DIAGNOSTIC ÎN INFECȚIA HIV

Diagnostic în infecția HIV

• Tipuri de teste diagnostice

• Teste de diagnostic inițiale și de confirmare
• Sensibilitatea și specificitatea testelor de diagnostic
• Algoritm de diagnostic în laborator
• Algoritm de diagnostic rapid
• Diagnosticul infecției acute cu HIV
 Diagnostic în infecția HIV

• Tipuri de teste diagnostice

• Teste de diagnostic inițiale și de confirmare
• Sensibilitatea și specificitatea testelor de diagnostic
• Algoritm de diagnostic în laborator
• Algoritm de diagnostic rapid
• Diagnosticul infecției acute cu HIV
 Tipuri de teste diagnostice

Anticorpi anti HIV ARN HIV-1 Antigen HIV p24

Testul cel mai utilizat pentru Utilizat pentru infecția HIV acută și Utilizat foarte rar
infecția „veche” în situatia unui test de confirmare
În viitor: test ELISA de generația a-IV-a
(WB) indeterminat
 Diagnostic în infecția HIV

• Tipuri de teste diagnostice

• Teste de diagnostic inițiale și de confirmare
• Sensibilitatea și specificitatea testelor de diagnostic
• Algoritm de diagnostic în laborator
• Algoritm de diagnostic rapid
• Diagnosticul infecției acute cu HIV
Teste de diagnostic inițiale și de confirmare

• Teste inițiale (de TRIAJ/ SCREENING)

- ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
- chemiluminescență (CIA)

• Teste rapide - screening

• Teste de confirmare
- Western blot
- imunofluorescență indirectă
- detecție calitativă/cantitativă de ARN viral
 Generații de teste ELISA

Prima A doua A treia A patra

Utilizează întreaga Utilizează antigene sau Detectează anticorpi de tip Detectează anticorpii anti
particulă virală peptide recombinante IgM și IgG printr-o ELISA HIV și antigenul p24
HIV de tip sandwich
ELISA de detectie a anticorpilor antivirali
TEHNICA INDIRECTA
ELISA INDIRECTĂ HIV- metodă „tradițională”

Plăcuță cu 96 de godeuri Interpretarea testului

• Detectează ANTICORPI din serul pacientului
• Se bazează pe schimbarea de culoare sau IF
• Modificarea de culoare este comparată cu o
valoare „cut-off”
• Rezultate pozitive și negative
• Nu sunt furnizate informatii cantitative sau
referitoare la specificitatea anticorpilor
• Pot fi testate mai multe probe în acelasi timp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Test de confirmare WESTERN BLOT

p = proteină

gp = glicoproteină

Numărul = greutatea
moleculară (kDa)
 Componentele testului WB
HIV Western blot Strip

substrat enzimatic (culoare)

Y Y Y enzimă
ac anti ac uman de tip IgG

YY YY YY Anticorpi anti HIV

(serul pacientului)

Antigene HIV
(pe WB)
 Tehnica WB
1. SDS-PAGE
2. BLOT (transfer)
3. Detecția anticorpilor din serul pacientului
 Exemplu de WB pentru HIV-1

substrat enzimatic
Y enzimă
Y ac anti ac uman IgG
YY YY anticorpi anti gp120
antigen gp 120

substrat enzimatic
Y Y enzimă
YY ac anti ac uman IgG
YY anticorpi anti p24
antigen p24

Test efectuat Benzi vizibile: gp120 & p24

Tipuri de gene/proteine HIV-1 și HIV-2 & Western Blot
 Criterii de interpretare Western Blot

Control pozitiv

Sursa: CDC. MMWR. 1989:38(S-7):1-7.

 Criterii de interpretare Western Blot

Negativ

Nici o bandă:

Sursa: CDC. MMWR. 1989:38(S-7):1-7.

 Criterii de interpretare Western Blot

Pozitiv

Cel puțin 2 env (gp) + 1 gag (p)

Sursa: CDC. MMWR. 1989:38(S-7):1-7.

 Criterii de interpretare Western Blot

Indeterminat Examples

Una sau mai multe benzi prezente

Nu se întrunesc criteriile de pozitivitate

Sursa: CDC. MMWR. 1989:38(S-7):1-7.

