Duplicación y Transcripción

ADN

CONTENIDO:

-Composición y estructura del ADN.

Organización genética del ADN.

-Reacciones de replicación del

ADN en procariotes y eucariotes.

-Fragmentos de Okasaki.
Reacciones de reparación del ADN.
Mutaciones.
 COMPONENTES DEL ADN

 El ADN está
compuesto por dos
polinucleótidos
enormes, cada uno
de ellos con forma de
hélice, una doble
hélice.
 NUCLEOTIDO

Compuesto orgánico formado

GRUPO por tres componentes: un
FOSFATO o radical del ácido fosfórico, un
RADICAL azúcar y una base nitrogenada
DEL ACIDO BASE NITROGENADA
FOSFORICO

citosina

Las bases nitrogenadas absorben

intensamente la luz UV corta , en
la longitud de onda de 259nm
(medio importante para el dosaje
rápido de ácidos nucleicos)
AZUCAR (DESOXIRRIBOSA)
 BASES NITROGENADAS

Las bases nitrogenadas pueden formar “uniones de hidrogeno” (uniones

relativamente lábiles) en algunos de sus átomos al encontrarse en la
vecindad inmediata de otro compuesto similar; este es el fundamento de
las uniones complementarias de las bases de las dos hélices.
 AZUCAR (DESORRIBOSA)
Desoxirribosa (ADN)

4 1
3 2

ribosa (ARN)

4 1
Por medio del grupo
3 2 oxhidrilo se unen a dos
ácidos fosfóricos diferentes
en cada cadena de ADN y
determinan la “polaridad”
 ION FOSFATO

El Ion fosfato presenta 3

valencias capaces de
combinarse. se pueden unir al
carbono 5 o 3 menos al C2 ya
que carece del grupo oxhidrilo

Los nucleótidos usados en la síntesis

de ADN poseen el fosfato unido al C5
ya que el ADN se lee en sentido 5-3

En el ADN, 2 valencias de cada fosfato se unen con 2 desoxirribosas

distintas y queda una valencia libre por cada fosfato, lo que le da un
carácter fuertemente ácido y su característica carga negativa
 ADN

 El fosfato de cada nucleótido convierte al ADN en un

polímero con carga negativa, es decir, un polianión. Por
ello las cargas negativas (como la de otros ácidos
nucleicos) lo repelen.

 En cambio las cargas positivas pueden ser de cationes

comunes como son el Na+ y el K +( monovalentes) y
mucho más las de cationes divalentes como el Ca++ o
el Mg++ hacen precipitar los ácidos nucleicos.
ESTRUCTURA DEL ADN
 La “forma B” o ADN
fisiologico sigue un
trayecto de hélice
derecha, es decir, las
hélices giran en el
sentido de las agujas del
reloj.Ancho: 2,3nm , 10
nucleótidos por cada
giro y 0.34 nm entre
cada par de base.
2,3nm
 ESTRUCTURA DEL ADN

-La única forma de unión entre las dos hélices está dada por las uniones
hidrógeno entre las bases de una y otra cadena uniones que son muy débiles
individualmente, pero que sumadas a lo largo de un segmento, pueden unir
fuertemente las dos hélices.
-Además, dos hélices derechas, para ser complementarias , deben “caminar” en
sentidos opuestos; es decir; antiparalelas, lo que se observa mejor al mirar la
posición de las desoxirribosas en cada una de las cadenas: mientras una
avanza con el C5 la otra lo hace con el C3.
 ESTRUCTURA DEL ADN
 La columna vertebral de cada hélice está
formada por los iones fosfato que establecen
uniones con dos desoxirribosa contiguas
(uniones fosfodiéster), de manera que la ruptura
de una unión fosfodiéster significa cortar una de
las dos cadenas o hélices.

 En el espacio, las bases nitrogenadas quedan

situadas hacia el centro de la columna formada
por la doble hélice mientras que las columnas
vertebrales de fosfatos quedan hacia fuera.

