PROTEINE CU FUNCŢIE

CATALITICĂ
ENZIME
 Mecanisme de reglare a funcţiei proteice
• 1 celulă bacteriană – 250000 proteine diferite, aflate la distanţe f. mici şi
doar câteva molecule de apă
•  necesară o reglare foarte strictă a funcţiei proteice
• Unele proteine nu au specificitate mare – pot îndeplinii mai multe funcţii –
depinde de condiţiile de mediu
• Reglarea funcţiei proteice poate fi controlată prin:
– Localizarea produşilor genelor şi/sau a speciilor cu care interacţionează
– Legarea covalentă sau necovalentă a moleculelor de efector (vezi şi
cooperativitatea)
– Cantitatea şi durata de viaţă a proteinei active
Legarea covalentă a efectorilor:
– Fosforilare
– Ataşări covalente de lipide şi glucide
– Metilări la catenele laterale
– Acetilări amino-terminale
– Scindări proteolitice la nivelul lanţului polipeptidic
Controlul cantităţii şi duratei de viaţă
– Cantitatea – la nivel transcripţional
– Durata de viaţă – viteza de degradare
 ENZIME

• sunt produse chiar de organism – majoritatea sunt proteine cu acţiune

catalitică (en zyme = în drojdie)
• s-au identificat şi acizi ribonucleici cu funcţie catalitică, substanţe
numite ribozime
• Acţiunea enzimelor constă în accelerarea reacţiei, grăbind
instalarea stării de echilibru.
• Nu influenţează echilibrul reacţiei.
• Nu acţionează decât în cazul reacţiilor termodinamic posibile

Particularităţi
• Domeniu moderat de temperatură (37°C), pH (7,4) şi presiune (1 atm)
• Mare specificitate, neformând produşi secundari
• Efect net superior al acţiunii catalitice, scăzând energia de activare a
reactanţilor
• În reacţii reversibile, catalizează desfăşurarea reacţiei în ambele
sensuri, în funcţie de concentraţia reactanţilor şi a produşilor de reacţie
Acţiunea :
• formarea unor complexe
tranzitorii de activare, cu
energie foarte mică şi în care
se realizează orientarea
stereospecifică a reactanţilor şi
desfăşurarea reacţiei.
• În majoritatea cazurilor, fixarea
reactanţilor de centrul activ al
enzimei este însoţită de
labilizarea sau ruperea unor ΔGo' = –R T ln Kech
legături din structura
reactanţilor, favorizându-se ΔGo' = –n F ΔE
astfel reacţia.
 Eficacitate
Viteza de descompunere a apei oxigenate
în prezenţa a diverşi catalizatori

Viteza de reacţie Energie de activare

Catalizator relativă (kcal / mol)
Necatalizat 1 18
Ioduri 8 x 102 14
Platina 2 x 104 12
Catalaza 3 x 1011 5
 Concentraţia constantă a constituenţilor
chimici celulari

• Marea majoritate a reacţiilor chimice sunt reversibile, catalizate de

enzime şi sunt încadrate în şiruri de reacţii consecutive, numite
căi metabolice, care cuprind atât reacţii exergonice, cât şi reacţii
endergonice, cuplate între ele prin transfer de energie.
• Căile metabolice sunt interconectate între ele prin intermediari
comuni sau transfer de energie, ceea ce dă sistemului biologic o
mare mobilitate în relaţia sa cu mediul ambiant.

Sistemul viu este deci un sistem termodinamic deschis

• O stare veritabilă de echilibru (în sens termodinamic), în reacţiile ce

au loc, nu se realizează.
• Se constituie, pentru şirul de reacţii biochimice considerat, o stare
de echilibru dinamic.

"stare de constanţă a concentraţiilor de metaboliţi"

 Nomenclatura şi clasificarea enzimelor
• numele vechi: pepsina, tripsina
• numele enzimei să fie determinat de substratul acţiunii, urmat de
sufixul "-ază" (amilază, maltază etc.).
• necesară includerea, în denumire, a unor indicaţii privind acţiunea
enzimei (succinat dehidrogenază

• Din 1961, Uniunea Internaţională de Biochimie: clasificare raţională:

– Numele are două părţi:
• prima parte este formată din numele substratului,
• a doua se termină cu sufixul "ază", denumind reacţia
catalizată
• numele mai poate conţine informaţii suplimentare, în cazul în
care enzima funcţionează cu o anumită coenzimă;

de exemplu: L-lactat-NAD+-oxidoreductază

substrat coenzimă Reacţie catalizată

tip redox
Fiecare enzimă se defineşte şi printr-un:
număr de cod, EC (enzyme classification) format din patru cifre:
– prima indică clasa din care fac parte;
– a doua indică subclasa, în funcţie de gruparea asupra căreia
intervine;
– a treia indică subclasa de apartenenţă, de exemplu în funcţie de
coenzima conţinută;
– a patra indică numărul de ordine al enzimei considerate din
clasa respectivă.

De exemplu: L-lactat-NAD+-oxidoreductaza are numărul de cod EC

1.1.1.27.
 Clase de enzime

1. Oxidoreductaze: catalizează transferul de hidrogen sau de

electroni de pe substraturi sau fixare de oxigen;

2. Transferaze: catalizează transferul unor atomi sau grupe de

atomi, altele decât cele din clasa 1;

3. Hidrolaze: catalizează procesele hidrolitice de liză a moleculelor

cu ajutorul apei;

4. Liaze: sunt enzime care desfac sau refac molecule, dar în alt mod
decât hidroliza;

5. Izomeraze: catalizează transformări cu menţinerea formulei

moleculare;

