Peptide si proteine

Dr. Brînduşa-Alina Petre

 Polipeptidele – caracteristici generale

Polipeptidele:
 molecule mari compuse din unul sau mai multe lanţuri de aminoacizi într-o
anumită ordine specifică.

 necesare pentru structura, functionarea și reglarea celulară în ţesuturi și organe.

 fiecare polipeptida (proteină) are o structură și o funcţie unică:

 catalizează diferite reacții biochimice, de ex. enzimele;
 acționează ca mesageri, de ex.neurotransmiţători;
 transportul de oxigen în sânge, de ex. hemoglobina;
 influențează creșterea și dezvoltarea diferitelor țesuturi, de ex. factorii trofici;
 apărarea organismului împotriva boliilor, de ex. anticorpii.
 Exemple de polipeptide – bioactive
Glutationul (GSH)

Acid glutamic Cisteina Glicina

- peptida produsă în ficat din trei aminoacizi.

- rol esențial în procesele metabolice și activitatea imunitară, fiind baza activității antioxidante din organism.
- se găsește în aproape toate tipurile de celule din organism oferind celulelor o protecție antioxidantă optimă.
- poate fi prezent și în forma sa oxidată ca disulfit glutation sau glutation oxidat (GSSG).
- raportul GSH/GSSG este un indicator al stării redox celulare.
Utilizările terapeutice
- dezintoxicarea de metale grele;
- în tratamente împotriva cancerului, în special cel de ficat și în reducerea toxicității unor tipuri de chimioterapie;
- tratamentul fibrozei pulmonare, afecțiune inflamatorie cronică asociată cu un nivel ridicat al stresului oxidativ;
- Parkinson – nivel scăzut al glutationului la pacienți cu Parkinson în fază incipientă. Creșterea acestui nivel
ducela îmbunătățirea stării tuturor pacienților, precum și la o diminuare cu până la 42% a dizabilității datorate
bolii în fază incipientă.
- Sustine sistemul imunitar. Un nivel scăzut al glutationului a fost asociat cu o incidenţă sporită a infecţiilor şi
inflamaţiilor, creşterea toxicităţii, degenerare celulară. De asemenea, glutationul acționează sincergic împreună
cu alți antioxidanți. Există dovezi că vitamina C modulează nivelul glutationului în limfocite.
 Exemple de polipeptide – bioactive
Bradikinina

Arg – Pro -Pro –Gly –Phe - Ser- Pro- Phe - Arg

Peptidă cu un puternic efect vasodilatator care scade presiunea arterială şi

reprezintă un mediator al inflamaţiei.
 Exemple de polipeptide – bioactive
Peptide amyloid beta
"What is your name?“ "Auguste.“
"Family name?“ "Auguste.“
"What is your husband's name?“
"I believe ... Auguste.“
"Are you married?“
"Oh, I am so confused.“
"Where are you right now?“
"Here and everywhere, here and now, you must not think badly of me.“…
Simptome:
confusie, iritabilitate, agresiune, schimbari de comportament, dificultati de vorbire,
Auguste Deter's dezorientare, pierderi de memorie ce sfarsesc cu dementa totala si apoi moartea.
(1850 - 1906)
Tangled clumps of Tau proteins

Amyloid
plaque
Boala AD nu are VINDECARE, tratemantele curente nu pot stopa boala de la progresie, doar pot temporar
intarzia faza finala de dementa, asigurand o calitate mai buna a vietii…dar CERCETAREA CONTINUA !
 Formarea placilor amiloid in creerul pacientilor cu
Alzheimer

APP
- Functia primara nu se
cunoaste
- implicata ca regultor al
formarii sinapselor si a
plasticitatii neuronale cat si
pentru exportul de fier.
Aβ (1-40) - 1DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV40
Aβ (1-42) - 1DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA42
 Caracteristici ale agregarii neurodegenerative
Peptide amiloid si α synuclein
Abeta (1-40)
Monomer Soluble oligomers Protofibril Amyloid like- fibril

1
MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA 140

C
 Proteomica = Proteomics

Proteomica:

o Studiu complex folosit pentru a analiza structura, funcţia, și

interacţiunile dintre proteine.
o Folosește tehnici de biologie moleculară, biochimie, chimie
analitică, chimie fizica, genetică și informatică.

