Sunteți pe pagina 1din 43

Studiul celulelor prin

folosirea coloranţilor

1
COLORAREA / IMPREGNAREA

- etapă critică în realizarea


preparatului microscopic
permanent pentru MO
- în ME, etapa corespunzătoare:
contrastarea (citrat de plumb şi
acetat de uranil)
2
COLORARE A
Etapa prin care se urmăreşte creşterea
contrastului dintre diferitele componente

3
COLORANTUL HISTOLOGIC
Substanţă colorată, de obicei de natură
organică, ce poate interacţiona cu
diferitele componente celulare,
permiţând astfel diferenţierea lor
optică
N.B. Nu toate substanţele colorate sunt
coloranţi!

4
COLORANŢII
(caracteristici chimice)
- grupări cromofore – purtătoare de culoare
- grupări auxocrome – capacitatea de a colora
(asigură interacţiunea cu substratul)
1. Ionizate (principale) – formează legături
electrochimice cu substratul
2. Neionizate (secundare) – formează legături de
hidrogen cu substratul (măreşte stabilitatea
interacţiunii colorantului cu substratul

5
CLASIFICAREA COLORANŢILOR

După provenienţă:
Naturali:
- vegetali: hematoxilina, safranina, orceina,
turnesolul
- animali: carminul
Sintetici: albastru de metil, eozina, acid picric,
fuxina
6
CLASIFICAREA COLORANŢILOR
După caracterele chimice:
Acizi (sunt de obicei săruri de acizi organici): ex. eozina
- gruparea auxocromă principală are sarcină (-)
- se ataşează pe un substrat morfologic cu sarcini (+)
Bazici: ex. hemalaun
- gruparea auxocromă principală încărcată electric (+)
- deci se va ataşa pe un substrat încărcat (-)
Neutri
- amestecuri de coloranţi bazici şi acizi într-o anumită
proporţie
- tetraoxid de osmiu
7
MECANISMUL COLORĂRII

Fixarea coloranţilor, prin grupările auxocrome,


de componente biochimice din celule/ţesuturi
(grupările funcţionale din proteine, din acizi
nucleici, din structuri glucidice – oligo-, poli-
zaharide)

8
MECANISMUL COLORĂRII
Colorantul bazic (ex. hemalaunul) leagă
substrat acid (acizii nucleici) din nucleu
colorându-l în nunaţe de albastru-închis
la violet

Colorantul acid (ex. eozina) leagă substrat


bazic (proteinele) din citoplasmă care va
apărea, de regulă, colorată în roz/roşu
9
Evidenţierea componentelor
celulare (hemalaun-eozină)

10
ETAPELE COLORĂRII

1. Deparafinarea
2. Hidratarea
3. Mordansarea (la nevoie)
4. Colorarea propriu-zisă
5. Spălarea
6. Deshidratarea
7. Clarificarea
11
METODE DE COLORARE
(clasificare)
1. În funcţie de momentul colorării
2. După numărul de coloranţi utilizaţi
3. După mecanism
4. După metoda de obţinere a coloraţiei
optime
5. În funcţie de raportul dintre rezultatul
colorării şi culoarea colorantului

12
1. Momentul colorării
Coloraţii vitale:
A: intravitale – colorantul vital este încorporat de
animal în timpul vieţii;
- substanţa colorată este încălzită la temperatura corpului, se injectează i.v.
sau intraperitoneal, operaţie care se repetă câteva zile. După sacrificarea
animalului se recoltează câteva piese care se expun la aer până ce apare
colorarea. Ea persistă numai atâta timp cât celulele supravieţuiesc in vitro.

B: postvitale – colorantul este pus în contact cu


celule şi ţesuturi scoase din organism, încă vii

Coloraţii permanente:
- pentru colorarea preparatelor permanente 13
1. Momentul colorării: Coloraţii vitale
Coloranţi vitali bazici: ex. – albastru de metilen,
roşu neutru, verde Janus;
În microscopia fotonică cu contrast de fază, mitocondriile
apar foarte net, în special după coloraţii supravitale cu verde
Janus, albastru de metil. Acestea se deplasează în masa
citoplasmatică, se deformează şi dau muguri laterali care se pot
detaşa.