6. Ligaze (sau sintetaze): catalizează formarea unor legături între

carbon şi un alt nemetal.
 1. Oxidoreductaze
transportoare de hidrogen sau de electroni
• dehidrogenaze, reductaze sau oxidaze,
• au drept cofactori enzimatici:
– nucleotide piridinice (NAD+, NADP+),
– derivate flavinice (FMN, FAD)
– derivaţi porfirinici ce leagă ioni de fier (citocromii, catalaza,
peroxidaza, etc.)
• Subclase, funcţie de gruparea asupra căreia acţionează:
- –CH2-OH,
- –CH2–CH2–,
- CH2–NH2,
- fenoli,
- compuşi cu sulf , etc.
 • Succinat–FAD–dehidrogenaza
N NH
CH2 C OOH CH C OOH
+ +
CH2 C OOH H OOC CH
N HN
acid succinic FAD acid fumaric FADH2

• Catalaza
catalaza
H2O2 + H2O2 O2 + 2H2O

• CoenzimaQH2-Cit.c reductaza
coenzima QH2-citocrom C reductaza
coenzima QH2 + 2citCoxidat coenzima Q + 2H+ + 2citCredus
 2. Transferaze
• transferă anumite grupări de atomi
(–CH3, –NH2, –PO3H2, etc.) de la un donor pe un acceptor.
• Subîmpărţirea în cadrul clasei se face în funcţie de natura
radicalului transferat: metiltransferaze, aminotransferaze
(transaminaze), etc

a) Metiltransferaze: transferă grupa –CH3 de la donor la acceptor.

- Donorii de metil: S-adenozil-metionina şi colina
- Acceptorii: colamina, homocisteina, noradrenalina, etc.
 b) Transaminazele catalizează transferul grupării amino de la un
aminoacid pe un –cetoacid.
Ex. glutamic–oxalacetic transaminaza (GOT - ASAT) şi glutamic–piruvic
transaminaza (GPT . ALAT).
Gruparea prostetică a transaminazelor este piridoxal–fosfatul (vit B6).

alanin - aminotransferaza
alanina +  - cetoglutarat piruvat + glutamat
 c) Aciltransferazele catalizează transferul radicalilor acil. Transportorul
este Coenzima A, activată de ATP, care formează ca intermediar
acilcoenzima A, unde radicalul acil este legat de atomul de sulf al
CoA.
• Aciltransferazele sunt active în special în metabolismul lipidic;
• un rol important îl joacă acetil-coenzima A (CH3–CO~S–CoA).

glicerol-3-fosfat-aciltransferaza
acil-CoA + glicerol-3-P acilglicerol-3-P + CoA
d) Fosfotransferazele, numite şi kinaze, transferă un rest –PO3H2 de pe
un nucleotid trifosfat (ATP, UTP, GTP) pe un acceptor, care poate fi
monozaharid, un acid sau un alcool.

În procesele catalizate de kinaze nu apare H3PO4 liber.

hexokinaza
glucoza + ATP glucoză - 6 - P + ADP
 3. Hidrolaze
• catalizează acele reacţii în care, cu intervenţia apei se desfac
legături de tip ester, eter, amidă, anhidridă, etc.
• Subgrupa - funcţie de tipul legăturii pe care o desfac,
• Denumirea derivă fie de la numele legăturii (esteraze, anhidraze), fie
de la cel al substratului asupra căruia acţionează (glicozidaze,
lipaze, proteaze).

a. Esterazele catalizează hidroliza esterilor acizilor carboxilici sau

anorganici. Dacă acidul este ac. Fosforic - fosfataze
b. Glicozidazele sunt eteraze
care catalizează hidroliza
legăturilor glicozidice din di-,
tri- şi polizaharide.
- Joacă rol în digestia
glucidelor
Exemplu
- –amilaza care hidrolizează
amidonul.
- Invertaza (zaharaza)
hidrolizează zaharoza
c) Peptidazele (proteazele) catalizează hidroliza legăturilor peptidice –
CO-NH- eliberând grupările –COOH şi –NH2 din componenţa sa.
- enzimele proteolitice ale tubului digestiv, catepsinele (intracelulare).
- ele se grupează în endo- şi exopeptidaze.

d) Hidrolaze de nucleotide, nucleozide şi acizi nucleici (nucleaze,

nucleotidaze, nucleozidaze)
– hidrolizează legături N-glicozidice, fosfodiesterice, în urma cărora:
• Acizii nucleici → nucleotide
• Nucleotide → nucleozide + ATP
• Nucleozide → riboză + bază azotată
 4. Liaze
• scindează molecula la nivelul unor legături: C–C, C–O, C–N, C–S,
C–X, dar prin alt mecanism decât hidrolazele.
a) Decarboxilazele (liaze C-C) catalizează reacţiile în care se elimină
CO2. Ex. aminoacid-decarboxilazele

b) Liaze C–O" cuprind hidroliazele sau hidratazele, care catalizează

legarea moleculei de apă la dubla legătură CC sau CO, cât şi
procesul invers (deshidratarea). Exemplu fumaraza:
H C C OO H Fumaraza HO CH C OO H
+ H2 O
H OOC C H C H2 C OO H

Anhidraza
CO2 + H 2O H 2C O3 H + + H CO3–
carbonică
 5. Izomeraze
Catalizează transformările reciproce ale tuturor tipurilor de izomeri şi se
grupează în patru subclase. Exemplu:
• Modificări funcţionale, de exemplu cetoză ↔ aldoză:

• fosfoglucomutaza, care transformă esterul glucozo–6–P în ester

glucozo–1–P şi invers:
fosfoglucomutaza glucozo - 1 - P
glucozo - 6 - P

• epimeraze, ex. transforma glucoza în galactoză şi invers:

UDP - galactoza UDP - galactoepimeraza UDP - glucoza

 6. Ligaze - sintetaze
Catalizează reacţiile de formare ale unor legături C–C, C–O, C–N,
folosind energia eliberată din ATP. Exemple:
a) ligaze C–C, ca de ex. piruvatcarboxilaza (sau piruvat-CO2-ligaza)
având ca grupare prostetică biotina:

b) ligaze C–N (ligaze aminoacid-amoniac) ca de ex. glutamin-

sintetaza, Enzima este foarte activă în creier, unde asigură
detoxifierea; se mai găseşte în rinichi şi muşchi.

glutaminsintetaza
glutamat + NH3 + ATP glutamina + ADP + Pi
 Specificitatea enzimelor

• De acţiune sau reacţie, de exemplu fosfatazele hidrolizează esteri

fosfaţi
• De substrat
– Largă – fosfataze → esteri ai acidului fosforic cu diverşi alcooli
– De grup – esteraze (hidrolizează esterii aceluiaşi alcool cu acizi
diferiţi – ex. lipaze)
– Absolută - Ureaza – hidrolizează exclusiv ureea la CO2 şi NH3
• Stereospecifică – α -amilaza hidrolizează doar legăturile α (1→ 4)
din amidon şi/sau glicogen.
 Structura enzimelor

Este subordonată acţiunii catalitice pe care trebuie să o realizeze.

