Purificação de Produtos

Biotecnológicos
Introdução

 A diversidade e crescente importância apresentada pelos produtos biotecnoló-

gicos incentivou o desenvolvimento de vários processos de purificação, (ope-
rações unitárias), bem como estímulou a introdução de modificações genéticas
no desenvolvimento do microorganismo, com o objetivo de aumentar a resolu-
ção na purificação, integrando as etapas de desenvolvimento do processo.

 Produtos da indústria biotecnológica são altamente diversificados :

- Ácidos orgânicos
- Antibióticos
- Polissacarídeos
- Hormônios
- Aminoácidos
- Peptídeos
- Proteínas
Suas localizações na célula também variam conforme o produto.

Portanto, não há processos de purificação de aplicação geral.

O processo de purificação pode ser dividido em 4 etapas principais :
Etapas do Processo
Clarificação
Rompimento de Células
Purificação de Baixa Resolução
Purificação de Alta Resolução
Tratamentos Finais
Objetivo da Etapa
Separação de células e seus
fragmentos do meio de cultivo.
Promover a retirada do produto
das células para o meio de cultivo.
Separação da molécula alvo, por
exemplo uma proteína, em
relação a moléculas com -
características físico-químicas -
significativamente diferentes, tais -
como água, ions, pigmentos,
ácidos nucleicos, polissacarídeos e
lipídeos).
Compreende a separação de
classes de moléculas com
algumas características físico-
químicas semelhantes, como por
exemplo proteínas.
Operações de acondicionamento
final do produto.
Operações Unitárias
- Filtração convencional
- Centrifugação
- Filtração tangencial
- Floculação
- Homogeinização
- Moagem em moinho de bolas
- Rompimento químico
- Rompimento enzimático
Precipitação
Ultrafiltração
Extração em sistemas de duas
fases líquidas.
- Cromatografia de troca iônica
- Cromatografia de afinidade
biológica ou química.
- Cromatografia de fase reversa
- Cromatografia de exclusão
molecular.
- Cristalização
- Liofilização
- Secagem
 Etapas de um Processo de Purificação

Alta resolução
Baixa resolução
12.2 – Definição e Escolha do Processo de Purificação

 A definição das operações unitárias de um processo de purificação depende

do uso da molécula alvo, suas características físico-químicas, bem como aquelas
das impurezas.

 Produtos destinados a usos terapêuticos são, obviamente, os que requerem

maior nível de pureza e, portanto, a complexidade do processo de purificação é
maior.

 Uma medida dessa complexidade é o custo do processo de purificação em

relação ao custo final do produto, o qual pode chegar a 80%.

Em resumo, pode dizer que o sucesso técnico e econômico do processo está re-
lacionado à seleção adequada das técnicas e da ordem de aplicação das mesmas.
de forma geral, algumas regras podem ser analisadas para uma abordagem inicial:
- Escolha de processos de purificação baseados nas diferenças apresentadas em
uma dada propriedade físico-química das moléculas (produto e impurezas);
- Remoção das impurezas presentes em maior concentração nas etapas iniciais
do processo;
- Aplicação de técnicas de alta resolução em relação ao produto, nas etapas
finais do processo.
 A determinação da características do produto e das principais impurezas é
fundamental no sucesso das operações subsequentes de purificação
propriamente dita, uma vez que o fracionamento está baseado nas proprie-
dades físico-químicas das moléculas envolvidas :

OPERAÇÃO UNITÁRIA CARACTERÍSTICAS DETERMINANTES

Densidade e tamanho das células,

Centrifugação
Viscosidade do meio.
Compressibilidade e tamanho das
Filtração convencional
células.
Microfiltração Tamanho das células ou partículas.
Resistência física da parede celular ao
Homogeinização
gradiente de pressão.
Resistência física da parede celular à
Moinho de bolas
tensão de cisalhamento.
Extração em SDFA precipitação Solubilidade de proteínas.

Cromatografia de troca iônica Mobilidade eletroforética de proteínas.

Ultrafiltração, gel filtração Massa molecular

Alguns critérios norteiam a escolha das op. unitárias de clarificação e
homogeinização :
- Grandes volumes de suspensões de leveduras são eficientemente clarificados
por centrifugação, enquanto que para volumes moderados de
suspensões , uma comparação entre a centrifugação e a filtração tangencial
pode ser feita.
- Micoorganismos filamentosos, por outro lado, são clarificados através de
filtração convencional, devido à reduzida velocidade de sedimentação destes
organismos
de baixa densidade.

