Escuela para Graduados

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Universidad Nacional de Córdoba

MARCADORES GENÉTICOS

Córdoba, abril 2018

 Marcadores Genéticos

 Son puntos de referencia ubicados en los

cromosomas (genes o secuencias de ADN sin
función específica) asociadas a un carácter de
interés.
 Caracteres que presentan polimorfismo o
variabilidad experimentalmente detectable en
individuos de una población segregante y un tipo
de herencia predecible según las leyes de
Mendel.
Características deseables en un buen marcador:

 Detección fácil y rápida en todas las clases fenotípicas

(expresión codominante).
 Ausencia de efectos que alteren la expresión del carácter
principal.
 Expresión temprana en el desarrollo del individuo.
 Ausencia de interacciones con el gen marcado y con
otros marcadores.
 Alto nivel de polimorfismos (gran número de variantes).
 Distribución homogénea a lo largo del genoma
(construcción de mapas).
 Consumo mínimo de material biológico para su
identificación.
 Marcadores Genéticos

Clasificación

Los polimorfismos se detectan a través

del producto de la expresión de los genes

Marcadores Morfológicos
Marcadores Bioquímicos
 Marcadores Morfológicos

Son características fenotípicas fácilmente detectables, que

pueden ser evaluados con métodos sencillos y de bajo costo.
 Marcadores Morfológicos

Desventajas

 Su número es limitado.
 Están influenciados por el ambiente.
 No cubren todo el genoma.
 Tienen bajo nivel de polimorfismo.
 Generalmente se expresan como dominantes.
 Con frecuencia muestran efectos pleiotrópicos y de
interacción génica
 Muchos se expresan en tejidos específicos o en una etapa
particular de desarrollo del individuo.
 Marcadores Bioquímicos

Isoenzimas o proteínas de reserva, de extracción y análisis

relativamente sencillo, rápido y de bajo costo.
 Isoenzimas

Diferentes formas moleculares de una enzima, que poseen

una actividad catalítica común (actúan sobre el mismo
sustrato).

Mutaciones en el ADN que codifica estas enzimas pueden

resultar en cambios en la composición de aminoácidos,
generando proteínas con la misma actividad biológica pero
con diferente carga neta y por lo tanto con diferentes
velocidades de migración en un campo eléctrico.

Estas diferencias determinan patrones característicos de

migración electroforética de las formas isoenzimáticas.
 Enzimas monoméricas: los individuos homocigotas
presentan una banda y los heterocigotas presentan la
suma de ambas.
 Enzimas diméricas, tetraméricas, etc.: los individuos
heterocigotas presentan bandas adicionales no presentes
en los homocigotas, que se generan por la combinación
de sub-unidades codificadas por los distintos alelos o loci

Locus isoenzimáticos Pgd-3 de girasol con dos variantes

alélicas (Martínez et al., 2010)
 Proteínas de reserva

Son un grupo heterogéneo de proteínas presentes en la

semilla de la planta, cuya función es proveer de energía al
embrión en los primeros estadios de crecimiento y que se
relacionan directamente con la calidad del grano.

En la mayoría de los cereales, estas proteínas están

codificadas familias de genes que a lo largo de la evolución
sufrieron una serie de rearreglos cromosómicos, que serían
los responsables de generar un alto nivel de polimorfismo
proteico entre y dentro de especies.
En trigo, las principales proteínas de reserva del grano son las
gluteninas y gliadinas.

Estas proteínas han mostrado un alto grado de polimorfismo

en el número y la movilidad electroforética y muchos de estos
polimorfismos son utilizados como marcadores genéticos
para mejorar la calidad panadera del trigo.

Gluteninas de trigo separadas mediante electroforesis en

geles de poliacrilamida (Martínez et al., 2010)
 Marcadores Bioquímicos

Utilidad

 Determinación de variabilidad y estructura genética de

poblaciones.
 Estudios de sistemática y biología evolutiva.
 Descripción de germoplasma.
 Identificación de variedades.
 Construcción de mapas genéticos (limitada por el escaso
número de marcadores isoenzimáticos disponibles)
 Marcadores Bioquímicos

Desventajas

 Si bien su número es alto no es ilimitado.

