Sunteți pe pagina 1din 67

Rezultatele tipizării genetice probelor ale materialului biologic investigat

şi a frecvenţei de prezenţă a alelelor depistate.


O porţiune din Bucata din Mecanismul de
Constantinescu Două porţiuni din
ştreangul pentru urciucul căruţei fixare din faţă a
Sistemul individualizat Zosim gloabele căruţei
cal din lemn coşului căruţei
(Nr. 421-2011) (Nr. 426-2011)
(Nr. 422-2011) (Nr. 424-2011) (Nr. 425-2011)
D8S1179 12 – 14 12 – 14 12 – 14 12 – 14 12 – 14
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,1404 – 0,2135 0,1404 – 0,2135 0,1404 – 0,2135 0,1404 – 0,2135 0,1404 – 0,2135
D21S11 30 – 31.2 30 – 31.2 30 – 31.2 30 – 31.2 30 – 31.2
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,2521 – 0,0946 0,2521 – 0,0946 0,2521 – 0,0946 0,2521 – 0,0946 0,2521 – 0,0946
D7S820 10 – 10 10 – 10 10 – 10 10 – 10 10 – 10
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,2722 – 0,2722 0,2722 – 0,2722 0,2722 – 0,2722 0,2722 – 0,2722 0,2722 – 0,2722
CSF1PO 10 – 11 10 – 11 10 – 11 10 – 11 10 – 11
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,2421 – 0,3191 0,2421 – 0,3191 0,2421 – 0,3191 0,2421 – 0,3191 0,2421 – 0,3191
D3S1358 16 – 18 16 – 18 16 – 18 16 – 18 16 – 18
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,2278 – 0,1648 0,2278 – 0,1648 0,2278 – 0,1648 0,2278 – 0,1648 0,2278 – 0,1648
TH01 6–6 6–6 6–6 6–6 6–6
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,2049 – 0,2049 0,2049 – 0,2049 0,2049 – 0,2049 0,2049 – 0,2049 0,2049 – 0,2049
D13S317 9 – 11 9 – 11 9 – 11 9 – 11 9 – 11
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,0774 – 0,2980 0,0774 – 0,2980 0,0774 – 0,2980 0,0774 – 0,2980 0,0774 – 0,2980
D16S539 11 – 12 11 – 12 11 – 12 11 – 12 11 – 12
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,3195 – 0,3023 0,3195 – 0,3023 0,3195 – 0,3023 0,3195 – 0,3023 0,3195 – 0,3023
D2S1338 17 – 25 17 – 25 17 – 25 17 – 25 17 – 25
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,1734 – 0,1060 0,1734 – 0,1060 0,1734 – 0,1060 0,1734 – 0,1060 0,1734 – 0,1060
D19S433 12 – 13 12 – 13 12 – 13 12 – 13 12 – 13
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,0774 – 0,2894 0,0774 – 0,2894 0,0774 – 0,2894 0,0774 – 0,2894 0,0774 – 0,2894
vWA 17 – 19 17 – 19 17 – 19 17 – 19 17 – 19
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,2450 – 0,0831 0,2450 – 0,0831 0,2450 – 0,0831 0,2450 – 0,0831 0,2450 – 0,0831
TPOX 8–8 8–8 8–8 8–8 8–8
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,5330 – 0,5330 0,5330 – 0,5330 0,5330 – 0,5330 0,5330 – 0,5330 0,5330 – 0,5330
D18S51 17 – 18 17 – 18 17 – 18 17 – 18 17 – 18
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,1232 – 0,0774 0,1232 – 0,0774 0,1232 – 0,0774 0,1232 – 0,0774 0,1232 – 0,0774
D5S818 9 – 12 9 – 12 9 – 12 9 – 12 9 – 12
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,0415 – 0,3524 0,0415 – 0,3524 0,0415 – 0,3524 0,0415 – 0,3524 0,0415 – 0,3524
FGA 20 – 25 20 – 25 20 – 25 20 – 25 20 – 25
Frecvenţa prezenţei alelelor * 0,1390 – 0,0860 0,1390 – 0,0860 0,1390 – 0,0860 0,1390 – 0,0860 0,1390 – 0,0860
Amelogenin
X–Y X–Y X–Y X–Y X–Y
X/Y