A modificação da estrutura de moléculas é um recurso importante para o aumento

do poder
de resolução de determinadas operações de purificação e, consequentemente ,
redução do
número de etapas envolvidas.
- Por exemplo, a introdução de sequências terminais à estrutura da proteína alvo
que a
enderecem para o espaço periplásmico e implementação destas modificações
via em-
genharia genética, possibilita a extração apenas das moléculas do espaço
periplasmá-
tico, o que significa menor contaminação da molécula alvo.
A adsorção em leito expandido tem sido cada vez mais adotada, pois possibilita a
redução do número de etapas, uma vez que a captura de proteínas se dá a partir
de meios que contém partículas, procedimento que viabiliza a clarificação de uma
suspensão ou de um homogeinizado de células e a purificação da molécula alvo
em uma única operação. Além disso, a redução do tempo de processamento dimi-
nui a possibilidade de hidrólise da molécula alvo por ação de proteases, normal-
mente presentes quando se trata de produtos intracelulares.

 É importante comentar que além das caracterizações físico-químicas das

moléculas, também devem ser consideradas características inerentes às
operações. Por exemplo, na gel filtração ocorre diluição significativa, isto
é, a concentração das moléculas nas frações coletadas é menor que a
concentração no meio injetado na coluna. Por essa razão, a gel filtração é
empregada na última etapa de um processo de purificação, pois do contrá-
rio, acarretaria umento do volume do meio a ser tratado ao longo do pro-
cesso. Ao final do processo, pode-se empregar a utrafiltração para ajuste
da concentração. A cromatografia de troca iônica, ao contrário da gel filtra-
ção, promove o aumento da concentração das moléculas.
Clarificação
A separação de células suspensas de um meio de cultivo é frequentemente a
primeira operação unitária de purificação. O meio resultante, isento de células,
é denominado clarificado ou filtrado.

As operações unitárias, nesta primeira etapa após o processo de fermentação,

podem ser :

- Decantação
- Filtração Convencional
- Filtração Tangencial
- Centrifugação

A figura abaixo ilustra a faixa de dimensão de partícula e a operação unitária :

Classificação de operações unitárias de clarificação em função das dimensões de células microbianas

Filtração
Filtro Rotativo
a Vácuo
Centrifugação

Na filtração, o objetivo é a obtenção do meio clarificado, enquanto que na

centrifugação, além deste adiciona-se o objetivo de obter uma massa de
células de forma que proporcione a recuperação e o reciclo destas célu-
las recuperadas para os fermentadores.
 Quando as células ou o caldo fermentado
devem voltar ao biorreator, pode-se usar
centrífugas esterilizáveis por vapor.
Fc deve ser mencionado
na caracterização de
uma centrifugação
juntamente com o tempo
adotado para se obter
determinado grau de
clarificação.
12.4 – Rompimento de Células Microbianas
Biomolécula Alvo
12.4.1 - Rompimento Mecânico

 Muito utilizados industrialmente.

 Dois equipamentos predominantes :

- Homogeinizador
- Moinho de bolas

 O tamanho e a forma das células, assim a estrutura da parede celular, são

fatores determinantes para o tipo de processo a ser utilizado.

- Os homogeinizadores são, basicamente, constituídos de pistões projetados

para aplicar altas pressões à suspensão celular, forçando sua passagem
através de um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície em
uma câmara de baixa pressão.
12.4.2 - Rompimento Não-Mecânico

1) Choque Osmótico

 Não ocorre rompimento total das células;

 Pode propiciar a permeabilização seletiva;

 As células são mantidas por 30 minutos em meio com

concentração de sacarose de ~20% (m/v), separadas por
centrifugação e ressuspensas em água destilada a 4ºC.

 Mais indicado para bactérias Gram-negativas, pois possuem

parede celular mais sensível que as Gram-positivas.
Rompimento total e permeabilização seletiva
2. Congelamento-Descongelamento

 As células passam por repetidos ciclos de congelamento e

descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem
perfurar a célula e provocar seu total rompimento ou lesioná-la
formando poros permeáveis à biomolécula-alvo.