“PROTEOM“ : PROTEine produse de un organism, la fel cum genOM -ul

este intregul set de gene.

Proteomics

Glycomics

Metabolomics

Petrolomics…etc.
Genome Proteom
Genome Proteome
 Alimentele biosintetizate / bioprocesate: o salvare
pentru umanitate? sau pericol public?

brinzeturi oua carne …etc.

Ravagiile alimentelor contrafacute!

Integrarea în UE a deschis poarta "alimentelor mutant“
(emulgatori, coloranti sintetici, sare, zahar, apa)

 intolerante si alergii, imunitate scazuta

 boli gastro-intestinale, boli cardio-vasculare, diabet

cancer
 Unde are loc biosinteza proteinelor ?

ARN
m

Ribozomii (Corpusculii lui Palade) (1912-2008) premiul Nobel (1974).

 generați de nucleoli au dimensiuni de ~ 20 nm conțin o subunitate mică (40S) și o
subunitate mare (60S)
 sunt constituiți din 65%ARN si 35% din proteine ribozomale ;
 se găsesc liberi în citoplasma celulară sau atașați reticulului endoplasmatic;
 sediul biosintezei proteinelor specifice; decodeaza ARN mesager pentru construcția
lanțurilor polipeptidice din aminoacizi prezentati de ARNt;
poliribozomi = asociari de 5 – 40 ribozomii pe cate pe o molecula de ARN mesager.
 ADN – ARN

ADN = deoxiribonucleotide: adenina (A), citidina(C), guanina (G) si timidina (T).

ARN = ribonucleotide : adenina (A), citidina(C), guanina (G) si uracil (U).

Cum poate un „limbaj“ de 4 baze din secventa ARNm sa codifice cei 20 aa din secventa
proteinelor ?

1 nucleotida ar codifica un aa (4 baze = 4 aminoacizi)

2 nucleotide codifica 1 aa (42 = 16 aminoacizi ar putea fi introdusi in secventa unei
molecule proteice)
3 nucleotide codifica 1 aa (43 = 64 aminoacizi )???

Teoretic exista 64 codoni - fiecare aminoacid este specificat de un triplet nucleotidic.

 ADN – ARN
1953 – Watson si Crick : descriu prima data molecula de ADN.

1962 – Watson, Crick și Wilkins au fost răsplătiți cu premiul Nobel.

Complementaritatea bazelor in structura ADN

 Bazele sunt asezate fata in fata in interiorul helixului.

 Principiul complementaritatii: - A – T prin doua legaturi de H

- G – C prin trei legaturi de H
 Structura ADN
- formata din doua catene polinucleotidice paralele si de polaritate opusa
(adica una are polaritatea 3‘- 5‘ și una 5‘ – 3‘).
- molecula este elicoidala, formand un dublu helix.
Genome Proteom
 Transcriptia

Gena: o regiune din molecula de AND care cand este activata transcrie un ARNm
pentru o proteina data.

Secventa genelor din genomul celulelor procariote corespunde in intregime secventei de

aminoacizi din proteina pe care a codificat-o, ceea ce nu se intampla la celulele
eucariote.

Transcriptia se face intotdeauna in directia 5’ – 3’, deci se va copia catena AND 3’ – 5‘.
 Transcriptia
Transcriptia AND: necesita un aparat de transcriptie foarte complex: ARN polimeraze si factori de
transcriptie (proteine auxiliare). Procesul de transcriptie catalizat de ARN polimeraza prezinta trei etape:
1. Etapa de initiere: de recunostere a genei care trebuie transcrisa (gena tinta) si a punctului de initiere unde
are loc desfacerea helixului AND pentru generarea unei regiuni monocatenare scurte; si de incorporare a
primelor nucleotide care formeaza lantul de ARN. Secvenata la care are loc acest start se numeste
promotor.
2. Etapa de elongatie: nucleotidele sunt legate covalent la capatul 3’ al lantului deja initiat. Sinteza continua si
polimeraza aluneca de-a lungul AND-ului desfacand dublu helix pentru a expune un nou segment al matricei
monocatenare.
3. Etapa de terminare: punctul unde sinteza lantului ARN se termina iar hibridul AND-ARN format se separa. AND se
reface sub forma de dublu helix, ARN polimeraza si molecula de ARN sintetizata se desprind si devin libere in mediu
celular. Terminarea sintezei este determinata de o secventa specifica din structura genei: terminator.
 ARNm