• Sunt prezentate estimări conservative ale frecvenţelor alelice pentru populaţia cauc
recomandate pentru utilizare de către producătorul setului AmpFlSTR® Identifiler® P
Numerotarea alelelor reflectă numărul de repetări în tandem conţinute în această alelă
a) În urma comparării profilului genetic a victimei (proba Nr.421-2011) cu profilul genetic din
proba Nr.425-2011, adică mecanismul de fixare din faţă a coşului căruţei, s-a depistat o
coincidenţă de 100% pentru toate alelele din cele cincisprezece locusuri polimorfe,
conţinând repetări tetranucleotidice, plus markerii de sex - Amelogenin (tabelul 2), alelele
care constituie “profilul genetic a victimei”.

a) În urma comparării profilului genetic a victimei (proba Nr.421-2011) cu profilul genetic din
proba Nr.426-2011, adică două porţiuni din gloabele căruţei, s-a depistat o coincidenţă de
100% pentru toate alelele din cele cincisprezece locusuri polimorfe, conţinând repetări
tetranucleotidice, plus markerii de sex - Amelogenin (tabelul 2), alelele care constituie
“profilul genetic a victimei”.

a) Compararea profilului genetic a victimei (proba Nr.421-2011) cu profilul genetic din proba
Nr.423-2011, adică toporaş, este imposibilă deoarece după efectuarea tuturor etapelor de
extragere şi amplificare a ADN-ului, s-a depistat că pe toporaş (proba Nr.423-2011) nu
există ADN uman detectabil.
Metode de
analiză a genelor
Expresia genelor
ADN  ARNm  Proteină  Caracter
5’-ATTGCAAGATTACCATGT-3’ Catena codogenă (netranscrisă)
3’-TAACGTTCTAATGGTACA-5’ Catena anticodogenă (transcrisă)
Transcripţie
5’-AUUGCAAGAUUACCAUGU-3’ ARNm

Translaţie

Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid


Maturizare
Caracter fenotipic normal
Expresia genelor
ADNmut ARNmmut  Proteinăan  Caracteran

5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ mutaţie G4→A


3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
Transcripţie
5’-AUUACAAGAUUACCAUGU-3’ ARNmmut

Translaţie

Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptidan

Caracter fenotipic anormal


Analiza genelor

ADN ARN Proteine

Secvenţiere Northern-blot Western-blot

PCR RT–PCR Secvenţiere

Southern-blot Hibridare in situ Analiza funcţiei

Hibridare in situ Analiza


histochimică
Utilizarea tehnicilor de analiză a acizilor
nucleici în medicină

Analiza ADN:
• depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor
genetice (prenatal, postnatal precoce);
• identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie
genomică (analiza filiaţiei);
• depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul bolilor
infecţioase şi gradului de infectare.

Analiza ARNm:
• analiza expresiei genice ţesut-specifică;
• evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice;
• Depistarea agenților infecțioși (ribovirusuri).
Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin
acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)
RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z
-
12 kb

10 kb 10 kb

8 kb

6 kb 6 kb
2,5 kb

10 kb 5 kb

6 kb 4 kb
5 kb
2,5 kb
2 kb

+
M
PCR – reacția de polimerizare în lanț

Principiile PCR  clonarea in vitro = amplificare


• Replicare semiconservativă, repetată
• Specificitatea primerilor sintetici pentru gena–ţintă
• Hibridizarea ADN-ţintă – primer ← complementar:
• Denaturare termică a ADN - de cercetat

Modificarea ciclică a temperaturii:


• Denaturare
• Renaturare
• Sinteză
Componentele necesare pentru
clonarea in vitro (PCR):
• ADN de cercetat
• Primeri specifici secvenţei de clonat –
• Complimentari secvenţelor flancante
• Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă
• Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTP)
• Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii:
• - tº de denaturare ADN
• - tº de renaturare (ADN+primer)
• - tº de polimerizare (elongarea catenelor noi
de ADN)
Etapele tehnicii PCR
A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante

B. Repetarea automată a procedurilor de denaturare-


renaturare-elongare de 30-35 ori
•Denaturarea ADN la 96oC
•Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor
•Elongarea catenelor ADN la 72oC

C. Analiza produşilor PCR


- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor
Extragerea ADN Pregătirea Amplificarea
componentelor pentru
ADN-ţintă
PCR

Electroforeza Colorarea şi Interpretarea


produşilor PCR vizualizarea produşilor rezultatelor
PCR
Avantajele PCR
• Metodă rapidă
• Metodă ieftină
• Utilizarea cantităţilor mici de material analizat
• Nu necesită izotopi radioactivi
• Interpretarea uşoară a rezultatelor