 Fatores que mais influenciam:

◦ tipo e idade da célula;
◦ Temperatura
◦ Velocidades dos ciclos de congelamento e descongelamento;

 Método de difícil implantação em grande escala

 Enzimas sensíveis ao congelamento podem ser inativadas

3. Termólise (Aquecimento)

 Consiste no aquecimento da suspensão celular em banho

termostatizado, com injeção direta de vapor, tambor rotativo ou em
spray-drier.

 Sãos os mais utilizados para rompimento em larga escala devido à

sua simplicidade;

 Principalmente utilizados para algas, fungos filamentosos, leveduras

e bactérias destinadas à produção de proteína microbiana;

 Apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores

dimensões e, portanto, de mais fácil remoção por filtração ou
centrifugação.

 Rompimento total de células de uma suspensão de E. coli (bactéria Gram-negativa), ocorre

com aquecimento a 90 ºC por 15 minutos com liberação de enzimas intracelulares
 Uma suspensão de Bacilus megaterium nas mesmas condições proporciona o rompimento
de menos da metade das células (bactéria Gram-positiva- camada mais espessa de
peptideoglicano)
12.4.3 - Rompimento Químico

1. Álcalis
 Adequado quando a molécula-alvo é estável em pH maior que 11
 Método simples e de baixo custo;
 Ocasiona geração de poluentes;

2. Detergentes
 São capazes de dissociar proteínas e lipoproteínas das paredes
celulares, provocando a formação de poros e liberar a molécula-alvo;
 A célula pode ser totalmente rompida;
 Ex.: lauril sulfato de sódio, Triton, etc.
 Formação de espuma e desnaturação e/ou precipitação de proteínas

3. Solventes
 Consiste na desidratação das células, sendo os solventes mais
utilizados o etanol, metanol, tolueno e acetona;
 Adequado para biomoléculas que não sejam desnaturadas na
presença do solvente empregado;
12.4.4 - Rompimento Enzimático

 Lise enzimática:

 Mecanismo de rompimento: membrana citoplasmática é

rompida pela pressão osmótica interna, após a parede celular,
ou parte dela, ser removida por ação das enzimas, permitindo
que o conteúdo intracelular seja liberado.

 Adequado para recuperação de biomoléculas sensíveis ao

rompimento mecânico, temperatura, tensão de cisalhamento e
elevadas pressões.

 Fatores a ser considerados: presença de inibidores,

possibilidade de reciclo da enzima.
 Sistema enzimático deve ser adequado para cada tipo de
microrganismo:

◦ Leveduras: glucanases, proteases e mananases, as quais

hidrolisam componentes específicos da parede, como glucanas,
proteínas e mananas.

◦ Bactérias Gram-negativas: enzimas que ajam sobre as ligações

covalentes da estrutura do peptideoglicano

Parede Celular Bacteriana Peptideoglicano

Ex.: lisozima, catalisa a

hidrólise das ligações glicosídicas do
peptideoglicano, mais eficiente no
rompimentos de bactérias Gram
positivas.
  Preservação da Biomolécula-alvo

 Adição de inibidores de proteases (para diminuir o efeito da

degradação de proteínas);

 Adição de agentes redutores (para evitar a oxidação dos sítios ativos

das enzimas após o rompimento);

 Adição de nucleases ou proteases podem melhorar as características

do meio, desde que não destruam a molécula de interesse;

 Alteração de pH pode melhorar a viscosidade do meio.

12.5 – Purificação de Baixa Resolução

Concentração e/ou Purificação de Baixa Resolução consiste na

separação da molécula alvo, por exemplo uma proteína, em relação a
moléculas com características físico-químicas significativamente
diferentes, tais como água, ions, pigmentos, ácidos nucleicos,
polissacarídeos e lipídeos).

As principais operações unitárias envolvidas neste processo são :

- Precipitação

- Ultrafiltração (filtração por membranas)

- Extração em sistemas de duas fases líquidas.