Această acţiune poate fi realizată cu sau fără ajutorul unor componente
neproteice numite cofactori enzimatici.

Astfel, enzimele se pot clasifica în două mari grupe:

• Enzime simple – constituite numai dintr-o parte proteică. Aceste
enzime catalizează în special reacţii de liză.
• Enzime complexe – constituite din 2 componente:
– Componenta proteică, numită apoenzimă, responsabilă de
specificitatea de substrat a enzimei
– Componenta neproteică, numită cofactor enzimatic,
responsabilă de specificitatea de acţiune a enzimei.
 Cofactorii enzimatici
COENZIME
• substanţe organice cu masa moleculară mică;
• în principal derivaţi ai vitaminelor: NAD+ şi NADP+ din vitamina PP
(niacina), FAD şi FMN din vitamina B2, sau nucleozid-trifosfaţi ca
ATP, UTP, CTP, etc.
• Sunt ataşate labil de enzimă, putând fi detaşate de aceasta şi
ataşate altor enzime.
• Coenzimele sunt numite şi cosubstrate - participă la reacţii ca un
al doilea substrat (de ex. preiau componente ale substratului şi
apoi, într-o nouă reacţie, de asemenea enzimatică, revin la starea
lor iniţială).

GRUP PROSTETIC
• derivaţi ai vitaminelor B1 – tiamin-pirofosfat, B6 – piridoxal-fosfat,
biotină, dar şi componente diferite ca hemul şi ionii metalici.
• sunt legate covalent sau ionic (şi coordinativ, eventual) la nivelul
centrului catalitic şi nu pot fi detaşate de enzimă.
• Ionii metalici sunt cofactori la peste 2/3 din totalul enzimelor şi
intervin în funcţia catalitică a acestora astfel:
– participă la legarea substraturilor sau/şi a cofactorilor enzimatici.
De exemplu, pentru acţiunea creatinkinazei, adevăratul substrat
de reacţie este Mg2+–ATP
– stabilizează conformaţia activă a enzimei
– acţionează în procesul catalitic ca acizi Lewis sau facilitează
cataliza electrofilă
– participă nemijlocit ca şi substrat în reacţii de oxido - reducere,
unde ionul metalic furnizează electroni

• pot fi legaţi strâns de enzimă, formând metalo – enzime

• participă la reacţiile enzimatice legaţi labil (chelataţi) de enzimă sau
de substratul acesteia.
• Acţiunea unui anumit ion metalic nu este generală, fiind determinată
de partea proteică a enzimei (apoenzima) de care acesta se leagă.
• Astfel, enzime ce catalizează acelaşi tip de reacţii, pot avea, în
funcţie de ţesutul unde îşi desfăşoară acţiunea, cofactori metalici
diferiţi.
 Izoenzimele
• enzime cu funcţie catalitică identică, dar care se deosebesc prin
proprietăţi fizico - chimice diferenţiate, determinate de diferenţele
genetice între moleculele proteice.
• Ele se deosebesc în privinţa termostabilităţii, a pH-ului optim de
acţiune, constantei Michaelis, a migrării în câmpul electric.

Se pot distinge trei categorii:

• Izoenzime ale căror gene sunt total diferite. Exemplu: malat-
dehidrogenaza din citoplasmă şi din mitocondrie sunt enzime cu
structură primară total diferită.

• Izoenzime de tip heteropolimer formate prin asocieri diferite a două

sau mai multe catene polipeptidice.
• Exemplu: lactat dehidrogenaza LDH este formată din patru catene
de 2 tipuri α, β, existând 5 izoenzime: LDH1(α4), LDH2(α3β),
LDH3(α2β2), LDH4(αβ3), LDH5(β4).

• Aleloenzime ce cuprind proteine ce diferă printr-o unitate punctuală

(înlocuirea unui aminoacid cu un altul).
 Izoenzime cu aplicaţii în clinică
• Creatinkinaza (CPK) - dimerică formată din două tipuri de
subunităţi M (tip muscular) şi B (tip creier).
Se disting astfel 3 izoenzime cu structura:
– MM (muşchi scheletic) CPK3
– MB (numai în miocard) CPK2
– BB (în creier) CPK1

• Lactatdehidrogenaza – tetramerică formată din două tipuri de

subunităţi H (miocard) şi M (muşchi). Cele 2 subunităţi se pot
combina în 5 variante:
– LDH1 HHHH miocard şi hematii
– LDH2 HHHM miocard şi hematii
– LDH3 HHMM creier şi rinichi
– LDH4 HMMM -
– LDH5 MMMM ficat şi muşchi