Dupa transcriptie si splicing ARNm sufera doua procese post-transcriptionale:

1. Capare- se adauga la prima guanidina o grupare metil (-CH3) in pozitia 5’.

2. Se adauga o coada poli (A) la capatul 3’- OH terminal moleculei sub actiunea poli
polimerazei (A) .

ARNm generat din AND in nucleu, exportat in citoplasma si folosit pentru sinteza
proteinelor functionale.

- ARNm, prin transcriptie contine urmatoarele secvente importante:

1. o secventa specifica (5-10 nucleotide) care asigura legarea ARNm de
subunitatea mica a ribozomului. RBS –ribosome binding sequence.
2. urmata de codonul de initiere a translatiei AUG.
3. Secventa de nucleotide (codoni) pentru sinteza proteinei si
4. O secventa terminator (stop) reprezentata de unul din codonii stop (UAA, UGA
sau UAG). Acesti codoni nu reprezinta nici un aminoacizi.
 Translatia ARN

ARNm contine un singur codon pentru initierea sintezei proteice (AUG).

- atât la procariote cât și al eucariote sinteza proteinelor începe cu acest codon care specifică
Metionina.
- contine 3 codoni STOP ( UAA, UGA,UAG); acesti codoni nu specifica nici un aa in secventa
proteinei.
- multi aminoacizi au mai mult decat un codon care-i specifica.
 Cum se citeste/decodifica informatia ARNm?
Crick a sugerat ca translatia trebuie sa fie mediata de o molecula ADAPTOR: 31 moleculele de ARNt ~ 85 baze).
ARNm = mesager - sintetizat în timpul transcripţiei mesajului genetic de pe o catenă de ADN şi serveşte ca
tipar pentru sinteza proteinelor.
ARNt(s) = transfer/solubil - similar ca structură cu orice acid ribonucleic
- are rolul de a activa ARNt sintetaza
- reacţionează cu aminoacizii corespunzatori anticodonului –prin formarea
grupărilor aminoacil - ARNt care sunt transferaţi la locul de biosinteză a proteinelor.

ARNr = ribozomal - apare întotdeauna legat de proteine si contine peste 1000 de nucleotide
 Translatia ARN

Translaţia care constă în migrarea mARN în citoplasmă şi asocierea

mARN cu ribozomii activi în sinteza proteică. Catena de mARN se fixează
simultan prin absorbţie pe mai mulţi ribozomi formând poliribozomi.
Activarea aminoacizilor:

Enzima + aminoacid + ATP Enzima-(aminoacil-AMP) +

Pirofosfat

ARNt + Enzima-(aminoacil-AMP) aminoacil –ARNt + AMP +

Enzima

Pe catena mARN din polizom, se vor amplasa, la nivelul fiecărui ribozom,

numai acele complexe aminoacil-tARN care, pe bucla centrală,
reprezentând anticodonul, posedă o secvenţă de trei ribonucleotizi
complementară codonilor mARN din complexul polizomului.

Polimerizarea sau asamblarea aminoacizilor se realizează între

gruparea COOH a primului aminoacid care reprezintă punctul activ al
biosintezei progresive, cu gruparea NH2, a celui de al doilea aminoacid, în
prezenţa enzimei peptid-polimeraza, care catalizează formarea legăturilor
peptidice între aminoacizi; încorporarea aminoacizilor este ireversibilă.
Movie

http://biologie12d.blogspot.ro/2011/01/bazele-geneticii-de-brinzei-alexandra.html

Curiozitati
Viteza de sinteza a unei proteine, la E.coli, este de 15 aa/secunda si la
eucariote de 2 aa/secunda.
Eroarea posibila este estimata la 1 aa incorporat incorect la 10 4 aa incorporati.
Abundenta diferitelor molecule de ARN/ celula se estimeaza astfel:
2500 molecule ARNm, 160.000 ARNr si 20.000 ARNt…variind in functie de tipul
celular, gradul se diferentiere, varsta si activitatea metabolica a celulei.