12.5.1 – Precipitação da Molécula Alvo

Uma perturbação , química ou física, em uma solução protéica causa

a formação de partículas insolúveis de proteína, recuperadas
posteriormente por uma operação de separação sólido-líquido

Precipitação :
Sem elevada capacidade de separação de diferentes proteínas

Método de moderado poder de purificação

Precede processos de elevada resolução : cromatografia

Método agressivo

Proteínas precipitadas têm sua estrutura tridimensional modificada

Função bioquímica depende da estrutura desta estrutura (enzima)

Portanto, só é viável quando a adequada conformação da proteína é

recuperada após a precipitação
 Precipitação Fracionada

Os meios que contêm a proteína a ser purificada apresentam, em geral misturas

de diferentes biomoléculas e as precipitações devem ser conduzidas em duas ou
mais etapas :

Primeira etapa → remoção de proteínas indesejáveis menos solúveis

Seguintes etapas → precipitação de um ou mais biomolécula alvo

Ppt simples, em um único estágio → concentração

Ppt fracionada → largamente utilizada industrialmente para a purificação

Inconvenientes :

•Pouca reprodutibilidade dos resultados obtidos em laboratório

•Redução da eficiência observada com o aumento da escala

- O sobrenadante de uma precipitação fracionada é o material inicia para o

próximo fracionamento e podem ocorrer mudanças conformacionais e perdas.
- Principal variável é a concentração de precipitante. Porém, pH, temperatura,
força iônica e concentração de proteínas também podem ser usadas como
variáveis.
Em soluções aquosas a precipitação pode ocorrer por :
 Precipitantes e princípios :

Precipitante Princípio Vantagens Desvantagens

Sais neutros Interações hidrofóbicas pela - Uso universal - Corrosivo
(Salting-out) redução da camada de hidratação
da proteína - Baixo custo - Liberação de amônia em pH alcalino
Polímeros não-iônicos Exclusão da proteína da fase aquosa - Uso de pequenas quantidades - Aumento da viscosidade
reduzindo a quantidade de água de precipitante
disponível para a solvatação da
proteína

Calor interações hidrofóbicas e - Baixo custo - Risco de desnaturação

interferência das moléculas de água - Simples
nas ligações de hidrogênio,
Polieletró-litos Ligação com a molécula de proteína - Uso de pequenas quantidades - Risco de desnaturação
atuando como agente floculante de precipitante

Precipitação isoelétrica Neutralização da carga global da - Uso de pequenas quantidades - Risco de desnaturação
proteína pela alteração do pH do de precipitante
meio

Sais metálicos Formação de complexos - Uso de pequenas quantidades - Risco de desnaturação

de precipitante

Solventes orgânicos Redução da constante dielétrica do
meio aumentando as interações
eletrostáticas intermoleculares
- Facilidade de reciclagem - Risco de desnaturação de proteínas
- Facilidade na remoção do - Inflamável e explosivo
precipitado
Desnaturação X Precipitação
 A desnaturação compreende a destruição da estrutura
terciária de uma molécula de proteína e a formação de
cadeias polipeptídicas ao acaso.
- as variáveis pH, temperatura e solventes orgânicos,
dependendo dos valores, causam desnaturação das
proteínas.

 A precipitação compreende a modificação da

estrutura tridimensional da molécula de proteína.
- as mesmas variáveis, dependendo dos valores,
causam precipitação das proteínas.
 A precipitação deve permitir que a
conformação adequada da proteína seja
recuperada, para que a mesma possa
“exercer” sua função bioquímica após o
processo.
 Precipitação por sais
 Neutralização das cargas superficiais com redução
da camada de hidratação

 Salting-out: adição de sais que promovem o

aprisionamento de moléculas de água que tornam-
se escassas e o consequente consumo das
moléculas de água nas regiões hidrofóbicas, que
expostas interagem e se agregam.

 Os sais mais adequados são aqueles que

apresentam elevada solubilidade, ex.: citrato
de sódio, sulfato de sódio e sulfato de
amônio.
 ◦ Salting-in: redução na concentração de sais
induz interações iônicas e agregação entre
moléculas de proteína.

Globulinas se precipitam sob força iônica baixa

Método mais comumente usado para separação

de proteínas é o da adição de sais neutros
(salting out)
 Precipitação por solventes
 A solubilidade das proteínas varia com a distribuição dos
resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos na superfície da molécula;

 Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e outros:

precipitantes;

 Deve ser miscível em água, não reagir diretamente com as

moléculas e ser bom precipitante;

 Mais usados: metanol, etanol e acetona;

Mecanismo da Precipitação por Solventes

Agregação de proteínas por interações eletrostáticas entre superfícies com

cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgânico.
 Variáveis que afetam o processo
◦ Temperatura: 20 – 30 ºC estimulam a
desnaturação < 0º C podem garantir que não haja
desnaturação
adição do solvente  temperatura =>
deve ser lenta e sob refrigeração