 En el espacio existente entre las dos columnas

vertebrales exteriores, formadas por las uniones
fosfodiéster, cabe exactamente un par de bases,
una grande (purina) y una chica ( pirimidina)
solo permitirá C-G, G-C, A-T, o T-A.
 GENOMA PROCARIOTA
 Tamaño:Ejm. E. coli 4.6 Mb que
codifican alrededor de 4300
genes(1Mb=1x10 6 bases)
 Capacidad codificadora son
compactos y continuos
contienen poco DNA no
codificador
 Expresión génica: Los genes
están organizados en
operones. Un operón es un
conjunto de genes ligados que
están regulados como una
unidad. Una cuarta parte de los
genes están organizados en
operones.
 Pueden presentar pequeñas
piezas de DNA “plásmidos”
genes no esenciales para el
desarrollo pero si para su
supervivencia
GENOMA EUCARIOTA
 Tamaño del genoma: mucho más
grande que procariotas
 Capacidad codificadora:
Secuencias no codificadoras
extensas Solo el 1,5% del
genoma humano codifica
proteinas.
 Continuidad codificadora: La
mayoría son discontinuas. Las
secuencias no codificadoras
(intrones) están intercaladas entre
las secuencias
codificadoras(exones).
 Presentan repeticiones tandem:
Son secuencias de DNA en las
que muchas copias están cerca
unas de otras. Se denominaron
originalmente DNA satélite
varían desde 10pb hasta 2000pb
 REPLICACION DEL ADN

 Replicación es el proceso
mediante el cual el DNA
produce copias de si
mismo que garantizan la
transmisión y
conservación de la
información genética que
contiene. Tiene lugar
antes de cada división
celular.
 Características (E.coli)
 La replicación es semiconservadora: En
cada ciclo de replicación se mantiene
intacta una de las hebras paternas que se
combina con una de las hebras recién
sintetizadas.
 Fue demostrado mediante los
experimentos realizados por M. Meselson
y Stahl en 1957
 La replicación empieza en un
punto de origen
 J.Cairns y colaboradores
(1963) observaron
moléculas de DNA en su
fase de replicación
,marcada con Timina
radioactiva. Concluyeron
que en E. coli se inicia en
un lugar específico del
cromosoma(oriC) y avanza
de manera bidireccional
 El punto dinámico de la
replicación se denomina
horquilla de replicación
 La síntesis del DNA transcurre en dirección 5’ a
3’ y es semidiscontinua
 Las cadenas de DNA siempre
son sintetizadas en la
dirección 5 3, siendo el 3’OH
libre el punto de elongación
del DNA

 En 1960 Okasaki descubrió

que una de las hebras es
sintetizada de modo
continuo(cadena conductora)
y la otra es sintetizada de
modo discontínuo(cadena
rezagada). Los fragmentos de
Okasaki tienen una longitud
variable entre cientos a
millares de nucleótidos.
 Polimerasas múltiples en las
células
 DNA polimerasa I: Caracterizada por Korn-
berg(1955)No es la enzima que replica la mayor
parte del DNA en E. coli. Juega un papel crítico
en la replicación y reparación del DNA. Tiene
actividad exonucleásica 5’ 3 y 3’ 5’
 DNA POLIMERASAS

-Las DNA polimerasas son las responsables

de la síntesis del DNA.
-Catalizan la adición de un desoxinucleótido
trifosfato (dNTP) complementario al
extremo 3'OH de una cadena
polinucleotídica.
 DNA POLIMERASAS

 Todas la DNA polimerasas requieren para

su actividad lo siguiente:
 Una hebra de DNA que sirva de molde.
 Una cadena cebadora o primer con un
extremo 3'OH libre.
 Los 4 desoxiribonucleótidos trifosfatos.
 Mg++
 Se requiere de un cebador
 El cebador es una cadena preformada a cuyo extremo 3’
se adicionen dNTPs.
 El cebador es un corto segmento de RNA
Enzimas y proteínas accesorias
 DNA helicasa, se mueve a lo largo del DNA
separando las hebras . Usa ATP.
 DNA girasa, libera el stress topológico de la
estructura del DNA, hace cortes en las 2 hebras
del DNA y produce la rotación de las hebras del
DNA.
 Primasa, Sintetiza los cebadores o primers, los
cuales son segmentos cortos de RNA.
 Proteínas SSB , (Single Strand Binding)
proteínas que se unen a una cadena simple de
DNA , mantienen las hebras separadas .
 Helicasas

 Separan las hebras del DNA al frente de la

horquilla replicativa en movimiento.

 En E. coli se han usado los nombres de helicasa

II y proteína rep.
 Topoisomerasas
Cambian el estado de superenrrollamiento del
DNA. Las mejores estudiadas son:

 DNA girasa que induce la formación de súper

enrollamientos negativos a expensas del ATP

 Topoisomerasas del tipo I tienden a producir

relajamiento del DNA superenrrollado
 Proteínas fijadoras

 Las proteinas de fijación a hebras sencillas(ss

binding) no consumen ATP y no presentan
actividad enzimática.