• După un infarct miocardic, CPK2 serică creşte la 6 -18 ore după

infarct şi, de asemenea, LDH1 şi LDH2, Aceste efecte reprezintă
diagnosticul infarctului miocardic în 100% din cazuri.
• Creşterea activităţii LDH5 este asociată cu o congestie a ficatului.
 Centrul activ al enzimei
• cinetica enzimatică demonstrează:
– formarea intermediară, în cursul
acţiunii unei enzime, a unui
complex ES
– existenţa unei zone bine
circumscrise din E care stabileşte
contactul funcţional dintre E şi S,
adică legarea S de E şi asigură
desăvârşirea actului catalitic
Situsuri de legare:
- realizarea orientării sterice optime care asigură obţinerea uşoară a stării de tranziţie
- Are loc reducerea marcată a energiei de activare, caracteristică acţiunii enzimatice
- există resturi de aminoacizi cu caracter nepolar, ca Ala, Val, Leu, Ileu, Phe, care
acţionează prin stabilirea unor legături nepolare cu substratul (S).
Situs catalitic :
- realizarea actului catalitic
- desfacerea legăturilor caracteristice substratului şi
- formarea noilor legături
La acest proces participă: grupări –OH, –SH, –COO–, NH4+, imidazolil, etc. şi de
aceea situsurile catalitice sunt constituite cu participarea resturilor unor anumiţi
aminoacizi (Ser, Cis, Glu, Asp, Lis, His).
 Modul de acţiune a enzimelor

a) modelul cheii şi lacătului

Conformaţia enzimei creează regiuni
complementare (mărime, topologie,
sarcină electrică) cu substratul asupra
căruia acţionează.

b) Modelul „armonizării induse”

Datorită legării E de S, realizată la
nivelul situsului de legare, se induc în
enzimă modificări conformaţionale care
cuprind şi situsul catalitic, asigurând o
orientare corespunzătoare
("armonizare") a acestuia faţă de
substrat.
În acest fel se exercită asupra
substratului forţe de constrângere, ceea
ce contribuie la labilizarea legăturilor
conţinute.
 Mecanisme de acţiune
Cataliza acido-bazică
O OH
-2 -2
HO OPO3 O OPO3

dihidroxiaceton fosfat gliceraldehid - 3 - fosfat

His - 95
- H OH
O O
N N
O H
-2
Glu -165 OPO3
• grupările acidice sau bazice din catena laterală a aminoacizilor din situsul
activ pot servi ca agenţi de transfer de proton. La pH fiziologic, forma
protonată a His este cel mai puternic acid, ca formă de bază conjugată
cea mai puternică bază.
• Alţi acizi: SH – Cis, OH – Tyr, ε-amino-Lis, iar baze – bazele conjugate ale
formelor acide
Cataliza covalentă
• are loc prin atacul nucleofil sau electrofil al unor resturi de
aminoacizi din centrul activ al enzimei asupra substratului, rezultând
o legătură covalentă a enzimei cu substratul

Cataliza electrofilă: catenele laterale pot stabiliza intermediarii de

sarcină opusă, de exemplu anionul carboxilat din resturile de Glu,
Asp din situsul activ, poate stabiliza un carbocation. Un ion pozitiv
metalic, din centrul catalitic activ, poate stabiliza un oxianion

Cataliza nucleofilă: un agent nucleofil din enzimă (de exemplu

gruparea HO din Ser) atacă nucleofil o grupare din substrat,
formând un intermediar care este mai reactiv decât substratul
iniţial.

Exemplu: Serin-proteazele - catalizează hidroliza legăturilor esterice

şi peptidice. Ele ocupă un rol important în procesele de digestie ale
proteinelor alimentare, coagularea sângelui şi în câteva din căile de
semnalizare şi diferenţiere. Proteazele active în procesul de digestie
sunt: tripsina, chimotripsina şi elastaza. Deşi aceste enzime
prezintă un mecanism comun de acţiune asupra substratului, ele au
specificitate diferită.
Cataliza prin stabilizarea stării de tranziţie a reactanţilor
• Stabilizarea stării de tranziţie se poate realiza prin:
– Potrivirea sterică dintre centrul activ al enzimei şi intermediarul
de tranziţie; aceasta este superioară celei dintre enzimă şi
substrat
– Resturile polare din situsul activ se pot lega strâns de starea de
tranziţie care prezintă sarcini parţiale; de asemenea,
– Resturile lipofile pot stabiliza compusul intermediar

Exemplu: adenil-deaminaza
NH2 OH
H2O H2N OH
NH3 N
N N N
N HN

N N
N N N N
Riboză
Riboză Riboză

Adenozinã Intermediar Inozinã

Mecanismul enzimatic cu două substrate
În funcţie de ordinea fixării substratelor şi desprinderii produşilor de
reacţie sunt descrise 3 mecanisme de bază:
– Secvenţial ordonat
– Secvenţial aleatoriu
– Ping-pong

Mecanism secvenţial ordonat

S1 S2 P1 P2

E ES1 (ES1S2 EP1P2) EP2 E

Mecanism secvenţial aleator
S1 P2
S2
P1

E ES1 EP2

ES1S2 EP1P2

E ES2 EP1

S1 P2
P1
S2

Mecanism ping-pong

S1 P1 S2 P2

E ES1 E'P1 E' E'S2 EP2 E

Ex. mecanism ping – pong:
transaminazele - piridoxal-fosfat

 - cetoglutarat
CH2 NH2 CH2 NH2
CHO CHO
Glu E E
E E  - cetoglutarat
Glu

CH2 NH2 CHO CHO

CH2 NH2
Piruvat E + Alaninã
E E E
Piruvat Alanina
 Cinetica enzimatică
• Viteza unei reacţii catalizate enzimatic se măsoară în μmoli de substrat
transformaţi în produs / minut la 25°C şi 1 atm şi pH optim al enzimei.

• Activitatea enzimatică reprezintă numărul de μmoli de substrat

transformaţi în produs / minut la 25°C şi 1 atm şi pH optim al enzimei
de către unitatea de volum de preparat enzimatic (Litru) sau cantitatea
de enzimă.

• O unitate standard (internaţională) = 1 μmol substrat/minut de activitate

enzimatică; este cantitatea de enzimă ce transformă 1 μmol substrat /
minut.

• Activitatea specifică a unui preparat enzimatic este în funcţie de numărul

de unităţi enzimatice / mg de proteină: μmol min-1 / mg proteină.

