtenido de
propiedades
explantes de órganos o
fisiológicas,
de embriones de
bioquímicas y
animales.
genéticas.
TIPOS DE SUSTRATOS
VIDRIO

Empleado como sustrato

de cultivo es de escaso
costo y tiene mucha
facilidad de limpieza y
esterilización.
TIPOS DE SUSTRATO
PLASTICO
El plástico mas
empleado es el poli
estireno de buena
calidad óptica debido a
que este plástico es
hidrofobico requiere un
tratamiento mediante
irradiación gamma,
químico, o mediante
descargas eléctricas que
produzca una superficie
hidrofilica.
CRECIMIENTOS
CRECIMIENTO EN CRECIMIENTO EN
MONOCAPA SUSPENSIÓN

Las células se adhieren Son células capaces de

al sustratos y en esa proliferar sin
forma inician la necesidad de adherirse
proliferación. al sustrato.
 Esta monocapa de células crece en un medio de cultivo
complejo que contiene albúmina, vitaminas ,sales,
glucosa ,etc. en un sistema buffer .Se previene la
contaminación bacteriana adicionándole a los medios
antibióticos adecuados .
 Los cultivos celulares en monocapa son los mas usados
,aunque hay otros sistemas (cultivo en
suspensión,explantes ,cultivo de organos,cultivo en
microcarriers,etc.)
 CULTIVO PRIMARIO: El cultivo iniciado a partir de
células, tejidos u órganos tomados directamente de un
organismo. Un cultivo primario debe ser considerado
como tal hasta que se subcultive con éxito por primera
vez. En ese momento se considera una línea celular.
El estar más cercanas a las células que las originaron, se
ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad
similar a su ambiente natural, presentando las
características siguientes:
 ☼ Mayor sensibilidad que una línea celular ya
establecida.
 ☼ Baja probabilidad de que las células se transformen
en malignas, por lo que esta técnica es indispensable
en la elaboración de vacunas.
 ☼ Alta probabilidad de presentar virus adventicios o
latentes.
 ☼ Necesidad de implementar una tecnología de punta
para controles de calidad.
Son aquellas que crecen en pasajes
sucesivos hasta aproximadamente
50 subcultivos y que conservan por
lo menos en un 75% el cariotipo
correspondiente a la especie de
que provienen.
 Una línea celular se
origina a partir de un
cultivo primario en el
momento del primer
subcultivo exitoso. El
término línea celular
implica que los cultivos
de la misma consisten
en numerosos linajes de
células presentes
originalmente en el
cultivo primario.
LÍNEAS CELULARES CONTINUA
 Tiene alta capacidad para
multiplicarse in vitro, permite un
número finito de subcultivo por lo
menos 70 veces de un cultivo
primario y son heteropoide.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE
LÍNEAS CELULARES CONTINUAS
 Ventajas
1. Disponibilidad para
todos los
investigadores de
stocks de células
idénticas
2. Facilidad relativa del
pasaje y
mantenimiento en
todos los laboratorios
3. Libre de contaminación
con agente extraños
LOS CULTIVOS CELULARES
 Varían de acuerdo con su susceptibilidad a los diferentes virus
con una relación especifica huésped-virus
 Ejemplos:
1. Línea celular HDP2(células heteroploides humanas derivadas
del carcinomas laríngeo se recomiendan para VRS virus
respiratorio sincicial y Adenovirus
2. La MRC5 es una línea diploide fibroblastica del pulmón
embrionario se utiliza para aislamiento de citomegalovirus
3. La MDCK es una línea celular diploide de riñón canino se
recomienda para el aislamiento del virus influenza
 Incubación 37°C
 Tiempo hasta 14 días
 observación microscópico a 24,48 ,72 horas y luego dos vece
por semana
 Efectos cito paticos es la visualización
morfológicas producidas por la acción del virus
VRS
HPS-2
Adenovirus
 No producen efecto cito patico se recurre a
técnicas.
Hemadsorcion
Hemaglutinación
Tinción en anticuerpo monoclonales
 HEMOADSORCIÓN
La técnica de hemoadsorción se basa en la capacidad de
los glóbulos rojos de determinada especie animal de
unirse a proteínas virales que tienen capacidad
hemoaglutinante.
Si se dispensa glóbulos rojos a una monocapa de cultivo
celular infectada con virus es posible observar
microscópicamente la adherencia de los mismos a
células que contienen virus.
Por medio de esta técnica, es posible demostrar la
infección por aquellos virus que presentan proteínas
hemoaglutinantes.
CELULAS INFECTADAS CON UN  CELULAS NO
VIRUS HEMOAGLUTINANTE INFECTADAS

Muchos glóbulos rojos se agrupan Los glóbulos rojos se

alrededor de las células y pueden encuentran dispersos en toda la
llegar a cubrirlas. El resto de los monocapa celular forma
globulos rojos estan dispersos. aleatoria .
 HEMOAGLUTINACIÓN VIRAL
DEFINICIÓN
 Este fenómeno fue descrito por primera vez por Hirst en 1941,
quien observo en un embrión de pollo la aglutinación de
glóbulos rojos en un vaso sanguíneo roto, mientras realizaba
pases de virus de influenza en el líquido alantoideo.Hirst
reconoció la importancia de este hallazgo y describió la
hemoaglutinación como un método para ensayo de virus.
 Hemoaglutinación es la propiedad que tienen ciertos virus
para unir y aglutinar eritrocitos de mamíferos y aves, debido a
las proteínas que poseen en su capa externa Esta
hemoaglutinación inducida por virus puede usarse para
facilitar la identificación de un virus desconocido.
 La hemoaglutinación es uno de los métodos más comunes
para cuantificar partículas virales en suspensión.
 Un virus hemaglutinante es capaz de aglutinar glóbulos
rojos (GR) de determinada especie animal. Ej: Virus
Influenza. Virus Dengue, Virus Parainfluenza, Virus de la
Rubeola, etc.

REACCIONES DE HEMAGLUTINACIÓN

Base: unión Ag-Ac

(enlaces no-covalentes).
Etapas:
- Interacción primaria (no visualizable)
- Interacción secundaria (aparición de un fenómeno visible
como la aglutinación o la precipitación).
 MECANISMO DE LA HEMOAGLUTINACIÓN
 La actividad enzimàtica de las proteínas virales
(hemaglutininas) produce hemaglutinaciòn en la cual los
eritrocitos se unen por medio de puentes.
 Muchos virus contienen proteínas en su capa externa que
los capacitan para aglutinar glóbulos rojos de varias
especies. En influenza y algunos paramixovirus, la
hemaglutinación de la superficie, que es una glucoproteína,
se fija al glóbulo rojo que posee receptores
complementarios.
 El virus produce elusión sobre el glóbulo rojo a 37° C
debido a la destrucción del ácido neuramínico en sus
receptores por la neurominidasa del virión, El virus eluido
puede aglutinar un glóbulo rojo fresco, pero éste, una vez
eluido ya no puede ser aglutinado por la misma especie de
virus, debido a la pérdida de sus receptores.
Inhibición de la Hemaglutinación (IHA)

 La IHA se fundamenta en el bloqueo de la proteínas virales

hemoaglutinantes por los anticuerpos específicos. Cuando
se enfrenta un virus conocido a un suero problema, éstos
se unen impidiendo la hemoaglutinación viral.
(provocando la IHA).

 Esta técnica es utilizada para tipificar (identificar) virus con

capacidad hemoaglutinante presentes en una muestra dada
(virus influenza, parainfluenza, etc).