 Diagnostic în infecția HIV

• Tipuri de teste diagnostice

• Teste de diagnostic inițiale și de confirmare
• Sensibilitatea și specificitatea testelor de diagnostic
• Algoritm de diagnostic în laborator
• Algoritm de diagnostic rapid
• Diagnosticul infecției acute cu HIV
 Test anticorpi anti HIV: Sensibilitate

Sensibilitate
Probabilitatea ca un test să fie pozitiv dacă persoana este infectată.
 Test anticorpi anti HIV: Sensibilitate
Persoane infectate HIV: n = 50

Exemplu
 Test anticorpi anti HIV: Sensibilitate
Persoane infectate HIV: n = 50 Testare ac anti HIV: 49/50 Pozitiv

Exemplu
 Test anticorpi anti HIV: Sensibilitate
Persoane infectate HIV: n = 50 Testare ac anti HIV: 49/50 Pozitiv

Sensibilitate = 49/50 = 98%

Exemplu
Sensibilitatea testelor pentru anticorpi anti HIV

Test de detecție a anticorpilor antiHIV

Sensibilitate >> 99%
 Test anticorpi anti HIV : Fals Negativ
Persoane infectate HIV Test pentru ac anti HIV

Exemplu
Test anticorpi anti HIV : Fals Negativ
Persoane infectate Test pentru ac anti HIV

Fals Negativ

Exemplu
Cauze pentru rezultate fals negative

• Infecție HIV acută

• Infecție HIV avansată
• Terapie antiretrovirală
 Test anticorpi anti HIV : Specificitate

Specificitatea
Probabibilatea ca un test să fie negativ dacă pacientul NU este infectat.
 Test anticorpi anti HIV : Specificitate
Persoane neinfectate HIV: n = 50

Exemplu
 Test anticorpi anti HIV : Specificitate
Persoane neinfectate HIV: n = 50 Testare ac anti HIV: 48/50 Negativ

Exemplu
 Test anticorpi anti HIV : Specificitate
Persoane neinfectate HIV: n = 50 Testare pentru ac anti HIV: 48/50 Negativ

Specificitate = 48/50 = 96%

Exemplu
Test pentru anticorpi anti HIV: Fals Pozitiv
Persoane neinfectate HIV Test pentru ac anti HIV

Exemplu
Test pentru anticorpi anti HIV: Fals Pozitiv
Persoane neinfectate HIV Test pentru ac anti HIV

Fals Pozitiv

Exemplu
Specificitatea testelor utilizate pentru detecția anticorpilor anti HIV

Teste inițiale pentru detecția anticorpilor anti HIV (ELISA)

Specificitate > 98%

Teste de confirmare (WB)

(când testele inițiale sunt pozitive)
Specificitate >> 99%
 Test anticorpi anti HIV : Specificitate

Infecție adevărată

Rezultat fals pozitiv

Rezultate fals pozitive: proporția rezultatelor fals pozitive este mai

frecventă în rândul populației cu risc scăzut de infecție HIV.
Cauze pentru rezultate fals pozitive

• alte infecții virale

• afecțiuni hematologice
• afecțiuni hepatice
• vaccinări
• boli autoimune
 Diagnostic în infecția HIV

• Tipuri de teste diagnostice

• Teste de diagnostic inițiale și de confirmare
• Sensibilitatea și specificitatea testelor de diagnostic
• Algoritm de diagnostic în laborator
• Algoritm de diagnostic rapid
• Diagnosticul infecției acute cu HIV
Reguli generale pentru testarea HIV

Inițial Test de confirmare

Optimizat pentru Optimizat pentru

sensibilitate specificitate
 Algoritm de testare -1989 CDC/ASTPHLD HIV

Inițial Test de confirmare

Western blot
ELISA sau
IFA

Pozitiv în dublu

Sursa: CDC. MMWR. 1989;38(S-7):1-7.

 Algoritm modern pentru testarea HIV

Initial

Teste rapide

Teste de laborator
(clasice=ELISA+WB)

Diagnosticul
HIV acută

Sursa: CDC. MMWR. 2001;50(RR19):1-58.