• Constanta catalitică (katal): conform noilor recomandări ale Comisiei de

Nomenclatură Enzimatică a IUBMBiol se recomandă o nouă măsură pentru
activitatea enzimatică: katalul.
1 katal = 1 mol substrat / mol enzimă / secundă

• Viteza maximă (Vmax) este viteza reacţiei enzimatice obţinută în condiţii

de saturare a enzimei cu substrat şi în condiţii optime de pH, temperatură,
tărie ionică. Vmax este o constantă specifică fiecărei enzime.
Caracteristicile generale ale reacţiilor catalizate
• viteza reacţiei creşte proporţional cu concentraţia substratului până
la o anumită valoare (când toate situsurile catalitice ale enzimei sunt
ocupate) după care viteza rămâne constantă.
În cazul unei reacţii enzimatice deosebim trei etape:
• Fixarea substratului [S] pe enzimă [E] şi formarea complexului [ES]
• Transformarea substratului legat [ES] în produs legat [EP]
• Disocierea complexului [EP] în [E] şi [P]

k +1 k +2 k +3
E + S ES EP E + P
k -1 k -2 k -3
• La începutul reacţiei nu există P şi se poate spune că complexul
[EP] se disociază mai repede decât se formează din EP, deci K3 >
K2. Ca urmare, reacţia ce limitează viteza de formare a lui P este
reacţia a doua caracterizată prin k+2
k +1 k +2
E + S ES E + P
k -1

• Conform teoriei stării staţionare, „steady state”, în orice

moment al reacţiei enzimatice vitezele de formare şi de
disociere ale lui ES sunt egale şi [ES] = constantă.

• Leonor Michaelis şi Maud Menten au elaborat o ecuaţie ce descrie

viteza de formare a produsului în funcţie de concentraţia substratului

k  2 [Et] [S] Vmax [S]

v0  
K M  [S] K M  [S]
 Dependenţa vitezei de reacţie enzimatică
de concentraţia substratului
V

Vmax

Vmax k  2 [Et] [S] Vmax [S]

2 v0  
K M  [S] K M  [S]

KM [S]

Verificarea ecuaţiei în cazuri speciale:

[S] >> KM v0 = Vmax viteza devine independentă de [S]
[S] = KM v0 = Vmax / 2 enzimă semisaturată
[S] << KM v0 = Vmax[S] / Km
= k [S] viteza depinde liniar de [S]
Semnificaţia KM
k +1 k +2 k  k 2
E + S ES E + P KM  -1

k -1 k 1

- constanta aparentă de disociere şi

concentraţia de substrat la care enzima este
saturată pe jumătate iar viteza reacţiei este
jumătate din viteza maximă de reacţie.
-
- Valoarea KM este un indicator în
aprecierea afinităţii enzimei pentru substratul
său, valoarea KM fiind invers proporţională
cu intensitatea afinităţii. În general, afinitatea
enzimelor pentru substrat are valori:
10-5M < KM < 10-2M.
 Transformarea Lineweaver-Burke
• Reprezentarea hiperbolică v/[S] face dificilă calcularea KM şi Vmax.
Din acest motiv, se utilizează transformarea matematică a hiperbolei
în dreaptă, în care se reprezintă grafic:
1/v0 = f(1/[S]

1
v0
1 1 1 KM
 
v 0 Vmax [S] Vmax

panta = KM / vmax
1
 Vmax
1
1 [S]
KM
 Factori implicaţi în cinetica enzimatică
Influenţa conc. de enzimă
• Viteza de reacţie creşte direct
proporţional cu concentraţia enzimei
• În condiţiile în care toată cantitatea de
enzimă se găseşte sub forma (ES),
viteza reacţiei rămâne constantă

Influenţa temperaturii
• Creşterea vitezei este limitată de
temperatura la care începe ruperea
legăturilor slabe, hidrofobe şi de
hidrogen, ce menţin conformaţia
enzimei şi care produce denaturarea
enzimei şi pierderea proprietăţilor
catalitice
Influenţa pH-ului
• Sarcina electrică a moleculei
de enzimă este dependentă de
concentraţia ionilor de
hidrogen din ambianţă.
• Pe de altă parte, sarcina
electrică a proteinei - enzimă
influenţează activitatea ei;
• cele mai multe enzime au un
pH - optim de activitate
caracteristic (la care efectul
catalitic este maxim).
• pH-ul optim suferă influenţe:
- felul substratului,
- concentraţia substratului,
- concentraţia unor săruri
- temperatură.
 Activatori enzimatici
• determină stimularea activităţii enzimatice, acţiune numită activare.
• poate fi directă - stimulare nemijlocită a enzimei sau
• indirectă - prin suspendarea unui efect inhibitor.

Activarea directă are loc prin acţiunea nemijlocită asupra structurii

enzimei sau a legăturii enzimă – substrat.

• Activarea prin ioni: Mg2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Cl- (amilazei salivare)

• Activare prin alosterie

• Activarea prin "demascare".

- deblochează grupuri reactive din molecula enzimei;
- Tripsinogen  tripsină : enzimă proteolitică inactivă ca atare, se
transformă în enzimă activă sub acţiunea unei kinaze (enterochinaza,
secretată de mucoasa intestinului subţire), care îndepărtează din
tripsinogen un fragment de lanţ polipeptidic ce "maschează" centrul activ al
enzimei.
- Pepsinogen  pepsină: activat de Cl- sau însăşi pepsina.

Este un tip de reglare ireversibilă a enzimei.

Activarea indirectă
• acţiune de anti-inhibiţie şi se realizează prin îndepărtarea sau
neutralizarea unor inhibitori.
• cianura de potasiu (de altfel un inhibitor puternic al enzimelor cu
conţinut de Fe3+) este un anti-inhibitor pentru urează: ionii de cupru
care inhibă ureaza formează cu cianura un complex, lipsit de efect
inhibitor.
• grupările –SH din centrul activ al unor enzime sunt foarte sensibile
la acţiunea unor agenţi chimici (de ex. oxidanţi); vitamina C, puternic
reducătoare, protejează grupele –SH, anihilând acţiunea oxidantă;
• substanţe bogate în funcţii –SH pot acţiona protector asupra
funcţiilor –SH din enzime, prin competiţia lor cu enzima ce conţine
funcţia –SH, faţă de agentul inhibitor (glutationul, cisteina, proteine).
 Inhibitorii enzimatici

Sunt factori ce reduc sau anulează activitatea catalitică a enzimei.