Coloranţi vitali acizi: ex. – albastru de tripan,


albastru de pirol, carmin litinat.
- colorează specific organite, sunt reţinuţi doar în anumite
celule, histiocite, unde se acumulează în citoplasmă sub formă
de granule de colorant.
-- realizează numai coloraţii intravitale, punând în evidenţă o
funcţie celulară 14
1. Momentul colorării: Coloraţii vitale
-verde Janus B- - albastru de tripan-

N.B. albastru de tripan se foloseşte în cazul culturilor celulare


ca “test de viabilitate celulară” 15
1. Momentul colorării:
colorații permanente: COLORAȚIA MASSON
(colorație tricromă )
1. hematoxilină ferică
2. soluţia colorantă A
(cu fuxină acidă)
3. soluţia colorantă B
(cu albastru de anilină)

REZULTATE
1. Nuclei – negru
2. Citoplasma – roşu – violet deschis
3. Fibrele de colagen – albastru intens 16
2. Număr de coloranți
a. colorații simple – folosesc un singur colorant
(ex. colorația Giemsa)

b. colorații combinate (policrome) – folosesc 2


sau mai mulți coloranți
i. Succesivă – ex. hemalaun - eozină
ii. Simultană – ex. azan (coloraţie tricromă)

17
2. Număr de coloranți:
colorații simple- COLORAȚIE GIEMSA

Fibroblaste in cultura

18
2. Număr de coloranți:
colorații combinate- COLORAȚIE AZAN
-Trahee-
1. azocarmin C
2. albastru Heidenhein
(cu anilină şi orange G)

REZULTATE
Nuclei – roşu – viu
Citoplasma – roşu
Fibre de colagen – albastru deschis
Ţesut muscular striat – roşu , orange sau galben
19
3. Mecanismul colorării
- colorație directă:
asigurată de simpla interacţiune dintre colorant
şi substrat

- colorație indirectă:
necesită prezenţa unui mediator (MORDANT- ex
ac. tanic), între colorant şi substrat. Acesta
intermediază fixarea colorantului de
componentele celulare/tisulare.
20
4. Metoda de obţinere a
coloraţiei optime
- progresive – prin imersări succesive
până se ajunge la momentul optim de
colorare (ex. H.E.)

- regresive – prin acţiunea prelungită a


colorantului, până la obţinerea unei
supracolorări, apoi se acţionează cu un
agent chimic decolorant (diferenţiator):
ex. coloraţia Nissl
21
colorație progresiva:
COLORAŢIA HEMALAUN-EOZINĂ (HE)
cea mai utilizată colorație

Foloseşte 2 coloranţi:
1. hemalaunul – colorant
bazic
2 . eozina – colorant acid

REZULTATE
nucleu: albastru – violet
citoplasma: roz – roşu
22
4. Metoda de obţinere a coloraţiei optime
colorații progresive colorații regresive
Colorație H.E. Colorație Nissl- corpii Nissl
se colorează în violet (SN)

23
5. Rezultatul colorării versus
culoarea colorantului
- ortocromatică – substratul se colorează
în aceeaşi culoare ca şi cea a colorantului
(majoritatea)

- metacromatică – substratul se colorează


în altă culoare decât cea a colorantului
(ex. albastru de toluidină)

24
Colorație ortocromatică – VAN GIESON
(colorație tricromă) folosită în anatomia
patologică

1. hematoxilină ferică
2. acid picric
3. fuxină acidă

REZULTATE
1. Nucleii – negri
2. Citoplasma – galben
3. Fibrele de colagen – rou intens
25
METACROMAZIA

Capacitatea unui substrat de a se colora într-o


altă culoare decât cea a colorantului
PRINCIPIU:
- existenţa unor grupări funcţionale plasate regulat, la o
distanţă suficient de mică una de alta
- colorantul se dispune ordonat şi foarte aproape
moleculă de moleculă permiţând reaşezări ale
electronilor la alte nivele energetice şi absorbţia de alte
lungimi de undă din spectrul vizibil

26
Colorație metacromatică –
ALBASTRU DE TOLUIDINĂ
granulaţiile din mastocite se colorează metacromatic
în roşu – violet

metacromazie
27
IMPREGNĂRILE METALICE
PRINCIPIU: precipitat de metal redus, după ce
se leagă în formă ionică pe diferitele elemente
din ţesuturi, evidenţiind structuri care în mod
obişnuit nu se colorează.
(cele mai folosite sunt impregnările cu săruri de
Ag, Au, Os, Hg)

- IMPREGNAREA ARGENTICĂ – folosită pentru


evidenţierea elementelor din ţesutul epitelial sau
conjunctiv şi în studierea sistemului nervos
(structurile vizate apar brun-negre)
28
IMPREGNARE ARGENTICĂ

Fibrele de reticulină Evidenţierea prelungirilor


apar colorate în negru neuronale în negru

29
COLORAŢII TOPOGRAFICE
- utilizate pentru evidențierea celulelor în
ansamblul țesutului
(cele prezentate pană acum)

COLORATII CITOLOGICE
- utilizate pentru evidențierea anumitor
organite / structuri celulare