 Testare clasică

Inițial

HIV-1/HIV-2
ELISA

NEGATIV

HIV Negativ
 Testare clasică

Inițial

HIV-1/HIV-2 Se repetă testul

ELISA (duplicat)

POZITIV
 Testare clasică

Inițial

HIV-1/HIV-2 Se repetă testul

ELISA (duplicat)

Pozitiv NEGATIV

HIV Negativ
 Testare clasică

Initial Test de confirmare

HIV-1 Western blot

sau
HIV-1/HIV-2 Se repetă testul
Immunoassay* HIV-1 IFA
(duplicat)
sau
HIV-1 RNA
Reactive Pozitiv
Negativ

HIV Negativ
 Testare clasică

Inițial Testați pentru HIV-2 în următoarele condiții:

Supplemental

• prevalență HIV-2 locală HIV-1 Western blot

• calătorii sau factori de risc or
HIV-1/HIV-2 Repeat Testing
ELISA HIV-1 IFA
(in duplicate)
• suspiciune indicată de forma clinică or
HIV-1 RNA
Pozitiv Repeatedly
Reactive Negative

HIV Negativ
 Testare clasică

Inițial Test de confirmare

HIV-1 Western blot

sau
HIV-1/HIV-2 Se repetă testul
ELISA HIV-1 IFA
(duplicat)
sau
HIV-1 RNA
Pozitiv Pozitiv
Pozitiv

HIV Infected
 Testare clasică

Inițial Test de confirmare

HIV-1/HIV-2 Se repetă testul

ELISA
HIV-1 Western blot
(duplicat)

Reactiv Pozitiv Indeterminat

Interpretarea WB indeterminat

HIV-1 Western blot

Indeterminat
Interpretarea WB indeterminat

HIV-1 Western blot

Indeterminat

Se repetă HIV-1 Western

blot după 2-4 săptămâni
sau
Identificare ARN HIV
 Interpretarea modernă WB

HIV-1 Western blot

Indeterminat

Se repetă HIV-1 Western

blot după 2-4 săptămâni
+ sau -
Identificare ARN HIV

HIV Pozitiv Indeterminat

(fără expunere recentă) HIV Negativ

Sursa: CDC. MMWR. 2001;50(RR19):1-58.

 Interpretarea modernă WB

HIV-1 Western blot

Indeterminat

Se repetă HIV-1 Western

blot după 2-4 săptămâni
+ sau -
Identificare ARN HIV

HIV Pozitiv Indeterminat

(fără expunere recentă) HIV Negativ
 Interpretarea modernă WB

HIV-1 Western blot

Indeterminat

Se repetă HIV-1 Western

blot după 2-4 săptămâni
+ sau -
Identificare ARN HIV

HIV POZITIV Indeterminat

(EXPUNERE RECENTA) HIV Negativ
Investigații suplimentare
 Interpretarea modernă WB

HIV-1 Western blot

Indeterminat

Se repetă HIV-1 Western

blot după 2-4 săptămâni
+ sau -
Identificare ARN HIV

HIV Pozitiv Indeterminat

(fară expunere recentă) HIV Negativ
 Diagnostic în infecția HIV

• Tipuri de teste diagnostice

• Teste de diagnostic inițiale și de confirmare
• Sensibilitatea și specificitatea testelor de diagnostic
• Algoritm de diagnostic în laborator
• Algoritm de diagnostic rapid
• Diagnosticul infecției acute cu HIV
 Teste de diagnostic rapid
Uni-Gold Recombigen Multispot HIV-1/HIV-2 Clearview Complete HIV 1/2

Reveal G3 Oraquick Advance HIV-1/2 Clearview HIV 1/2 Stat Pak

 Point of Contact (Rapid) HIV Tests
FDA-Approved Tests in US, August 2009

Point of Contact (Rapid) HIV Test FDA Approval Manufacturer

OraQuick ADVANCE Rapid HIV-1/2 Antibody Test 2002 OraSure Technologies

Uni-Gold Recombigen HIV 2003 Trinity Biotech

Reveal G-3 Rapid HIV-1 Antibody Test 2003 MedMira, Inc.

Multispot HIV-1/HIV-2 Rapid Test 2004 BioRad Laboratories

Clearview HIV 1/2 STAT-PAK 2006 Inverness Medical

Clearview COMPLETE HIV 1/2 2006 Inverness Medical

 Interpretarea testelor rapide de diagnostic HIV

Test rapid

Negativ

Sursa: CDC. MMWR. 2004;53(10):221-2.

 Interpretarea testelor rapide de diagnostic HIV

Test rapid

Negativ

HIV Negativ
Pacientul este considerat neinfectat cu excepția situației în care există o expunere
recentă la virus.