Inhibitorii pot fi clasificaţi în:
– Competitivi
– Non-competitivi
– Incompetitivi
– Ireversibili
– Antienzime
 Inhibitori competitivi E + S ES [S]>[I]

- se leagă reversibil la nivelul

situsului activ, catalitic, al enzimei, E + I EI [I]>[S]
- blochează accesul substratului
(concurenţă cu substratul).
- au o structură asemănătoare cu
substratul, păcălind enzima. EI + S  ES + I
- Gradul de inhibiţie depinde de [I] > [S], echilibru deplasat în favoarea EI
raportul de concentraţie substrat / [S] > [I], echilibru deplasat în favoarea ES
inhibitor
• În cazul în care o enzimă
acţionează asupra mai multor
substanţe, acestea acţionează unul 1
V
reacţie inhibată
faţă de altul ca inhibitori competitivi.
• Cei mai eficienţi inhibitori sunt reacţie neinhibată
analogii stării de tranziţie a reacţiei,
ştiindu-se că enzima are o
eficacitate mărită pentru intermediari 1
de reacţie. Vmax
1
1 1 [S]
KM K'M
 - acţiunea acidului malonic asupra succinat dehidrogenazei
HOOC-CH2-COOH HOOC-CH2-CH2-COOH
Aplicaţii terapeutice:
efectul bacteriostatic al sulfamidelor se bazează pe competiţia PABA şi
medicamentul sulfamidă în sinteza catalizată enzimatic de acid folic.

H2N COOH H2N SO2NH2

Acid para - aminobenzoic Sulfanilamida

Inhibitori necompetitivi
• se leagă reversibil de enzimă,
• Se leagă în altă parte decât centrul activ (situs alosteric),
• deci inhibitorul nu este concurent cu substratul.
• Legarea inhibitorului induce efecte alosterice, modificând
conformaţia enzimei şi, implicit, reduce activitatea catalitică.
• Gradul de inhibiţie depinde numai de concentraţia inhibitorului
În acest tip de inhibiţie, KM rămâne nemodificat, dar modificarea
structurii enzimei o împiedică să aibă activitate maximă, deci viteza
maximă scade.
E + I → EI
reacţie inhibată
1
V
reacţie neinhibată

1
V'max

1
Vmax 1
1 [S]
KM
 Inhibitori incompetitiv
- se leagă de complexul [ES].
- raportul KM/Vmax va rămâne neschimbat,
- o dreaptă paralelă cu cea a reacţiei neinhibate.
- KM creşte iar Vmax scade
- gradul de inhibiţie depinde de concentraţia inhibitorului

k+1 k+2
E + S ES E + P
k-1 1
V reacţie inhibată
kIS kIS

ESI 1 reacţie neinhibată

V'max

1
Vmax 1
1 1 [S]
K'M KM
Inhibitori ireversibili
• substanţe ce se fixează de enzimă prin legături covalente ireversibile.
• duce la blocarea activităţii enzimei.
• Inhibitorii se pot lega fie la nivelul centrului activ, fie în alt loc.
Exemple
- Compuşii cu mercur sau iodoacetaţii reacţionează cu grupările SH
ale resturilor de cisteină libere din centrul catalitic activ;
- dietilpirocarbonatul reacţionează cu histidina din centrul activ.
Un caz particular este al metalo-enzimelor, la care blocarea ionului metalic
duce la inhibiţia enzimei: Mg2+ este blocat de EDTA.

Inhibiţia prin antienzime

• substanţe de natură proteică ce inhibă specific anumite enzime.
Exemple
- în sânge α1-antitripsina sau α1-antitrombina neutralizează enzimele
respective.
- Alfa1-antitripsina se leagă la nivel pulmonar de elastază, împiedicând
hidroliza elastinei din structura alveolelor pulmonare, împiedicând
colapsarea acestora.
- Paraziţii intestinali, de exemplu Ascaris lumbricoides, secretă
inhibitori ai tripsinei şi chimotripsinei, fapt ce le permite existenţa în
intestin.
 Inhibitori enzimatici cu efecte toxice sau terapeutice
Inhibitorul Enzima ţintă Acţiune

Acid acetil salicilic Ciclooxigenaza Antiinflamator

Penicilina Transpeptidaza bacteriană Antimicrobian

β-aminopropionitril Lisinoxidaza În boli colagenice
Enzima de conversie a
Captopril (Lopril) În HTA
angiotensinei
Atorvastatine (Tahor) HMG-CoA reductaza În ateroscleroză
Allopurinol (Zycloric) Xantin oxidaza În gută
Sildenafil (Viagra) GMP-fosfodiesteraza tip 5 În tulburări de erecţie
Selegilin Monoamin oxidaza tip B În Parkinson
Hiperplazie prostatică
Finasterine Testosteron 5 α-reductaza
benignă
Omeprazol (Mopral) H+, K+ ATP-aza Ulcer gastroduodenal
Ibuprofen Prostaglandin sintetază Procese inflamatorii
Metotrexat Dihidrofolat reductaza Cancer
Orlistat (Xenical) Lipaza gastrointestinală Obezitate
 Reglarea activităţii enzimatice
• Condiţiile schimbătoare ale mediului impun un răspuns permanent de
adaptare al organismului, răspuns materializat prin modificarea
metabolismului.
• Deoarece căile metabolice sunt succesiuni de reacţii catalizate enzimatic,
reglarea activităţii enzimatice constituie principalul element în modificările
metabolice.

Reglarea acţiunii enzimelor se realizează prin 2 mecanisme principale:

• Modificarea cantităţii de enzimă
• Modificarea activităţii enzimelor prin modificări alosterice (inhibitori,
activatori) sau modificare covalentă.

Reglarea cantităţii de enzimă

• Este un mecanism primitiv, lent, consumator de energie şi materie.

