Macam-macam teknik Identifikasi

 Bakteri yang telah diisolasi dari berbagai sampel

(makanan, obat, kosmetika) harus diketahui identitas
nya untuk memastikan spesies bakteri yang
mengkontaminasi sediaan farmasi
 Ada beberapa teknik identifikasi yang digunakan:
Teknik API 20E System
 The API 20E system atau Enterotube II syatem are
used in the clinical laboratory for the identification of
enteric bacteria
 Among them are :
 Escherichia coli (opportunistic urinary tract infections),
 Proteus mirabilis (opportunistic urinary tract infections),
 Shigella dysenteriae (bacillary dysentery),
 Salmonella typhi (typhoid fever), and
 Yersinia pestis (plague).
 1. Pewarnaan
 Pewarnaan Gram hanya dapat membagi 2 kelompok
bakteri berdasarkan komposisi dinding sel nya
 2. Penggunaan media Selektif
 3. Hasil reaksi biokimia
 Teknik API20E System
 Biolog
 4. Deteksi Gen Spesifik
 Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).
Principles
 The API 20E System is a standardized, miniaturized version of
conventional biochemical procedures used in the identification of
Enterobacteriaceae and other gram-negative bacteria.
 A total of 127 taxa can be identified with this system.
 It is a ready-to-use, microtube system that performs 22 standard
biochemical tests on pure bacterial cultures from appropriate, primary
isolation media.
 This system consists of a strip containing 20 chambers (figure 35.1),
each consisting of a microtube and a depression called a cupule.
 The tubes contain dehydrated substrates.
 The substrates are rehydrated by adding a bacterial saline suspension.
 To create anaerobic conditions, sterile mineral oil is added to several of
the microtubes.
Teknik API 20E System
 The strip of microtubes is then incubated for 18 to 24 hours
at 35° to 37°C so that the bacterium can act on the
substrates.
 The strip is read by noting color changes after the various
indicator systems have been affected by the metabolites or
added reagents (table 35.1).
 The identification of the unknown bacterium is
 achieved by determining a seven-digit profile index
number and consulting the API 20E Profile
Recognition System or the API 20E Profile Index
Booklet.

 Charts can also be used to determine the unknown

 bacterium (see appendix G).
Biolog System
 Metoda Biolog dirancang untuk mengidentifikasi
bakteri, jamur dan yeast berdasarkan reaksi biokimia
yang terjadi karena perbedaan sumber karbon yang
terdapat didalam 95 lubang mikroplate.
 Mikroplate Biolog pertama kali diperkenalkan pada
tahun 1989.
 Sumber karbon ini berasal dari polimer, gula, gula
fosfat, asam amino, alkohol, asam karboksilat.
 Disetiap lubang mikroplate terdapat indikator
tetrazolium yang akan tereduksi oleh reaksi yang
terjadi antara bakteri dengan sumber karbon yang
tersedia.
 Reaksi yang terjadi sangat khas untuk setiap jenis
bakteri oleh karena itu disebut “metabolic fingerprint”.
 Hasil ini akan dibandingkan dengan database yang
ada pada software MicroStation Reader (MicroLog™).
 Database Biolog mempunyai data 2.112 spesies bakteri
aerob, bakteri anaerob, yeast dan jamur.
beberapa rangkaian pengujian
yang harus dilakukan:
 1. Uji pengelompokan bakteri dengan menggunakan
pereaksi KOH 3%.
 Suspensi berbentuk lendir menandakan bakteri gram
negatif sedangkan suspensi encer menandakan bakteri
gram positif.
 Prinsip reaksi ini yaitu perbedaan ketebalan dinding sel,
bakteri gram negatif dinding selnya lebih tipis sehingga
dengan hanya penambahan KOH 3% dinding selnya
pecah.
 Sedangkan gram positif memerlukan lisozim untuk
memecah dinding selnya.
 2. Uji oksidase dengan menggunakan oxidase test-
strip
 Enzim sitokrom oksidase dapat aktif karena terjadinya
transfer elektron ke molekul oksigen.
 Adanya molekul oksigen pada enzim oksidase mampu
mereduksi substan-substan organik seperti N,N-
dimetil-1,4-fenilen diamonium diklorida dan naftol yang
terdapat dalam oxidase test-strip.
 Warna biru violet pada test strip menunjukan positif
bakteri non enterik dan untuk bakteri enterik tidak
terjadi perubahan warna pada oxidase test-strip.
 3. Uji katalase dengan penambahan pereaksi hidrogen
peroksida
Uji ini bertujuan untuk mengelompokan bakteri aerob
dan anaerob dengan mendeteksi keberadaan enzim
katalase.
Enzim ini hanya terdapat pada bakteri yang mempunyai
metabolisme aerobik.
Reaksi positif bakteri aerob ditandai dengan
terbentuknya gelembung gas setelah penambahan
hidrogen peroksida.
Sedangkan bakteri anaerob tidak terbentuk gelembung
gas
 4. Pembacaan hasil dengan menggunakan
MicroStation Reader (MicroLog™)
 Sebelum kultur bakteri diinokulasikan ke mikroplat,
terlebih dahulu koloni bakteri tersebut disuspensikan
dengan larutan inokulasi gram negatif atau gram positif.
 Kemudian diukur transmitannya dengan menggunakan
Biolog Turbidimetri.
TEKNIK PCR
 Pengertian PCR
 Apakah PCR itu ?
 PCR merupakan singkatan dari Polymerase Chain
Reaction atau reaksi rantai polimerase