◦ pH: próximo ao pI favorece a precipitação

 Precipitação por polímeros
 PEG (polietilenoglicol), polímero de alta massa molar,
neutro e miscível em água, disponível em diversos graus de
polimerização;

◦ Em geral,  proporções de polímero (15 a 30%);

◦ 4000 g/mol ou mais são os mais eficientes
◦ Mecanismo: exclusão da proteína do meio aquoso;
◦ Concentração depende do tamanho da molécula a
ser precipitada e da massa molar do polímero, sendo
inversamente proporcional à concentração da
proteína;
◦ Remoção do polímero: ultrafiltração, adição de
etanol, separação pela formação de duas fases
aquosas pela adição de sais.
 Polieletrólitos: polímeros iônicos solúveis em água; usados
devido ao baixo custo e pouca concentração residual;
◦ Policátion polietilenoimina e poliânion ácido poliacrílico,
utilizados para precipitar ácidos nucléicos e proteínas.
◦ Mecanismo: Ocorre a agregação à proteína (floculação) ou
eletrostático (neutralização de cargas); a proteína e o
polieletrólito devem ter cargas opostas , por isso, deve-se
operar longe do ponto isoelétrico da proteína.

Precipitação pela temperatura

 Mecanismo:1) diminuição: redução na solubilidade;
2) aumento: desnaturação => exposição de grupos
hidrofóbicos que interagem e formam complexos
insolúveis;
Precipitação isoelétrica
 Resulta da atração eletrostática das proteínas
quando estas estão próximas a seu pI;
 Método bastante simples: ajuste do pH
◦ Próximo ao pI a repulsão eletrostática é mínima
=> precipitação isoelétrica, por interação entre as
zonas hidrofóbicas;
 Vantagem: baixo custo
 Desvantagem: possibilidade desnaturação

 Obs.: Método útil para precipitar proteínas

indesejáveis e otimizar outros tipos de precipitação;
12.5.2 – Separação por Membranas

 Os processos mais empregados para purificação de bioprodutos

são os que utilizam a diferença de pressão como força motriz;

 Em razão da natureza e do tipo de solutos e da presença ou não de

partículas em suspensão, existem diferentes membranas com
diferentes tamanhos e distribuição de poros caracterizando 4
principais processos:

◦ Microfiltração;
◦ Ultrafiltração;
◦ Nanofiltração.
◦ Osmove inversa.

A membrana atua como uma barreira seletiva permitindo a passagem de

determinados componentes enquanto impede a passagem de outros.
Vantagens da Separação por Membranas

Economia de Energia :
Os PSM, em sua grande maioria, promovem a separação sem que ocorra
mudança de fase.

Seletividade :
Em algumas aplicações estes processos se apresentam como a única
alternativa técnica de separação.

Separação de Compostos Termolábeis :

São operados à temperatura ambiente, podendo ser aplicados no
fracionamento de misturas envolvendo substâncias termossensíveis
amplamente empregados na indústria farmacêutica e de alimentos.

Simplicidade de Operação e Escalonamento :

São simples do ponto de vista operacional e em termos de
escalonamento(scaleup).
.Os sistemas são modulares e os dados para o dimensionamento de uma planta podem
ser obtidos a partir de equipamentos pilotos operando com módulos de membrana de
mesma dimensão daqueles utilizadosi ndustrialmente. Além disso, a operação dos
equipamentos com membranas é simplese nãoi ntensiva em mão-de-obra.
 Classificação dos Sistemas :

FORÇA MOTRIZ : - Concentração

- Pressão
- Potencial Elétrico
- Temperatura
Principais características dos processos que utilizam diferença de
pressão como força motriz :
Faixas de tamanho de poros das membranas
 Microfiltração
 É similar a uma filtração clássica que utiliza membranas
sintéticas como barreira seletiva
 Emprega membranas microporosas, isotrópicas ou
anisotrópicas, com tamanho de poros entre 0,05 a 5 mm
 É empregada para reter partículas em suspensão, tanto no
ar quanto em misturas aquosas
 São membranas totalmente permeáveis aos compostos
solúveis, independentemente do valor de suas massas
molares
 Aplicação: filtração estéril, tanto de líquidos (mosto)
quanto de gases (ar).
Ultrafiltração
 Emprega membranas microporosas anisotrópicas, com
diâmetros de poros entre 1 e 500 nm.