 Su papel es mantener las hebras separadas el

tiempo suficiente y protegerlas del ataque de las
nucleasas.
 Sintesis del DNA en procariotas
1.-INICIACIÓN
 Desenrrollamiento del DNA: Se abre la hélice
del DNA y establece el complejo precebador.
 La proteina dnaA se une en la región de
repeticiones de 9 pb en el origen y desnaturaliza
la región de repetición de 13pb. Requiere ATP y
proteina HU.
 Proteina dnaB (helicasa) en presencia de dnaC
desenrrollan el DNA dúplex.
 ETAPAS DE LA REPLICACION

 La síntesis de una molécula de DNA puede

dividirse en 3 etapas: iniciación , elongación y
terminación. Cada una de ellas se diferencia por
las reacciones y enzimas que intervienen.

 En general cualquier reacción de polimerización

puede dividirse en 3 etapas que también
ocurren durante la síntesis del RNA y síntesis de
proteínas.
 INICIACION

 La iniciación de la síntesis del DNA en E. coli

empieza en oriC , que es el origen de la
replicación cromosómica.
 OriC , es una región del cromosoma de 245
pares de bases (pb), que tiene 2 conjuntos de
secuencias conservadas .
 3 repeticiones en tamden de una secuencia de
13 pb en un extremo del origen.
 4 copias de una secuencia de 9 pb distribuidas
en orientaciones invertidas en el otro extremo
del origen.
 Iniciación en E. coli

 El complejo de DnaA denatura las

repeticiones de 13 pb y forma un
"complejo abierto" de 45 bp. Esta reacción
también requiere ATP.
 Iniciación en E. coli
 Un complejo formado por las proteínas DnaB y
DnaC se une a la región denaturada para formar
un "complejo precebador" o "complejo
prepriming" . La proteína DnaB es una helicasa
que desenrolla el DNA bidireccionalmente y
crea dos horquilla de replicación potenciales.
 En presencia de las proteínas SSB y la DNA
girasa, La DnaB desenrrolla aún mas el DNA.
Esto permite la entrada de la primasa ( producto
del gen DnaG).
 PRIMOSOMA
• La iniciación de la replicación requiere de un
complejo que se conoce como primosoma ,
compuesto de la proteína helicasa o DnaB y de la
primasa o DnaG.
• Sus funciones son:

 Separar las hebras en la horquilla de replicación

 Catalizar la síntesis de los cebadores.
 2.Síntesis del cebador
 La formación de segmentos cortos de RNA que
se denominan cebadores, necesarios para la
iniciación de la replicación del DNA está
catalizada por la primasa, una RNA polimerasa
 Se denomina primosoma a un complejo
multienzimático que contiene primasa y varias
proteinas auxiliares
 ELONGACION

 Es un proceso en el cual participan muchas

proteínas
 La cadena lider (leading) es sintetizada en forma
continua en dirección 5'->3’
 La cadena retrasada (lagging) es sintetizada en
dirección 5'->3’ pero en forma discontinua.
 ELONGACION

 RNA primers o cebadores, son segmentos de

RNA de 1 a 60 nt complementarios a una
cadena patrón de DNA.
 En E. Coli son sintetizados por la RNA
polimerasa y por la primasa.
 Síntesis de la hebra guía

 La síntesis de esta hebra se realiza en forma

continua. El RNA cebador o RNA primer es
sintetizado por la primasa y luego la DNA
polimerasa III sintetiza el DNA procesivamente
hasta el final.
 Síntesis de la hebra retrasada

 La síntesis de esta hebra se realiza en forma discontinua

y en dirección opuesta al movimiento de la horquilla de
replicación
 Se sintetiza usando fragmentos cortos, llamados
fragmentos de Okazaki, los cuales son unidos a aquellos
que fueron sintetizados previamente.
 Los RNA cebadores con el que empieza cada
fragmento de Okazaki tiene que ser retirado
 3.-Síntesis de DNA
 La holoenzima polimerasa III es la principal enzima que
sintetiza DNA en los procariotas
 Está formada por al menos 10 subunidades.
 La polimerasa central está formada por tres
subunidades: alfa, épsilon y theta.
 La proteina beta forma un anillo alrededor de la cadena
molde de DNA.
 El complejo gamma formado por cinco subunidades
reconoce las cadenas sencillas de DNA con cebadores y
transfiere la proteina beta a la polimerasa central
 Modelo del Replisoma

 La hebra guía se asocia al complejo de manera directa.