Efectul antibioticelor asupra translatiei:

Tetraciclina : blocheaza legarea aminoacil –ARNt la situsul A al
ribozomului.

Streptomicina: impiedica trecerea de la initiere la elongatia lantului

polipeptidic.

Eritromicina: blocheaza translocatia pe ribozom.

Tipuri diferite de proteine – solubilitate diferită

Proteine solubile în mediu apos

Proteine insolubile în mediu apos
 Proteomica: „step by step“

Prepararea probelor:
izolare, purificare, concentrare

Separarea proteinelor:
Electroforeză/ Cromatografie de afinitate

Spectrometrie de masă
MALDI-TOF, LC-MS/MS, MALDI-FTICR, OrbiTrap

Identificarea proteinelor in
Baza de Date: NCBINR, SwissProt
Structura proteinelor și plierea lor
Energia legăturilor covalente și
necovalente
800
Si-O

700

600

Bond energies, kJ/mol

500 C-F Covalent bonds

400 C-H
C-OH
C-NH2
300
C-C
C-I
200
C-NO

100
Hydrogen bonds
Charge-charge interactions
Other noncovalent interactions
0
Mathews and van Holde, Biochemistry, The Benjamin/Cummings
Publishing Co.,Inc.
 Izolarea și purificarea proteinelor
membranare: probleme și soluții

Agregarea proteinelor
-Detergenti
- forta ionică minimă – omogenitate
- forta ionică maximă – pentru a pastra forma nativa in cazul
complecsilor de proteine
- pH optim pentru solubilizare și stabilitate

Aditivi de stabilizare ai proteinelor și Inhibitori ai proteazelor

- EDTA – stabilizator
- PMSF – inhibitor al proteazelor

Durata de izolare a proteinelor

- minimă
 Proteomica - strategie de lucru

Virus

celula

Limitări și obstacole
Prepararea probelor Separare și identificare Bioinformatics
• extractia proteinelor • detecţia proteinelor cu o abundenţă mică • diverse tipuri și surse de date
membranare • detecţia proteinelor membranare • identificarea prot. care nu sunt
• inactivare funcțională • intervalul dinamic de colorare a proteinelor prezente în baza de date
• degradarea proteinelor • reproductibilitatea • volum mare de date
• contaminarea probelor • separarea proteinelor ​cu valori extreme ale pI. • algoritmi de căutare
 Proteomica: schema genarală de lucru
1 D- Gel 2 D- Gel

- decuparea spoturilor
- decolorare
- digestia enzimatica (eg. tripsina)

Identificarea proteinelor
Baza de Date
 Analiza polipeptidelor din ser in laboratoarele biomedicale

Analize care exploreaza diferite componente ale proteinelor :

 Proteine totale - Valorile normale ale proteinelor sanguine:
 electroforeza serului
- la adulti = 6,6- 8,6 g la 100ml
(proteinograma)
 fibrinogenul - la copii 1-3 ani = 6,0 - 8,6 g la 100ml.
 electroforeza
teste hepaticeserului (proteinograma)
 produsi de degradare ai proteinelor
 fibrinogenul - Valori normale ale fibrinogenului: 200-400 mg la 100 ml sange.
Fractiunea Proportii in Proportii in
 teste hepatice : reactia cu Timol, reactia Takata, Gros,
proteicaanaliza
a seruluiSulfat de cadmiu
procente si
grame
analiza Sulfat de Zinc(Kunkel)
 produsi de degradare ai proteinelor Albumine 52-62% 3,64-4,34

Deseurile In sange In urina Globuline 38-48% 2,66-3,36

proteinice din care:

alfa-1-globuline 2-5% 0,14-0,35

Acidul uric 2-5 mg/100 ml 0,30-0,80 g/24h
alfa-2-globuline 6-9% 0,42-0,63
Ureea 20-50 mg/100 ml 15-35 g/24h
beta-globuline 8-11% 0,56-0,77
Creatinina 0,6-1,2 mg/100 ml 0,8-1,9 g/24h gama-globuline 14-21% 0,98-1,47