MÉTODOS MOLECULARES

INTEGRANTES
 JOSE
 DIGUETI
 RUBI
 ALAN
 JOSELINE
 DEFINICIÓN

ÁREA DE
Permiten la detección de porciones de (AN) (DNA o RNA) que MICROBIOLOGIA
son específicos de cada microorganismo.
Se ajusta principalmente a la detección de virus, es por ello,
que el desarrollo de técnicas moleculares comenzó en esta
área.
Para poder desarrollar un método molecular debe conocerse
parte del genoma o el genoma completo del microorganismo
que se pretende detectar, ya sea un virus, un hongo o una
bacteria.
 CARACTERÍSTICAS

FUNDAMENTO • AMPLIFICA FRAGMENTOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

TIEMPO • 1 – 7 HORAS

SENSIBILIDAD • ALTA HASTA UN 99%

ESPECIFICIDAD • NO REACCIONES CRUZADAS

ETAPA DE LA DETECCIÓN • FASE AGUA Y FASE TARDIA

CONDICIONES INDISPENSABLES PARA SU
REALIZACIÓN

MUESTRA CLINICA ADECUADA

LABORATORIO CON
ESTRUCTURA APROPIADA

PERSONAL ALTAMENTE
ENTRENADO
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS
Ventajas
• Especificidad (pueden detectar la
molécula o microorganismo de
interés).
• Sensibilidad (son capaces de detectar
la presencia de un solo
microorganismo).
• Rapidez (se puede identificar un
microorganismo en menos de 24
horas).
• Pueden ser automatizados (permiten
tener un diagnostico en un menor
tiempo y reducir los costos).
Desventajas
• No distingues entre organismos vivos y
muertos.
• Se tiene que contar con conocimientos
de secuencias especificas del patógeno
a diagnosticar.
• Se requiere del personal altamente
capacitado para el desarrollo de las
pruebas.
• Se requiere equipo mas especifico para
el diagnostico, lo cual eleva la
inversión inicial.
• Se desarrollan procedimientos con
múltiples etapas, lo que incrementa la
posibilidad de errores.
 ¿Cuándo es conveniente su solicitud?

• En patologías y situaciones donde su utilidad esta

ampliamente comprobada; la relación costo-beneficio
de su realización es positiva, ya sea porque evita
tratamientos innecesarios o porque permiten cambios
de conducta medica que son de vital importancia para
el paciente.
La mayoría de las técnicas
moleculares se basan en la
hibridación de los ácidos
nucleicos o bien en la
reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
Estas técnicas se desarrollaron a partir del conocimiento
de que dos cadenas sencillas de ácido nucleico que
tengan secuencias complementarias se pueden unir o
hibridar para formar una cadena doble. Dentro de las
técnicas de hibridación más utilizadas esta los
fragmentos de restricción de longitud polimórfica
(RFLP’s).
Los fragmentos de restricción de longitud
polimorfica (RFLPs) son un tipo
de polimorfismo que resulta de la
variación en la secuencia de
ADN reconocida por las enzimas de
restricción.
Estas son enzimas bacterianas que
utilizan los científicos para
cortar moléculas de ADN en lugares
conocidos y que se utilizan como
marcadores en los mapas genéticos.
Por lo general, para visualizar los RFLPs se
utiliza la electroforesis en gel.
1) Extracción de la ADN:
Para comenzar con, la DNA se extrae de sangre, de saliva
o de otras muestras y se purifica.

2) Fragmentación de la ADN:
La ADN purificada se digiere usando los endonucleases de la
restricción. Los sitios de reconocimiento de estas enzimas son
generalmente 4 a 6 pares bajos de largo. Cuanto más corta es la
serie reconocida, mayor es el número de fragmentos generados
de la digestión.
3) Electroforesis del gel:
Los fragmentos están negativo - cargado y se pueden separar fácilmente por la
electroforesis, que separa las moléculas basadas en su talla y carga.
Las muestras hechas fragmentos de la ADN se colocan en la cámara que
contiene el gel electroforético y dos electrodos.
Cuando un campo eléctrico es aplicado, los fragmentos emigran hacia el
electrodo positivo. Fragmentos más pequeños se mueven más rápidamente a
través del gel que sale los más grandes detrás y las muestras de la DNA se
separan así en bandas distintas en el gel.
4) Visualización de bandas:
El gel se trata con los tintes luminiscentes para hacer las bandas de la DNA
visibles.
Esta técnica se utiliza principalmente para detectar
células infectadas con un virus que tenga como
material genético ARN (retrovirus).
Dado que el ARN en una célula se encuentra como
cadena sencilla, la presencia de ARN de cadena doble
implica la replicación del virus dentro de la célula.
Esta es una técnica relativamente sencilla, dado que
incluye pocas etapas (extracción y purificación del
ARN de cadena doble y su separación en geles de
poliacrilamida).
Sin embargo, presenta la desventaja de identificar solo
células infectadas con retrovirus, sin poderse
especificar la taxonomía del virus, por lo tanto es una
técnica muy limitada.
 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La PCR se considera una

de las técnicas mas Se basa en la
sensibles y específicas replicación exponencial
de las pruebas in-vitro de ADN
moleculares

En cada uno de los

Ciclos repetidos, que
ciclos las moléculas se
constan de 3
duplican hasta que los
temperaturas
reactivos se agoten
ESQUEMA DE LA PCR

Desnaturalización

Fijación

Extensión
 RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa
con transcriptasa inversa)

Es una de las técnicas más utilizadas para identificar microorganismos cuyo

material genético es ARN (retrovirus y viroides).

PROCEDIMIENTO

 Se extrae primeramente ARN del

microorganismo en cuestión o bien de
una muestra presuntamente infectada
por uno de estos microorganismos.
 Acto seguido el ARN se somete a una temperatura generalmente de 80°C para linealizar el ARN dado
que es por lo general una cadena sencilla y tiende a formar estructuras secundarias y terciarias.
 Posteriormente se le añade un iniciador complementario y se coloca a una temperatura entre 37 y
40°C para que se alinee el iniciador con la cadena complementaria.
 Se coloca la reacción a 4°C con lo cual se detiene.
 Después se coloca una enzima denominada reverso transcriptasa la cual se va a encargar de formar
ADN tomando como molde el ARN de cadena simple y un extremo del iniciador cuando el ADN ya ha
sido formado se procede a realizar la reacción del PCR, esta técnica puede ser realizada en un solo
paso si se añaden todos los reactivos en un mismo tubo y se programan las temperaturas específicas
y para cada etapa.

80° C