Sursa: CDC. MMWR. 2004;53(10):221-2.

 Interpretarea testelor rapide de diagnostic HIV

Test rapid

Pozitiv

Sunt necesare teste de confirmare. Informați-vă pacienții că infecția nu este confirmată

încă!

Sursa: CDC. MMWR. 2004;53(10):221-2.

 Interpretarea testelor rapide de diagnostic HIV

Test de confirmare

HIV-1 Western blot

sau
Test rapid HIV-1 IFA
sau
HIV-1 RNA
Pozitiv

Sursa: CDC. MMWR. 2004;53(10):221-2.

 Interpretarea testelor rapide de diagnostic HIV

Opțional Test de confirmare

HIV-1 Western blot

sau
Test rapid ELISA HIV-1 IFA
sau
HIV-1 RNA
Pozitiv

Sursa: CDC. MMWR. 2004;53(10):221-2.

 Interpretarea testelor rapide de diagnostic HIV

Inițial Opțional Test de confirmare

HIV-1 Western blot

sau
Test rapid ELISA HIV-1 IFA
sau
HIV-1 RNA
Pozitiv
Pozitiv

Infecție HIV

Sursa: CDC. MMWR. 2004;53(10):221-2.

 Interpretarea testelor rapide de diagnostic HIV

Test de confirmare

HIV-1 Western blot

sau
Test rapid HIV-1 IFA
sau
HIV-1 RNA
Pozitiv
Negativ
sau
Indeterminat

Sursa: CDC. MMWR. 2004;53(10):221-2.

 Interpretarea testelor rapide de diagnostic HIV

Se repetă testul de
Test de confirmare
confirmare

HIV-1 Western blot 4 HIV-1 Western blot

sau săptămâni sau
Test rapid HIV-1 IFA HIV-1 IFA
sau sau
HIV-1 RNA HIV-1 RNA
Pozitiv
Negativ
sau
Indeterminat

Source: CDC. MMWR. 2004;53(10):221-2.

 Diagnostic în infecția HIV

• Tipuri de teste diagnostice

• Teste de diagnostic inițiale și de confirmare
• Sensibilitatea și specificitatea testelor de diagnostic
• Algoritm de diagnostic în laborator
• Algoritm de diagnostic rapid
• Diagnosticul infecției acute cu HIV
 Diagnosticul infecției acute cu HIV

HIV RNA

Infection

Nivelul ARN viral crește abrupt la câteva săptămâni de la momentul infectării.

Diagnosticul infecției acute cu HIV

HIV RNA Antibody Titer

Detectable Antibody

Infection

“Spike”-urile de ARN HIV preced apariția anticorpilor specifici anti HIV.

Diagnosticul infecției acute cu HIV

HIV RNA

Infection

Perioada de eclipsă = perioada dintre momentul infectării și apariția în circulație a ARN viral
 Diagnosticul infecției acute cu HIV

Window Period

Antibody Titer

Detectable Antibody

Infection

Fereasta serologică = perioada dintre momentul infectării și momentul apariției în circulație a anticorpilor
anti HIV.
Teste de screening indicate în funcție de distanța față
de momentul infecției

ELISA
HIV EIA*
Gen 3
Gen 2
Gen 1

ARN HIV detectabil

ELISA

Western blot

Săptămâni după infecție

Diagnosticul infecției acute cu HIV

Acute HIV

HIV RNA Antibody Titer

Detectable Antibody

Infection

Infecție HIV acută = pacienții se pot prezenta cu sindrom retroviral acut

 Diagnosticul infecției acute cu HIV: manifestări clinice

Signs and Symptoms of 160 Patients with Acute HIV

Sursa: Vanhems P, et al. AIDS. 2000;14:375-81.

Diagnosticul de laborator în infecția HIV acută
• Detecție ARN HIV pozitivă
• Test pentru identificarea anticorpilor anti HIV negativ

Acute HIV

HIV RNA Antibody Titer

Detectable Antibody

Infection
Identificarea acidului nucleic viral
 De ce 5’-3’?