 Capaz de reter macromoléculas em solução, e permeável a

todos os solutos de baixa massa molar

 O limite de retenção de uma membrana de ultrafiltração é

definido como o valor da massa molar de uma macromolécula
rejeitada em 95% pela membrana

 Aplicações :
-Utilizada na purificação quanto na concentração de proteínas e enzimas
-Indústria alimentícia–pré concentração do leite e recuperação de proteínas do
soro do queijo,
-Indústria automobilística e têxtil– recuperação de pigmentos para reciclo da
água
Nanofiltração
Osmose Inversa
 Utiliza membranas anisotrópicas densas, portanto, são permeáveis
apenas ao solvente, em geral, água, retendo, praticamente, todas as
moléculas solúveis e materiais em suspensão;

 Alta pressão faz a água atravessar a membrana no sentido da

solução mais concentrada para a menos concentrada.
Osmose Inversa
Diafiltração
12.5.3 – Separação por Extração Líquido-Líquido

• Utilizada na purificação de antibióticos e ácidos orgânicos;

• Consiste na separação da molécula-alvo e impurezas baseada

em suas diferentes solubilidades nas fases líquidas
 Vantagens
 Extração em sistemas de duas fases aquosas
 Sistemas de duas fases aquosas são formados pela
reunião de determinados polímeros, polieletrólitos, ou
polímeros em combinação com solutos de baixa massa
molar formando quatro grupos de combinações :

◦ 2 polímeros não-iônicos.
◦ Polieletrólito e um polímero não-iônico;
◦ 2 polieletrólitos
◦ Polímero não-iônico e um composto de baixa massa
molecular

 Sistemas formados por polietilenoglicol e um sal são

intensamente empregados por apresentarem rápida
separação das fases, baixo custo e elevada seletividade na
separação de moléculas com base na solubilidade
Extração em sistemas de duas fases aquosas

 Duas soluções aquosas

imiscíveis;

 Molécula-alvo P apresenta
maior solubilidade na fase de
topo em relação à fase de
fundo;

 Maior grau de pureza da

molécula-alvo se os
contaminantes apresentarem
solubilidade maior na fase de
fundo
Diagrama de Equilíbrio em sistemas de duas
fases aquosas (SDFA)
Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato

Reta TMB: linha de amarração (“tie-line”)

Curvas de equilíbrio do sistema PEG/fosfato de
potássio em função dos parâmetros massa molecular e
pH do meio
 Coeficiente de Partição (K)

 Grandeza adimensional que representa a relação entre as

concentrações da molécula de interesse na fase de topo e na
fase de fundo no equilíbrio:
K= CTi
CFi

CTi = Concentração de soluto i na fase de topo (g/L);

CFi= Concentração de soluto i na fase de fundo (g/L);

Utilizado para avaliação da extensão das separações nos sistemas de duas

fases aquosas;
Ocorrência de purificação: coeficientes distintos para a molécula de interesse
e para as demais moléculas.
Fatores que influenciam no coeficiente de partição K

 Interações hidrofóbicas
 Cargas superficiais / pH
 Diferença de potencial elétrico entre as fases
 Efeito de salting-out da fase salina
 Diferenças de viscosidade
 Diferenças de densidade
 Diagramas de fases (ex.: concentração de PEG e sal)
 Massa molecular da biomolécula
12.6 – Purificação de Alta Resolução

Concentração e/ou Purificação de Alta Resolução consiste na

separação da molécula alvo, em relação a moléculas com algumas
características físico-químicas semelhantes, tais como algumas
proteínas.

As principais operações unitárias envolvidas neste processo são :

- Cromatografia de exclusão molecular

- Cromatografia de troca-iônica

- Cromatografia de interação hidrofóbica

- Cromatografia de afinidade
Cromatografia

Princípio Geral:

 Retenção e Liberação da molécula-alvo.

 A matriz sólida é capaz de reter a molécula por um

determinado período de tempo (tempo de retenção),
normalmente por processo de adsorção.