30
METODA CAJAL DA FANO
evidenţierea complexului Golgi

REZULTATE

Nucleii: necoloraţi

Aparatul Golgi – reţea


perinucleară de culoare
neagră

Citoplasma – aurie
31
METODA REGAUD
(HEMATOXILINĂ FERICĂ)
- evidenţierea mitocondriilor

REZULTATE

Nucleii – necoloraţi

Nucleolul – gri

Mitocondriile –
granulaţii negre
32
METODA FROTIURILOR
se realizează întinderea celulelor în
monostrat, pe o lamă de sticlă
Pot fi examinate :
1. celulele sangvine
2. celulele epiteliale descuamate sau
exfoliate
3. sedimentele celulare
4. amprente de ţesuturi sau organe
parenchimatoase
33
Calitățile unui bun frotiu:
• subţire – cu un singur strat de celule
• întins uniform
• ambele margini pe lamă
• se termină în franjuri pe lamă (ocupând cca.
2/3 din lungimea acesteia)
• (la marginea liberă se scrie numele pacientului
sau un număr de ordine)

34
METODA PANOPTICĂ PAPPENHEIM
( M.G.G.) – colorație topografică
• pentru colorarea frotiului sangvin

1. soluţia May-Grünwald – conţine EOZINAT DE


ALBASTRU DE METILEN solubilizat în amestec de
alcool metilic şi glicerină neutră
2. soluţia Giemsa – conţine EOZINAT DE
AZUR DE METILEN solubilizat în
amestec de alcool metilic şi glicerină neutră
35
Paşii executării unui frotiu sangvin

recoltare
întindere (se folosesc două lame de sticlă)
- lama portobiect – cea pe
care se efectuează frotiul
- lama executoare – cu care
se întinde frotiul, prin glisare
la un unghi de 45
uscare (fixare fizică)
36
colorare - FROTIUL SANGVIN- coloraţie M.G.G.
Rezultate:
granulocite agranulocite
Nucleu: violet Nucleu: violet
Citoplasma – roz Citoplasma – albastru

Granulaţii:
- neutrofile : roşu-violet
- bazofile : albastru închis
spre negru
- eozinofile: roşu-portocaliu

37
HISTOCHIMIA – Modalitate de evidenţiere
specifică a unor biomolecule în ţesuturi
HISTOCHIMIA GLUCIDELOR – permite evidenţierea:
- structurilor glucidice de pe proteine (glicoproteine,
proteoglicani) şi de pe lipide (glicolipide)
- polizaharidelor (glicogen)

N.B. Mono- sau di-zaharidele nu se pot evideţnia


deoarece sunt solubile şi se pierd în timpul pregătirii
probelor

• METODA PAS (periodic acid-Schiff)


• METODA CU CARMIN AMONIACAL BEST
• BAZOFILIA (pentru cele încărcate negativ)
• METACROMAZIA
38
HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
METODA PAS – evidenţierea CARMIN AMONIACAL BEST
glicoproteinelor evidenţierea glicogenului
(celule caliciforme din mucoasa (celule hepatice)
intestinală)

39
HISTOCHIMIA LIPIDELOR
PRINCIPIU:
colorantul este mai solubil în lipide decât în propriul solvent,
acumulându-se în incluziunile lipidice

SUDANOFILIA

 Coloranţi Sudan :
 III – roşu-portocaliu

 IV – roşu

 B – negru

 BB – albastru

celule adipoase în mezenter 40


HISTOENZIMOLOGIA: evidenţiază
localizarea enzimelor pe baza activităţii lor
ETAPELE OBŢINERII UNUI PREPARAT CITOENZIMOLOGIC

• recoltarea

• fixarea – prin congelarea rapidă la temperaturi foarte joase

• secţionarea

• incubarea cu substratul – într-un mediu care oferă enzimei


condiţii cât mai apropiate de cele în vivo.

• montarea – se realizează în mediu hidrosolubil – glicerină


41
sau sirop Apathy
HISTOENZIMOLOGIE
METODA PEARSE: evidenţiază METODA GÖMÖRY: captură
dehidrogenazele fosfat de plumb (incolor) care se
transformă în sulfură de plumb
(succinatdehidrogenaza- SDH (neagră) – evid. activităţii
enzima marker a mitocondriilor) fosfatazelor
- celule musculare striate- -pol apical al nefrocitelor -

42
Concluzii
Aţi luat cunoştinţă de numai o parte dintre
posibilităţile de studiere a celulelor la microscopul
optic prin folosirea coloranţilor

Metodele sunt specifice histologiei şi citologiei

43