 La hebra retrasada se asocia al complejo envolviéndose
alrededor de este.
 De esta manera, tanto las hebra guía como la hebra
retrasada pueden replicarse al mismo tiempo por
intermedio de un complejo de proteínas que se mueven
en una sola dirección
 Modelo del Replisoma

 El modelo del Replisoma, tiene como finalidad

tratar de explicar los movimientos contradictorios
que ocurren durante la síntesis del DNA.
 En este modelo todas las proteínas que deben
estar presentes en la horquilla de replicación
forman un complejo grande. Sin embargo, la
manera como las 2 hebras que están siendo
replicadas se asocian con el complejo es distinto.
 Replisoma

 La máquina de replicación del DNA que se

denomina replisoma está formado por dos
copiasde la pol III, el primosoma y las proteinas de
desenrollamiento del DNA.
 La hebra guía o conductora se sintetiza de forma
continua. La hebra retrazada se sintetiza en
fragmentos de modo que la polimerización
5’ 3’ conduce al crecimiento global en el sentido 3’
5’.
 Esto se puede lograr por la formación de un
bucle del molde para la hebra retrazada
 El molde de la hebra retrazada pasaría
entonces a través del centro polimerizador de
una subunidad de una polimerasa III dimérica,
en el mismo sentido que el molde de la hebra
guía en la otra subunidad
 La DNA polimerasa III abandona el molde de la
hebra retrazada después de que se ha añadido
1000 nucleótidos a esta hebra. Entonces se
formaría un nuevo bucle.
Unión de fragmentos de DNA
 Cuando se completa la replicación ,las
brechas entre los fragmentos de la hebra
retrazada se rellenan por la actividad de la
DNA polimerasa I que también utiliza su
actividad exonucleásica para eliminar el
cebador ribonucleotídico.
 Finalmente la DNA ligasa enlaza estos
fragmentos de DNA
 Terminación
 Las secuencias ter se encuentran dispuestas en
el cromosoma en dos grupos con orientación
opuesta
 Los cromosomas recién completados quedan
encadenados, es decir ligados topológicamente
 En E. coli la topoisomerasa IV corta
transitoriamente las dos hebras de uno de los
cromosomas , permitiendo que el otro
cromosoma pase a través de la rotura.
 REPLICACION EN EUCARIONTES

 La replicación en eucariontes es un
proceso mucho más complejo que la
replicación en bacterias
 El DNA de eucariontes es mucho más
grande y está organizado formando una
estructura nucleoproteica compleja como
es la cromatina.
 DNA POLIMERASAS DE EUCARIONTES

 Los eucariontes tienen 5 DNA polimerasas dos

de las cuales (alfa y delta) son importantes para
la replicación de los cromosomas eucarióticos

 La velocidad de síntesis del DNA en las células

eucarióticas es solo 50 nucleótidos por
segundo, cerca de un décimo de la velocidad de
la síntesis del DNA bacteriano.
 REPLICACION EN EUCARIONTES

 Los cromosomas de eucariontes tienen

múltiples orígenes de replicación.

 En la levadura se les conoce como

secuencia de replicación autónoma o ARS
. La levadura tiene aproximadamente 400
elementos ARS en 12 cromosomas.
 Replicación eucariótica
 Los índices de desplazamiento de la horquilla
no exceden los 30000 pb por minuto, velocidad
considerablemente menor que en E. coli

 Sin embargo el ciclo replicatorio se completa en

horas gracias a factores de compensación :

1.Las células eucarióticas contienen un gran

número de moléculas de DNA polimerasa
(superior a 20000 en comparación a las dos
docenas de moléculas encontradas en E.coli.
 Replicación eucariótica
2. Las moléculas de DNA polimerasa inician la
síntesis bidireccional no en uno sino en varios
puntos de iniciación a lo largo del cromosoma
Los segmentos situados entre dos puntos de
iniciación se denominan replicones . Por lo tanto
para una molécula que tiene 1000 replicones se
puede producir la replicación de ,manera
simultánea en un máximo de 2000 horquillas
 La expresión de la
información genética
contenida en un segmento
de DNA siempre requiere la
síntesis de una molécula de
RNA.

 Durante el proceso de
transcripción , una
enzima, llamada RNA
polimerasa, convierte la
información genética de
un segmento de DNA en
una hebra de RNA con
una secuencia
complementaria a una de
las hebras del DNA.
Formas de la RNA polimerasa
 La enzima núcleo, compuesta de 2 subunidades
alfa, una subunidad beta y una subunidad beta prima.
Es capaz de copiar ambas hebras del DNA pero
carece de especificidad.