Dezavantajele PCR
• Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice
amplificate
• Necesitatea primerilor sintetici, specifici secvenţei
analizate
Utilizarea PCR
• Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice
• Identificarea mutaţiilor punctiforme
(substituţiile nucleotidice)
• Identificarea expresiei genice (RT-PCR)
• Dactiloscopia genomică (filiaţie)
• Identificarea agenţilor infecţioşi
• Identificarea gradului de infecţie (quantitative
PCR)
• Identificarea produselor PCR în timp real
(Real-Time PCR)
Identificarea inserţiilor / deleţiilor
Identificarea mutaţiilor punctiforme
Identificarea agenţilor infecţioşi
Stabilirea paternităţii (filiaţiei)
Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR
Concentraţiile critice ale substanţelor pentru inhibarea activităţii Taq-polimerazei

Substanţa Concentraţia critică

SDS >0.005% (m/v)


Fenol >0.2% (v/v)
Etanol >1% (v/v)
Isopropanol >1% (v/v)
CH3COONa >5 mM
NaCl >25 mM
EDTA >0.5 mM

Dependenţa cantităţii de produse amplificate de concentraţia ADN genomic utilizată în PCR.


S-a utilizat ADN în cantitate de: 1 – 0,5 μg, 2 – 0,25 μg, 3 – 0,1 μg, 4 – 0,02 μg
Optimizarea condiţiilor de
desfăşurare a PCR
Caracteristica primerilor utilizaţi în PCR

Gena Secvenţa Lungimea, baze % G+C Tm, oC

5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’ 24 54 59
ACE
5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’ 25 48 58
5’-CTGGCTCCTTGCTGGTGTGG-3’ 20 65 58
AT1 R
5’-GGGCAAGCGTATATTTTCTGGTG-3’ 23 48 55
5'-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3' 22 55 57
NOS
5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3' 24 54 59

Dependenţa cantităţii produselor PCR de temperatura de renaturare a primerilor.


În condiţiile PCR s-a utilizat: 1 – toC optimală -5oC; 2 – toC optimală; 3 – toC optimală +5oC.
Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR

Dependenţa cantităţii produselor PCR de concentraţia ionilor Mg2+.


Concentraţia utilizată de MgCl2: 1 – 2,5mM; 2 – 5mM.

Dependenţa cantităţii de ADN amplificat de numărul de cicluri PCR.


1 – 30 cicluri; 2 – 35 cicluri; 3 – 40 cicluri.
Analiza polimorfismului I/D pentru gena ACE

Analiza electroforetică în gel de agaroză de 2% a produselor PCR rezultate


din amplificarea ADN uman cu primeri corespunzători genei ACE.
M – marcher al lungimii; 1 – genotip I/D; 2 – genotip D/D; 3 – genotip I/I.
Analiza polimorfismului G/T pentru gena NOS

M 1 2 3

G
T

Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători genei NOS.


M – marcher al lungimii; 1 – genotip G/G; 2 – genotip T/T; 3 – genotip G/T.
Analiza polimorfismului A/C pentru gena AT1 R

Rezultatele amplificării ADN uman cu primeri corespunzători


genei AT1 R digerate cu ajutorul enzimei Dde I.
M – marcher al lungimii; 1 – genotip A/A; 2 – genotip A/C
Tehnica Real-time-PCR
ARMS-PCR
Utilizarea tehnicii microarray
• Izolarea ARN din diferite ţesuturi
• Izolarea ARNm
• Amplificarea prin intermediul RT-PCR
• Marcarea cu agenţi fluorescenţi
• Hibridarea cu ADN fixat în micocipuri
• Analiza rezultatelor
Tehnica Southern-blot
• Bazată pe RFLPs
• Hibridizare cu sonde marcate
• Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un
suport solid (pe membrane de nitroceluloză)
Hibridarea acizilor nucleici
• Unirea complementară a fragmentelor
(moleculelor) de acizi nucleici:
• ADN de cercetat cu
• sonda oligonucleotidică
• În reacţie participă molecule monocatenare
• Moleculele ADN-ţintă sunt fixate
• Moleculele-sonde sunt marcate radioactiv
sau fluorescent
• Identificarea complexelor hibride se
realizează prin intermediul autoradiografiei
Tehnica Southern-blot

Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN

Denaturarea şi Hibridare cu sonda Autoradiografia


transferul ADN
pe membrane Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
Utilizarea tehnicii Southern-blot
• Identificarea inserţiilor / deleţiilor mari
• Identificarea mutaţiilor punctiforme ce
afectează SR
• Dactiloscopia genomică RFLPs
RFLPs şi analiza genotipului

Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2

C (mm)

B (Nm)

A (NN)

Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C


Avantajele Southern-blot
• Este metodă foarte precisă
• Nu necesită cunoaşterea secvenţei nucleotidice
analizate
• Nu necesită primeri sintetici

Dezavantajele Southern-blot
• Necesită cunoaşterea hărţii de restricţie a genei ţintă
• Necesită cantităţi mari de material biologic
• Metodă îndelungată, cu multe etape
• Necesită izotopi radioactivi
• Necesită materiale costisitoare
Tehnica Northern-
blot
• Extragerea ARN din
ţesutul ţintă
• Electroforeza ARN în
condiţii de denaturare
• Transfer pe membrană de
nailon
• Hibridarea cu sonda
marcată
• Autoradiografia
Tehnica Northern-blot

Extragerea ARN Electroforeza ARN

Hibridare cu sonda Autoradiografia


Transferul ARN
pe membrane Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor
Utilizarea tehnicii
Northern-blot
• Identificarea expresiei genice în
anumite ţesuturi, anumite condiţii
• Identificarea variantei de splicing a
proARNm
• Identificarea nivelului de expresie
• Identificarea agenţilor infecţioşi
(ribovirusuri)
Identificarea nivelului
de expresie şi a variantei
de splicing
Secvenţierea ADN

Stabilirea secvenţei de nucleotide


• Metoda chimică (tehnica Maxam-Gilbert,
1973)
• Metoda dideoxi (tehnica Sanger, 1975)
• Metoda automată (cu utilizarea agenţilor
fluorescenţi)
Tehnica
dideoxi
• Sinteza enzimatică a
ADN

• Utilizarea în paralel
a nucleotidelor ce
conţin deoxiriboză
şi dideoxiriboză

• Stoparea sintezei în
cazul incorporării
ddNTP
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’ catena codogenă
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ catena anticodogenă (matriţă)

3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTAC-3’

3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ 5’-ATTA -- primer marcat P32


5’-ATTACA-3’ pentru ADN-polimerază
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ A, T, C, T – dNTP (2’-dNTP)
5’-ATTACAA-3’
pentru sinteza noilor catene
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAG-3’ A, T, C, T – ddNTP (2’,3’-ddNTP)
pentru stoparea sintezei
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAGA-3’
3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAGAT-3’

3’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’
5’-ATTACAAGATT-3’
5’-ATTACA-3’
5’-ATTACAA-3’
A 5’-ATTACAAGA-3’
5’-ATTACAAGATTA-3’
5’-ATTACAAGATTACCA-3’
A T C G
5’-ATTACAAGAT-3’ -
5’-ATTACAAGATT-3’
T
5’-ATTACAAGATTACCAT-3’
5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’
5’-ATTACAAG-3’
G
5’-ATTACAAGATTACCATG-3’
5’-ATTAC-3’
C 5’-ATTACAAGATTAC-3’ +

5’-ATTACAAGATTACC-3’ 5’-ATTACAAGATTACCATGT-3’
Tehnica dideoxi

Extragerea ADN

Denaturarea ADN

Sinteza catenelor complementare


utilizând primeri marcaţi cu 32P în
prezenţa dNTP şi ddNTP

Electroforeza în condiţii de denaturare

Vizualizarea fragmentelor marcate prin


autoradiografie
-

(+) 5' TAAATGGCTA.......3'(-)

+
Metoda automată
Hibridarea
in situ
• Pregătirea
preparatelor de
cromozomi

• Denaturarea ADN

• Hibridarea cu sonda
marcată

• Vizualizarea la
microscopul optic
Hibridarea in situ pentru
depistarea secvenţelor ADN

Hibridarea in situ cu Hibridarea in situ cu


utilizarea preparatelor utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici cu nuclei interfazici
Hibridarea in situ
pentru depistarea
secvenţelor ARN

Hibridarea in situ cu Analiza


utilizarea probei sens (stânga) histochimică –
şi antisens (dreapta) identificarea
proteinelor în ţesut
Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor nucleici:

Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul


expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinţelor
mutaţiilor.

Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice - prenatal sau


postnatal, cu scop de prevenire a naşterii copiilor cu anomalii genetice
sau manifestării unor patologii severe.

Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea vectorilor de gene etc.).

Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în diagnosticul bolilor


infecţioase.

Identificarea polimorfismelor individuale în analiza filiaţiei, în


criminalistică.