 Eluição do fluido e consequente separação da molécula-

alvo.
Cromatografia
Cromatografia
 Cromatografia de exclusão molecular
Processo:

 Os solutos de um meio líquido (proteínas, peptídeos,

anticorpos) são adsorvidos ou retidos em um leito de
material poroso;

 As moléculas sofrem partição em virtude das diferenças

no tamanho das espécies entre um solvente (fase móvel)
e uma fase estacionária de porosidade definida;

 A posterior remoção gradual dos solutos por ação de uma

fase líquida móvel (eluente), resulta na separação das
diferentes moléculas
Cromatografia de exclusão molecular

Separação por tamanho das moléculas

A ordem de recuperação seletiva das moléculas no fluxo eluente tem início

com as maiores moléculas, prosseguindo em direção às menores.
Cromatografia de exclusão molecular

 Eluição de uma mistura

de três proteínas de
massas moleculares
diferentes em uma coluna
de permeação em gel,
com a formação de faixas
distintas à medida que a
amostra permeia a coluna
Cromatografia de exclusão molecular

 Aplicações:

◦ Dessalinização

◦ Determinação de massas
moleculares

◦ Determinação de tamanho de poros

 Cromatografia de troca-iônica

 Baseia-se na afinidade que componentes de uma

amostra tem com os sítios iônicos em uma matriz
sólida, ou seja, existe uma competição entre íons de
interesse e contaminantes pelos grupos carregados da
matriz ou da fase estacionária.

 As resinas empregadas apresentam elevada capacidade

de adsorção de proteínas

 A fase estacionária, eletricamente carregada, tem a

capacidade de reter solutos que estão na fase móvel e
apresentam cargas de sinais opostos

 Controle de pH e força iônica

Cromatografia de troca-iônica

Matrizes de troca-iônica:

 Trocadores aniônicos: contém grupos positivamente carregados

e adsorvem proteínas com carga líquida negativa

 Trocadores catiônicos: contém grupos negativamente

carregados e adsorvem proteínas com carga líquida positiva

 Após serem adsorvidos à matriz, os solutos podem ser eluídos

por deslocamento com outros íons, com a mesma carga da
proteína adsorvida, porém com maior força de interação com a
fase estacionária.
Cromatografia de troca-iônica

 Princípio básico da cromatografia de troca iônica

 Cromatografia de interação hidrofóbica

 Baseia-se na retenção das moléculas pela interação da sua

região hidrofóbica com a matriz

 A proteína é colocada em meio com elevada concentração

de sal (expõe a região hidrofóbica, aumentando a interação
com a matriz)
Cromatografia de interação hidrofóbica

Molécula de proteína
Cromatografia de interação hidrofóbica

Modelos de adsorção

a: modelo uniponto;
b e c: adsorção uniponto;
d: forças hidrofóbicas de intensidades diferentes em razão das irregularidades na
superfície da matriz.
 Cromatografia de Afinidade

 Técnica de separação altamente específica que

depende das interações entre os pares de
materiais biológico: enzima-substrato, enzima-
inibidor, antígeno-anticorpo.

 O ligante é imobilizado em uma matriz porosa

Cromatografia de Afinidade

Alta especificidade

Separação de formas ativas de formas desnaturadas

Cromatografia de Afinidade

Alta especificidade

Separação de formas nativas de formas desnaturadas

O complexo formado entre o ligante e a proteína tem que ser
reversível;

A proteína é eluída e o ligante regenerado.

Cromatografia – Ampliação de Escala
Critérios:

 Manter os mesmos graus de pureza, rendimento,

atividade biológica e, se possível, rendimento,
alcançados em escala de bancada;

 Purificação de miligramas a gramas de produto;

 Principal característica: aumento do diâmetro da

coluna e a manutenção constante da altura do leito
cromatográfico, exceto para exclusão molecular
(ainda deve ser aumentado em 10 % a altura do
leito);
Cromatografia – Ampliação de Escala

Parâmetros que devem ser mantidos constantes:

 Volume da fase estacionária;
 Grau de empacotamento;
 Altura do leito cromatográfico;
 Velocidade linear de alimentação (vazão volumétrica dividida pela área de
corte transversal da coluna).

Parâmetros que devem ter o valor aumentado:

 Diâmetro da coluna;
 Fluxo volumétrico;
 Volume de amostra

Colunas industriais
• Altura de leito em torno de 30 cm e diâmetro da ordem de 1 m.
• Maiores volumes de colunas da ordem de 700 a 2000 L (ex.: purificação do soro
de queijo)
Cromatografia – Ampliação de Escala
12.7 – Tratamentos Finais

Operações para acondicionamento final do produto

- Liofilização

- Cristalização

- Secagem