► La ligadura de Ub y proteínas similares a Ub a sustratos

generalmente requiere una cascada de tres enzimas que incluye

una enzima activadora de E1, una enzima conjugadora de E2 y
una ligasa E3.
► Las ubiquitina ligasas (CRL) de cullinRING comprenden la clase
más grande de ligasas E3. En el núcleo catalítico de estos
complejos multisubunidad E3 hay una proteína de la familia de
la cullina (Cul-1, 2, 3, 4A, 4B y 5) y una proteína que contiene
el dominio RING Rbx1 o Rbx2. Rbx1
► Las CRL son activadas por la proteína Nedd8 similar a Ub.
► Nedd8 modifica una lisina conservada en el dominio C-terminal
de todas las cullinas.
► Nedd8 (neddylation) de cullinas mejora las actividades E3 de
las CRL y evita que el inhibidor de CRL CAND1 se una a los
andamios E3.
► La unión de CAND1 a cullinas bloquea los sitios de unión para
proteínas adaptadoras y NEDD8 y, por lo tanto, actúa como un
inhibidor del ensamblaje y activación de CRL. También se ha
demostrado que la presencia de NEDD8 elimina el sitio de
unión a CAND1 del CRL.
(A) Las CRL no modificadas contienen una brecha desconcertante entre
el Ub E2 acoplado a Rbx1 y el sustrato reclutado por el receptor de
sustrato y la proteína adaptadora de CRL.