 Presentan poco polimorfismos (2 - 4 alelos)
 No son suficientes para realizar mapas saturados
 En algunos casos, el ambiente de crecimiento y la edad
del individuo influyen en la expresión.
 Se ve afectada la reproducibilidad de los zimogramas
(isoenzimas).
 Codificadas por familias multigénicas, no se puede
asumir independencia entre los loci (proteínas de
reserva).
 Marcadores Genéticos

Clasificación

Los polimorfismos se detectan a nivel de la

secuencia de pares de bases del ADN, tanto de
genes como de secuencias no codificantes

Marcadores Moleculares
 Marcadores Moleculares

Constituidos por fragmentos de ADN, de tamaño variable,

codificantes o no codificantes:
 Su número es ilimitado.
 Tienen alto nivel de polimorfismo..
 No están afectados por el ambiente.
 Se distribuyen a lo largo de todo el genoma.
 Muchos son codominantes.
 No muestran efectos de interacciones y pleiotropía
 Pueden detectarse en cualquier tipo de tejido y en
cualquier etapa de desarrollo del individuo.
 Marcadores Moleculares

RFLPs AFLPs Microsatélites

 Mapa genético
del tomate basado
en marcadores
morfológicos

Griffiths et al., An introduction to genetic analisys (8th Ed., 2005)

Mapa genético del tomate basado en
marcadores moleculares

(Cambiaso, 2017)
 Marcadores Moleculares

Utilidad

 Estudios de variabilidad y diversidad genética en distintas

especies.
 Identificación de genotipos.
 Mapeo de genes.
 Selección asistida por marcadores
 Clonado posicional de genes basado en mapa
 Estudios forenses
 Marcadores Moleculares

Ideal
 Altamente polimórfico (dentro y entre especies)
 Codominante (diferenciar individuos heterocigotas de
homocigotas).
 De rápida identificación y simple análisis.
 Alta reproducibilidad.
 Marcadores Moleculares

Basados en la digestión del ADN con

endonucleasas de restricción y la
hibridación con sondas específicas

 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

 VNTR (Variable Number of Tandem Repeat)
 RFLPs

Variabilidad generada en el tamaño de los fragmentos

producidos por la digestión con una enzima de restricción del
ADN de los individuos de una población.

Un RFLP puede ser producido por cualquier suceso que

altere la longitud del fragmento de restricción detectado por
la sonda:
 ausencia de un sitio de restricción.
 presencia de un nuevo sitio de restricción.
 presencia de una inserción en un fragmento de restricción.
 presencia de una deleción en un fragmento de restricción.
RFLPs
RFLPs
 RFLPs

Ventajas:
 Número de marcadores potencialmente ilimitado
 Alta cobertura del genoma
 Codominantes
 Alto nivel de polimorfismo

Desventajas:
 Requiere gran cantidad de ADN de buena calidad
 Requiere sondas específicas para la especie en estudio
 El uso de radiactividad genera altos costos.
 Proceso laborioso y difícil de automatizar
Autorradiografía de marcadores RFLP (Ferreira y
Grattapaglia, 1998)
Patrón de bandeo de RFLP del Gen 16Sr RNA de
Fitoplasmas digerido con RsaI, en distintos individuos:
calles 1 – 8: individuos analizados, M- marcadores de
tamaño molecular
 VNTRs o Minisatélites

Son secuencias idénticas adyacentes que se repiten en número

variable (hasta 50 veces por locus), que de 10 a 100 pb y
están dispersos por todo el genoma.

El número de segmentos repetidos en un locus determinado

varía entre individuos.

Los minisatélites se obtienen por digestión enzimática y se

detectan con sondas constituidas de secuencias con los
motivos de repetición (core sequence)
 VNTRs

Son tan polimórficos que

producen patrones de
bandas muy complejos,
haciendo que a veces sea
muy difícil identificar los
alelos correspondientes a
cada locus.
 VNTRs

Son muy útiles para la identificación de individuos o la

verificación de parentesco, pero no son tan útiles para el
mapeo genético.
 Marcadores Moleculares

Basados en la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR)

 RAPD (Random Amplification of Polymorfic DNA)

 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
 SSR (Short Sequence Repeats)
 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
 RAPDs

Generados por la amplificación por PCR de secuencias

de ADN genómico con parejas de cebadores octa o
decanucleotídicos seleccionadas al azar.
 RAPDs

Ventajas:
 No requieren conocimiento previo del genoma
 Genera un número ilimitado de marcadores.
 El polimorfismo es elevado.
 Proveen una amplia cobertura del genoma.
 Son más polimórficos que los RFLPs.
 La técnica es rápida, simple y económica.
 RAPDs

 La herencia es dominante.
 La interpretación de bandas presenta dificultades.
 Una banda no contiene necesariamente un único
fragmento de ADN.
 Una banda del mismo tamaño en dos individuos no
representa necesariamente el mismo fragmento de
ADN.
 Poseen problemas de reproducibilidad.
 Son difíciles de transferir a otros laboratorios.
 RAPDs