• Mecanismul presupune reglarea procesului de sinteză a enzimelor
(transcripţie, traslaţie), respectiv de catabolizare a lor şi poate fi:
• Inducţie a sintezei enzimatice: ca inductor la bacterii funcţionează
substratul, iar la mamifere semnalele hormonale.
• Represie a sintezei enzimatice: ca represor la bacterii funcţionează
produsul reacţiei, iar la mamifere, semnalele hormonale.
• Viteza de degradare a enzimelor
Reglarea activităţii enzimatice
• modularea activităţii, alosteric sau covalent, a unei cantităţi fixe de
enzimă.

Reglarea alosterică
• substanţe numite efectori.
• au în general o masă mică,
• nu seamănă cu substratul sau produsul de reacţie
• se ataşează de enzimă în altă zonă decât centrul catalitic activ.
• Ataşarea efectorului de enzimă induce modificări ale conformaţiei
acesteia, ce cuprind şi centrul catalitic activ, modificând astfel
afinitatea enzimei pentru substrat.
• În funcţie de efectul asupra activităţii catalitice, efectorii sunt pozitivi
sau negativi.
• Enzimele reglate în acest fel se numesc enzime alosterice.
Feed-back negativ (retroreglare alosterică)

Produsul reacţiei devine inhibitor al propriei sinteze

S1 S2 S3 ...... Sn P
Din punct de vedere cinetic, există 2 clase de enzime reglate
alosteric:
• Enzime din clasa K, la care efectorul alosteric afectează resturile
de aminoacizi din situsurile de legătură, în urma căruia se modifică
KM, Vmax rămânând la aceeaşi valoare.
• Enzime din clasa V la care modificările din situsurile catalitice
afectează valoarea lui Vmax, în timp ce KM rămâne nemodificat.

Efectul alosteric la enzima oligomeră ce are un singur tip de

monomer este de două tipuri:
– Homotropic – legarea efectorului la o unitate protomerică
influenţează legarea aceluiaşi ligand la ceilalţi monomeri
– Heterotropic – când legarea unui efector influenţează legarea
altui efector
• Influenţa legării efectorului la un protomer asupra celorlalţi protomeri
= cooperativitate şi ea produce o curbă sigmoidă a dependenţei
vitezei de concentraţia substratului (mecanism asemănător reglării
afinităţii pt. oxigen a hemoglobinei).
Pentru enzime oligomere cu două tipuri de monomeri, s-a constatat că
aceştia sunt:
• Subunităţi reglatoare, ce au situsuri alosterice pentru efectori
pozitivi, efectori negativi şi legare subunităţi catalitice
• Subunităţi catalitice
De exemplu, proteinkinaza A este un tetramer format din două tipuri de
protomeri 2R şi 2C. Legarea efectorului pozitiv, AMPc, la
subunităţile reglatoare (R) eliberează subunităţile catalitice (C) din
tetramerul inactiv, enzima devenind activă.

R2C2 + 4AMPC 2C + R2(4AMPC)

Reglarea covalentă
• Se realizează prin ataşarea sau detaşarea covalentă a unei grupări
din molecula enzimei.
• Cea mai frecventă modalitate este reglarea prin fosforilare –
defosforilare la gruparea OH de la resturi de Ser, Tre, Tyr
• Donatorul de fosfat este ATP,
• enzimele ce realizează procesul sunt:
– Kinaze pentru ataşarea grupării fosfat
– Fosfataze pentru hidroliza grupării fosfat
• Enzimele reglate prin fosforilare – defosforilare pot fi active:
– sub formă defosforilată (glicogen-sintetaza, piruvat-dehidrogenaza)
sau
– fosforilată (fosforilaza, triglicerid-lipaza).

• Alte modificări covalente reversibile pot consta în ataşarea – detaşarea

unui rest de AMP (adenilare) sau ADP (ADP-ribozilare).

• Există şi modificări covalente, ireversibile, atunci când molecula enzimei

suferă o hidroliză parţială în urma căreia rezultă o modificare a
proprietăţilor enzimei respective în procese ca:
– Activarea proteazelor din precursori inactivi (zimogene)
– Activarea proteazelor implicate în coagularea sângelui
– Activarea proteazelor implicate în apoptoză (moartea celulară
programată)
 Aplicaţii ale enzimelor în medicină

Determinări de enzime cu rol diagnostic

• Ţesuturile din organism suferă o reînnoire permanentă, fapt ce

implică o distrugere celulară necontenită. Acest proces de citoliză
eliberează conţinutul celulelor în circulaţia sangvină.
De exemplu, hepatocitele trăiesc un an, deci zilnic 0,3% din ficat este
distrus şi conţinutul celular deversat în plasmă. Din cauză că
enzimele hepatice din plasmă se distrug cu viteze diferite, este greu
de făcut un paralelism între conţinutul plasmatic de enzime hepatice
şi concentraţia lor în hepatocite.

Creşterea citolizei patologice poate fi efectul unor:

• Leziuni virale sau toxice (hepatite)
• Leziuni anoxice datorită absenţei vascularizaţiei (infarctul miocardic
este asociat cu necroza parţială a muşchiului cardiac)
În acest mod, măsurarea activităţii unor enzime marker poate fi
utilizată în diagnostic.
Exemple:
• LDH (lactat dehidrogenaza), cu cele 5 izoenzime pot fi separate prin
electroforeză şi cuantificate LDH1 (α4) şi LDH2 sunt caracteristice
ţesutului miocardic şi, astfel, conţinutul ridicat de LDH1 din ser poate
confirma diagnosticul clinic şi EKG de infarct miocardic.

• CK (creatin kinaza) se găseşte sub forma a trei izoenzime dimerice

(CK – musculare, CK – miocardică, utilă în infarctul miocardic la 6-8
ore după acesta, CK – cerebrale).

• Fosfataza acidă creşte în cancer de prostată.

• Amilaza şi tripsina cresc în pancreatite acute.

• Transaminazele şi izocitrat dehidrogenaza cresc în boli hepatice.

• Fosfataza alcalină creşte în icter mecanic şi boli osoase.