H
 PCR Cycle - Step 1
– Denaturare prin caldura
1min la 94 grade

Target Sequence

Target Sequence
 PCR Cycle - Step 2
- Adita primerilor la capetele secventei tinta
45 sec la 54 grade
 PCR Cycle - Step 3 - Taq Polymeraza
Catalizeaza Extensia primerilor in timp ce se
incorporeaza nucleotide complementare
2min la 72 grade
End of the 1st PCR Cycle – Rezulta doua copii
ale secventei tinta
 PCR:
Amestec Master Mix
Target DNA

Mg2+
Taq DNA
Mn2+ Polymerase

dNTP
Primers
•forward primer
•reverse primer
Thermal Cycler
 Ampliconul
No. of No. Amplicon Cycles
Copies of Target
1 cycle = 2 Amplicon
1 2
2 cycle = 4 Amplicon
2 4

3 cycle = 8 Amplicon 3 8

4 16
4 cycle = 16 Amplicon
5 32

6 64
5 cycle = 32 Amplicon
20 1,048,576

30 1,073,741,822
6 cycle = 64 Amplicon

7 cycle = 128 Amplicon

The central dogma

RT- PCR
Reverstranscriere
+ PCR
Reverse Transcription - Step 1 – Aditia Primer
la secventa tinta ARN
 Reverse Transcription - Step 2 –
Reverstranscriptaze Catalizeaza extensia
Primerului prin incorporarea nucleotidelor
complementare
 End of Reverse Transcription - Step 3 –
Rezulta sinteza ADNcomplementar (cDNA)
pe secventa tinta ARN
 DETECTIA AMPLICONULUI
• Electroforeza in gel de agar colorare
cu bromura de ethidiu si comparare
cu markeri de GM cunoscuta

• Hibridizare cu sonde moleculare

marcate complementare si apoi
detectie (+/- spectrofotometrica)
Hibridizare cu sonde moleculare
marcate complementar

Southern blot
(more formally called an DNA blot)
 Detectie spectrofotometrica

Avidin-horseradish peroxidase
(Av-HRP conjugate)

Biotin Tetramethylbenzidine
(TMB) Substrate

BSA

Hydrogen
Peroxide
Hibridizare Addition
of Substrate
Microwell Plate
Capture
Probe

BSA

Add Stop Solution and

Measure Absorbance
 Real-time PCR
Amplificare si detectie simultana a acidului nucleic permitand montorizarea directa a PCR
Instrumente real-time PCR
 Aplicatiile real-time PCR
• Cuantificarea incarcarii virale
• Cuantificarea expresiei genice
• Detectatia mutatiilor (SNP)
Basic Lab Setup

Unidirectional workflow!
Safety Gloves, Laboratory Coat
Safety Glasses
Biohazard Container

0.5% sodium hypochlorite, ethanol,

Biological Safety Hood
Vortex Mixer
Centrifuge and/or Microcentrifuge (min. RCF 12,500 x g),
some tests require a refrigerated, high speed centrifuge (min. RCF 24,000 x g)
Dry-heat Temperature Block
 Pipettor and Screw-cap Tube Rack,
Multichannel Pipettor and Tips

•Screw-cap tube racks (to hold Master Mix tubes)

PCR System consumables
(tubes, base, tray and retainer).
Analyser Consumables/parts
D-cups

A-rings, A-ring Holder

PCR System 9600 or System 2400
Thermal Cycler
 Întrebări
• Pe cine testăm?
– Pacienți cu infecții oportuniste inexplicabile
– Pacienți cu ITS care indică risc de expunere HIV
– Pacienți VHB sau VHC
– Pacienți care au neoplazii asociate HIV
– Pacienți care au tulburări neurologice asociate HIV sau demență inexplicabilă
– Pacienți cu status imunodeficitar
– Gravide
– Pacienți cu semne și simptome generale sugestive pentru afecțiuni cronice cu substrat
imunodeficitar
– Pacienți cu analize de laborator modificate – imunodeficientă
– Pacienți cu semne și simptome de sd retroviral acut
– Accidente de muncă
– Cazuri medico-legale – victime ale violurilor
Cum testăm?
 Întrebări

• Cum arată profilul serologic al unui nou-

născut din mamă HIV pozitivă?
 Întrebări
• Pacient în vârstă de 40 de ani se prezintă
pentru explorarea unei posibile infecții cu
HIV la 1 săptămână de la un accident de
muncă (s-a înțepat în timpul unei intervenții
chirurgicale la un pacient HIV pozitiv). Care
este algoritmul diagnostic?
 Întrebări

• Care sunt testele de triaj care se efectuează

donatorilor de sânge?
Vă mulțumesc!