Utilidad:
 Estudios de diversidad genética.
 Estudios taxonómicos.
 Determinación de pureza híbrida.
 Establecimiento de genealogías.
 Elaboración de mapas genéticos saturados.
 Mapeo de genes.
 Identificación de material vegetal.
Perfiles RAPD de diferentes especies del género Jatropha L. con los
primers OPL 5 (1–7) e IDT E 4. (8–14). Línea 1 & 8—J. tanjorensis; 2
&9—J. curcas; 3 & 10—J. glandulifera; 4 & 11—J. gossypifolia;5
&12—J. multifida; 6 & 13—J. podagrica; 7 & 14—J. Integerrima
(Biol. Rep. 2009, 36: 901-907)
 AFLPs

Combina características de RFLP y RAPD al

amplificar selectivamente por PCR fragmentos de
restricción obtenidos tras digestión total de un AND
genómico.
Obtención de AFLP:
 Digestión del ADN genómico con enzimas de
restricción (usualmente dos).
 Los fragmentos obtenidos se ligan a adaptadores de
secuencia conocida (20 pb) y se amplifica por PCR.
 Luego se amplifica una subpoblación de fragmentos
mediante cebadores complementarios de cada uno de
los adaptadores pero con uno o dos nucleótidos extra
en el extremo 3’ (solo los fragmentos que contengan
esa base extra serán amplificados).
 Finalmente se separan los fragmentos en geles de
acrilamida y se detectan por radioactividad o
fluorescencia.
 AFLPs

Ventajas:
 No requieren conocimiento previo del genoma.
 Permiten analizar todo el genoma.
 La combinación de enzimas de restricción,
adaptadores y cebadores hace que el número de
AFLPs posibles sea ilimitado.

Desventajas:
 Herencia dominante.
 Bajo contenido de información genética por locus.
 Procedimiento medianamente laborioso.
 Su costo es elevado.
Patrón de AFLP de diferentes especies del género Jatropha L. con amplificación
selectiva con los primers CAT/EAAG, (1–7); M-CAA/EACA (8–14) and
MCAA/EACT (8–14). Lane 1, 8 & 15—J. curcas; 2, 9 & 16—J. tanjorensis; 3, 10 &
17—J. glandulifera; 4,11 & 18—J. gossypifolia; 5, 12 & 19—J. multifida; 6, 13 &
20—J. podagrica; 7,14 & 21—J. integérrima (Mol. Biol. Rep. (2009), 36: 901-907.)
 SSR o Microsatélites

Son secuencias cortas de ADN repetidas en tándem (1 a

10 pb).

El número de repeticiones puede variar entre 10 y 100.

Son muy abundantes y pueden encontrarse en cualquier

parte del genoma (tanto ADN nuclear como organular).

Se detectan mediante PCR con cebadores específicos de

secuencias flanqueantes.
 SSR o Microsatélites

Ventajas:
 Polimorfismo muy elevado (multialélicos)
 Son codominantes
 Interpretación sencilla de los resultados
 Reproducibilidad muy alta
 Resultados transferibles entre laboratorios
 Posible automatización
Desventajas:
 Requerimiento de conocimientos previos sobre el
genoma de la especie en estudio.
 Alto costo para desarrollar los cebadores.
Olivo: Microsatélite DCA09 - Motivo repetido (GA)7-29
(Costero, 2017)
Orden de Siembra
1: MPM fermentas 50 pb
2: 1R (Arbequina referencia España)
3: 1aM (Arbequina Junín Mendoza)
4: 1A (Arbequina 4 Soles Cruz del Eje (A1 4S)
5: 3A (Arbequina 21 kg el Condor 21 Kg 8 (A8Ec)
6: 4cent (Arauco Centenario)
7: 4Olly (Arauco Hollantay)
8: 5As (Ascolano El Condor)
9: 7aM (Empeltre Junín Mendoza)
10: 7Emp (Empeltre Las Playas (Emp LP)
11: 8aM (Farga Junín Mendoza)
12: 8Fa (Farga Las Playas (FaLP)
13: MPM fermentas 50 pb
14: 9aM (Frantoio Junín Mendoza)
15: 9Fr (Frantoio 4 Soles (2Fr 4S)
16: 16Obl (Oblonga Facultad (Obl Fac)
17: 11R (Manzanilla Sevilla Referencia España)
18: 11eM (Manzanilla Aceitera Junín Mendoza)
19: 12Ma (Manzanilla 4 Soles (Ma 4S)
20: 13Ma (Manzanilla Gigante 4 Soles (3 Mg 4S)
21: 14aM (Nevadillo Blanco Junín Mendoza)
22: 14bM (Nevadillo Negro Junín Mendoza)
23: 15Ne (Nevadillo 4 Soles (Ne 4S)
24: MPM fermentas 50 pb