Enzime ca reactivi în analize biochimice
• majoritatea determinărilor de metaboliţi organici se face prin metode
enzimatice ce utilizează ca reactivi enzime.
• Aceste metode sunt mult mai exacte decât metodele chimice datorită
specificităţii deosebite pentru substratul de determinat.
• Enzimele imobilizate pe suport sunt utilizate în teste screening

De exemplu, în determinarea glicemiei se folosesc glucozoxidaza şi

peroxidaza, conform reacţiilor:

glucozoxidaza
glucoza + O2 gluconolactona + H2O2
peroxidaza
H2O2 + o - tolidina complex albastru + H2O
Tehnica ELISA

• Este o analiză cu enzime legate de imunoabsorbanţi şi se utilizează

pentru determinarea unor cantităţi foarte mici de antigen - 10-8 – 10-10
mol/l (hormoni, receptori, proteine virale, etc.). Reacţia este:

Ag + Ac-E → Ag – AcE

• AC-E – enzimă legată de anticorp

• Ag – antigen de determinat

• Complexul format, Ag-AcE, se separă de restul de Ac-E şi se

incubează cu un substrat cromogen al enzimei. Intensitatea coloraţiei
este proporţională cu cantitatea de antigen.
Enzimele ca agenţi terapeutici

• Utilizarea este îngreunată datorită distrugerii lor rapide în plasmă.

• Cercetările actuale urmăresc creşterea stabilităţii preparatelor

enzimatice şi legarea de materiale suport care să permită atingerea
prioritară a ţesuturilor ţintă:
– Modificare chimică (succinilarea asparaginazei creşte existenţa
acesteia în organism de la o oră la 17 ore)
– Încorporarea în vezicule artificiale numite lipozomi
– Încorporarea în hematii
– Cuplarea cu polietilenglicol
Pentru aparatul digestiv:
• pepsina – în hipo- şi anaclorhidrii, dispepsii iatrogene
• proteaze, lipaze, -amilaze – în colite, enterocolite, colecistopatii,
meteorisme, dispepsii de fermentaţie, de putrefacţie
Medicaţie dermatologică şi antiinflamatoare:
• endopeptidaze + hialuronidaza degradează ţesuturile alterate,
existente la suprafaţa leziunii; este facilitată penetraţia
medicamentelor în profunzimea ţesutului lezat; se asociază cu
antibiotice, corticosteroizi.
• hialuronidaza + heparina – accelerează resorbţia soluţiilor
injectate subcutanat, intramuscular; resorbţia exudatelor,
hematoamelor. NU se injecteză în ţesuturi infectate sau
modificate neoplazic.
• tripsina – favorizează vindecarea proceselor supurativ-necrotice,
stimulează fagocitoza, inhibă hialuronidaza şi penicinilaza,
prelungeşte efectul antibioticelor, neutralizează toxine bacteriene.
Este activată de Ca2+ şi inhibată de heparină şi tetracicline. Este
indicată în: procese inflamatorii ale tegumentelor, leziuni necrotice
sau purulente – arsuri, plăgi, fracturi deschise, ulcer varicos,
fistule, ulceraţii bucale.
• chimotripsina (i.m.)– are acţiune antiinflamatoare puternică. Se
recomandă în hematoame superficiale şi profunde, entorse,
edeme după fracturi, intervenţii chirurgicale
• colagenaza – îndepărtează colagenul din ţesuturile necrozate.
Medicaţe sanguină:
• streptokinaza este utilizată ca agent anticoagulant în cazul
infarctului, ea având rolul de activator al plasminei, enzimă ce va
ataca fibrina, împiedicând formarea coagulului de sânge. Este
indicată în infarct acut de miocard, tromboză venoasă profundă,
embolie pulmonară masivă acută, trombozarea protezelor
valvulare cardiace, ocluzii arteriale.
• asparaginaza este folosită în terapia leucemiei, deoarece ţesuturile
tumorale au asparagina ca necesitate nutriţională. Utilizarea
asparaginazei scade nivelul asparaginei din sânge, reducându-se
astfel şi viabilitatea tumorii

În industria farmaceutică, enzimele, imobilizate pe suport în reactoare

de sinteză, funcţionează ca şi catalizatori stereospecifici în
realizarea unor compuşi organici cu activitate biologică. De
exemplu, prin trecerea laptelui printr-un reactor cu β–
galactozidază, se hidrolizează lactoza din lapte, obţinându-se lapte
fără lactoză, aliment necesar persoanelor cu intoleranţă la lactoză.
De asemenea în reactoare cu 11–β–hidroxilază şi Δ–1,2
dehidrogenază, are loc conversia rapidă a unui precursor ieftin în
prednisolon, agent medicamentos eficace în restabilirea funcţiilor
organismului.
Enzime sintetice

• Enzime semisintetice –obţinute prin modificarea chimică a

enzimelor cunoscute, modificări în urma cărora enzimele dobândesc
noi proprietăţi catalitice. Se utilizează în acest scop enzime cu
structura primară şi spaţială cunoscută şi uşor de obţinut în stare
cristalină pură.
Exemplu: papaina este o enzimă proteolitică; fixarea chimică a unei
flavine la cisteina din poziţia 2 anihilează activitatea proteolitică şi
dezvoltă o activitate oxidoreductazică neîntâlnită anterior. O altă
metodă este mutageneza controlată prin care se modifică selectiv
un aminoacid.
• Enzime sintetice – sunt structuri ciclice a căror structură spaţială
este analogă unui situs enzimatic. Cele mai utilizate sunt polimerii
ciclici ai glucozei: ciclodextrinele (α, β, γ, după numărul de resturi
glicozilate 6, 7, 8).
• Abzime – sunt anticorpi cu funcţie catalitică. Sunt utilizaţi ca
haptene a unei structuri de tranziţie a substratului. Exemplu:
fosfaratul este starea de tranziţie caracteristică legăturii esterice din
lipide. Anticorpii obţinuţi se comportă ca nişte lipaze, crescând
viteza reacţiei de hidroliză de 103-105 ori. Se obţine, de asemenea,
o stereospecificitate de tip anomeric (metil-benzil-ester).