(B) La estructura muestra que la conjugación de Nedd8 induce un

cambio conformacional importante en el dominio C-terminal de Cul5
que no solo elimina un sitio de unión para el inhibidor CRL CAND1 sino
que también desplaza completamente el dominio RING de unión a E2
de Rbx1 de la cullina.
► El dominio Cullin N-terminal recluta proteínas adaptadoras que
se unen a los receptores de sustrato, que también están
involucradas en la regulación de las CRL.
► La dimerización de algunos receptores de sustrato CRL mejora
la eficiencia de la ubiquitinación del sustrato
 La vía de conjugación
NEDD8 y su relevancia en
la biología y terapia del
cáncer
► La degradación de proteínas por el UPS es un proceso altamente
regulado.
► Los proteasomas degradan las proteínas que están marcadas con
cadenas de poliubiquitina.
► Hay 3 subclases amplias de ligasas E3: dominio HECT, dominio de dedo
RING y E3 de U-box.
► Hay ligasas E3 diferentes, definidas según el dominio que se
encuentra en su proteína central: HECT (homólogo al terminal
carboxi E6-AP), dedo RING (Really Newing realmente
interesante) y U-box E3.
► Dentro del dedo RING E3 hay 2 subclases. Los dedos E3 de RING
simples contienen el dominio RING de unión a E2 y el dominio
de unión a sustrato dentro del mismo polipéptido.
► Las ligasas de cullina-RING (CRL) son complejos
multicomponentes basados en un núcleo de proteína de cullina
estrechamente asociado con la proteína que contiene el
dominio del dedo RING, RBX1 / 2
► La formación de la cadena de poliubiquitina es catalizada por
una serie de enzimas.
► En el primer paso, la enzima activadora de E1, EAU, activa la
ubiquitina y la transfiere mediante una reacción de
transtiolación a una de las muchas enzimas E2.
► El E2 cargado con ubiquitina colabora con ligasas E3 específicas
para catalizar la formación de la cadena de poliubiquitina en la
proteína sustrato reclutada por esa ligasa.
► Cada cascada es iniciada por un E1 único; Los UBL y sus E1
incluyen NEDD8 (enzima activadora NEDD8, NAE), SUMO-1, -2, -
3 (enzima activadora de SUMO, SAE), ATG8, ATG12 (ambos
ATG7), ISG15 (Uba7), Urm1 (Uba4), Ufm1 (Uba5) y FAT10
(Uba6).
► La vía NEDD8 desempeña un papel crítico en la activación de la
actividad de la ubiquitina E3 ligasa de CRL E3s.
► Este proceso de neddylation ha demostrado ser esencial para la
ligasa E3 actividad de las CRL.
► NEDD8 es una proteína de 81 aminoácidos con una masa
molecular relativa de 9 kDa y es 60% idéntica y 80% homóloga a
ubiquitina.
► NEDD8 tiene una enzima activadora E1 dedicada (AppBp1 /
UBA3 o NAE) y enzimas E2 conjugadora (UBC12, UBE2F).
► Otros componentes de la vía de neddylation incluyen DEN1, que
procesa NEDD8 a su forma madura de 76 aminoácidos, y el
complejo de señalosoma COP9, que es responsable de eliminar
NEDD8 de las proteínas de cullina.
► CAND1 (cullinassociated y neddylation-dissociated) es un
componente adicional que regula el ensamblaje complejo de
CRL al unirse a la cullina en ausencia de activación de NEDD8.
► El paso inicial en la cascada NEDD8 es la maduración de NEDD8.
Deneddylase humano 1 (DEN1) (NEDP1) o SENP8,23 es
responsable de procesar la forma precursora de NEDD8 en la
forma madura mediante la eliminación de 5 residuos de
aminoácidos de su cola C-terminal.24-26
► DEN1 es altamente específico para el precursor NEDD827 y no
procesa otros precursores de UBL.
► NAE es un heterodímero que consiste en las proteínas AppBp1 y
Uba3 y es estructural y mecánicamente similar a UAE y al otras
enzimas activadoras de UB.
► NAE es altamente selectivo para su UBL afín, que en este caso
es NEDD8. En el primer paso en la activación de NEDD8, MgATP
y NEDD8 se unen a NAE y forman NEDD8-AMP.
► NEDD8-AMP posteriormente reacciona con el sitio tiol activo de
la enzima para formar un tioéster NEDD8-NAE, junto con la
liberación de AMP.
► Una segunda ronda de unión de MgATP y NEDD8 da como
resultado la formación de un segundo NEDD8-AMP, produciendo
un ternario complejo capaz de transferir NEDD8 a 1 de sus 2 E2.
► NAE es capaz de reconocer sus 2 E2 distintos a través de una
combinación de la flexibilidad de esta interacción hidrofóbica
específica y flexibilidad conformacional.
► La conjugación de NEDD8 a cullina activa la actividad ubiquitina
ligasa de la CRL, y la eliminación de NEDD8 por el signalosoma
COP9 facilita la disociación de los componentes de la CRL
► Los complejos de anillo de cullina no sindilados se unen a
CAND1 hasta que se reclutan para formar una nueva CRL.
► El inhibidor específico de NAE MLN4924 forma un aducto
covalente con NEDD8 en una reacción catalizada por NAE,
bloqueando la enzima en un estado inactivo
► Estas ligasas de múltiples subunidades consisten en una proteína
central de cullina estrechamente asociada con la proteína RBX1 / 2
que contiene el dominio del dedo RING. La proteína cullina debe ser
modificada por NEDD8 para activar la actividad de la holoenzima
ubiquitina ligasa. Neddylation, similar a la ubiquitinación, es iniciado
por un E1 específico para NEDD8, NAE.
Conjugación de NEDD8
Los E2s UBC12 y UBE2F y CRL neddylation.
NEDD8 se transfiere del complejo ternario NAE a 1 de 2 E2
específicos de NEDD8, UBC12 y UBE2F, mediante una reacción de
transtiolación.
La especificidad de la vía NEDD8 está mediada por una
interacción única entre NAE cargado con NEDD8 y sus E2 afines
que promueve la formación de tioéster NEDD8-E235.
UBC12 se empareja específicamente con la proteína RING box 1
(RBX1), que se asocia con cullinas 1 a 4 en complejos CRL,
mientras que UBE2F se empareja con RBX2, para mediar en la
neddylation de cullina 5.
► Se ha demostrado que la neddylation del andamio de cullina da
como resultado reordenamientos conformacionales en la
estructura del complejo CRL.
► Estos reordenamientos son esenciales para la actividad de ligasa
CRL, proporcionando geometrías catalíticas apropiadas para que
un E2 asociado transfiera ubiquitina a una molécula de sustrato
unida.
► La desnedilación de CRL está mediada por el signalosoma COP9
(o CSN), un complejo de proteínas que comprende 8
subunidades.
► NEDD8 se elimina por la actividad metaloproteasa del motivo
JAMM en la subunidad CSN5, desactivando así las CRL.
► Aunque Deneddylation por CSN apaga la actividad
ubiquitinadora de CRL in vitro, CSN ha demostrado ser esencial
para la actividad de CRL in vivo.
► Se desconoce si la modificación de Nedd8 del dominio C-
terminal de cullina induciría algún cambio conformacional en el
dominio N-terminal, y viceversa.