 Ditemukan pertama kali oleh Kary B. Mullis tahun 1985

 Merupakan suatu teknik amplifikasi rantai DNA yang

diinginkan secara in vitro.

 PCR memungkinkan untuk dihasilkannya produk DNA

sebanyak mungkin dari hanya beberapa kopi DNA awal.
 Ini jelas terlihat bahwa PCR bisa digunakan untuk
menghasilkan sejumlah DNA yang bisa dideteksi hanya
dari satu molekul saja pada awalnya.

 PCR bisa digunakan untuk mengidentifikasi,

mengkarakterisasi dan menganalisa bagian spesifik
dari DNA maupun RNA.

 Mikroorganisme dapat diidentifikasi secara PCR

karena mempunyai DNA.
 Prinsip terjadinya reaksi akibat adanya sifat komplementasi
(=berpadanan) rantai DNA dengan pasangannya dan
dimanipulasi melalui tiga tahapan suhu:

 denaturasi ( pemisahan rantai ),

 annealing ( penempelan primer ),
 extension :perpanjangan rantai oleh DNA Polimerase.
Primer :
adalah potongan pendek rantai DNA
Biasanya terdiri 18 – 24 nukleotida
Didesain berkomplemen dengan
rantai DNA templat ,
dan menjadi titik batas multiplikasi
segmen DNA target.

DNA target (template DNA ) :

adalah segmen DNA
yang dimultiplikasi dalam reaksi PCR
dengan titik batas primer kiri
dan primer kanan.
Secara teoritis, jika efisiensi reaksi pelipatgandaan seratus persen,
Dan dilakukan putaran 30 siklus reaksi rantai
( denaturasi-penempelan-perpanjangan ) maka PCR akan dihasilkan
sebanyak kurang lebih satu milyar molekul DNA target.

Reaksi komplementasi DNA terjadi sangat spesifik sedemikian rupa

sehingga dapat dipakai dalam identifikasi bakteri yang
mengkontaminasi sediaan farmasi dan sampel biologis lainnya.
Mesin PCR
 Hasil perbanyakan DNA kemudian di elektroforesa
untuk memisahkan potongan-potongan gen.
 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 K- M

Bobot molekul
10.000 bp

1500
1000 bp
bp

750 bp

500 bp
385 bp

250 bp

Gambar . Hasil elektroforesis amplifikasi gen ctx pada Vibrio cholerae

dengan metoda PCR pada gel agarosa 1.2%