 La RNA polimerasa holoenzima, es la forma

totalmente funcional de la enzima. Consiste de la
enzima núcleo más el factor sigma. Tiene
especificidad y reconoce señales específicas de inicio
de transcripción en el DNA conocidas como regiones
promotoras, debido a la presencia del subunidad o
factor sigma que reconoce las regiones promotoras y
que luego de la iniciación se disocia.
 Requerimientos de la RNA
polimerasa

 Para su actividad la RNA polimerasa

requiere:
 Un DNA molde
 Mg ++ o Mn++
 Los cuatro ribonucleósidos trifosfatos
(ATP, GTP, UTP, CTP)
El molde es el DNA
El RNA es sintetisado de 5’ a 3’
 Mecanismo general de la
transcipcion

 La RNA polimerasa requiere un DNA de

doble cadena como molde. Sin embargo
durante la transcripción de un gen en particular,
sólo una de las hebras del DNA llamada hebra
anti-sentido o hebra molde (antisense
strand) , es copiada a RNA. La hebra de DNA
complementaria a la molde se le llama hebra
con-sentido (sense strand).
 PROMOTORES

 La síntesis del RNA se inicia en un

promotor

 Un promotor es una secuencia de DNA a

la cual la RNA polimerasa se une, para
posteriormente iniciar la transcripción.
 Secuencias de consenso
 Reveladas por la comparación de las
secuencias de muchos promotores
bacterianos.

 Están localizadas aproximadamente 10 y

35 pares de bases cuesta arriba del
punto de iniciación
 Secuencias de consenso

 Exhiben homología.

 La secuencia de consenso -10 es: TATAAT

(caja TATA).

 La secuencia de consenso -35 es:

TTGACA
Ambas hebras codifican genes
 Pasos de la Transcripción

 La RNA polimerasa se desliza a través del

DNA buscando promotores.

 Cuando encuentra un promotor migra a la

región -35, formando lo que se conoce
como "complejo cerrado".
 Pasos II
 Luego el DNA es desenrollado en
aproximadamente 17 pares de bases formando
un "complejo abierto" que empieza en la
región -10, y que descubre la hebra molde en el
sitio de iniciación.
 Después de la iniciación la subunidad sigma se
disocia de la RNA polimerasa y la enzima
núcleo con el proceso de elongación de la
transcripción.
 Elongación

 Subunidad sigma se separa.

 El RNA sintetizado forma un híbrido
transitorio de 12 bp. con el DNA.
 50 nucleótidos por seg.
 El DNA se enrolla detrás de la RNA
polimerasa y se desenrolla delante de ella.
 No hay prueba de lectura.
 Terminación
 1. Terminación independiente de factor,
que consiste en una secuencia de nucleotidos
que permite la formación de una región
apareada con forma de alfiler en el mRNA
seguida de un tramo de residuos de uracilo (U).
 1. Terminación dependiente de factor,
requiere de un factor proteico. El sitio de
terminación llamado rut (el nombre viene de rho
utilization) , es reconocido por un factor
específico llamado rho.
Transcripción en eucariontes

 Esta compartamentalizada debido a la

presencia de la envoltura nuclear.

 El RNA naciente de eucariontes es

procesado para formar el RNA maduro.
Transcripción en Eucariontes

 Los eucariontes tienen 3 tipos de RNA

polimerasa.

 Todas nucleares.

 La alfa-amanitina ,es una toxina extraída

de un hongo, se une a la RNA polimersa e
inhibe la elongación
 RNA Polimerasa II
 Más compleja que la RNA pol de E. Coli.
 Consiste de 10 polipéptidos (10 –220 kD).
 RPB1, RPB2 y RPB3 son esenciales
equivalen a las subunidades beta, beta
prima y alfa respectivamente.
 RPB4 a la subunidad sigma
 RPB5, RPB6 y RPB8 son componentes
esenciales de las 3 RNA polimerasas de
eucariontes.
 Promotores de Eucariontes

 Tienen una caja TATA cerca al sitio de inicio.

 Otros elementos adicionales de control están
localizados entre -40 y –110.
 Los promotores fuertes tienen:
 - caja CG
 - caja CAAT
Promotores: Procariontes Vs
Eucariontes
Transcripción Eucariontes
 Maduración Postranscripción.

 El producto inmediato de la transcripción es una

molécula de RNA precursora, el transcrito primario,
que se modifica posteriormente dando una molécula
funcional madura.

 La suma de las reacciones enzimáticas que

conducen a las moléculas de RNA funcionales
maduras se denomina: tratamiento, maduración o
elaboración de RNA-proteína.

 Están implicados procesos como : modificaciones de

bases, modificaciones de azúcares, formación de
hélices, formación de complejos RNA proteína, etc.