http://www.dnai.org/text/mediashowcase/index2.html?

id=1022

ADN Recombinante célula

cromosoma
Se toma el plásmido de una levadura, se corta
con una enzima de restricción, y se inserta en
levadura
él ADN humano que codifica para una
proteína dada. El plásmido híbrido resultante
se puede insertar en otra levadura, donde se ADN
multiplicará junto con ella.
TCGA

AGCT
AGCT
TCGA
Genes
celulares

proteína
Cámara de alimentación

Genes de la levadura
Multiplicación del plásmido y expresión del gen

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/plasmidcloning_fla.html
 Se considera una proteína recombinante o
proteína heteróloga aquella proteína cuya
síntesis se realiza en un organismo distinto al
organismo nativo.

EcoRI

http://www.youtube.com/watch?v=aA5fyWJh5S0
http://www.youtube.com/watch?v=RgYt99b3sjQ
 Palíndromo, Enzima de Restricción, Extremos pegajosos
Arber, Nathans, Smith (1978)

No daré radón, Anilina Extremos pegajosos

(o Cohesivos)

GAATTC G AATTC
GAATTC AATTC G

EcoRI
G AATTC
G AATTC
Ganas Admiración Ante Todos Tus Colegas
 Corte específico y Ligamiento del ADN
GAATTC GAATTC
CTTAAG CTTAAG

EcoRI
G AATTC G AATTC
CTTAA G CTTAA G

G G AATTC AATTC
CTTAA CTTAA G G
Extremo cohesivo EcoRI EcoRI extremo cohesivo
ADN Ligasa
G AATTC
CTTAA G
 Codones
raros parada
inicio
ADNc

Marcador elegible MCS Origen F1 de replicación

Origen de replicación represor

 Inserción al microorganismo o
célula superior
Disparo de
proyectil
inyección

virus

transformación

transgen

Un sistema de expresión lo conforma un organismo hospedero y un vector de

expresión o fragmentos de DNA que poseen los elementos génicos necesarios para
realizar los procesos de trascripción y traducción en dicho organismo hospedero.
 Purificación

FPLC
 Gen Secuencia
humano promotora para la
síntesis de una
proteína de la leche
Gen híbrido

humano rata

Óvulos de cerda
fecundados

desarrollo de
una cerda
transgénica

No me digas
q ella no es
Transgénicos
transgénica
Cabras transgénicas portadoras de un gen humano.
a) se produce un transgén,
b) se realiza una fertilización in vitro,
c) se inyecta el gen transgénico en el cigoto,
d) se implanta el embrión en una madre sustituta.
 Transgénicos
maduración retardada, piel más
gruesa, resistencia a las plagas

Patatas resistentes al escarabajo, Resistentencia a herbicidas

menos de aceite para freirlas e insectos

Harina de trigo de
mejor calidad

Hay 2 métodos principales para transformas las células y tejidos de las plantas:

 La pistola de genes. Esta técnica es aplicada especialmente en la transformación de especies

monocotiledóneas como el Maíz y el arroz.

 Método con Agrobacterium. Aplicada en dicotiledóneas y en monocotiledóneas. En general esta

técnica es preferible que la pistola de genes porque es mayor la frecuencia de inserciones en un solo
sitio de ADN extraño, lo cual facilita la vigilancia.
 La bacteria Agrobacterium tumefaciens contiene un plásmido Ti, que
contiene los genes responsables de su virulencia, llamados genes onc.
Cuando la bacteria infecta a la planta, provocando en ella un tumor,
una parte del plásmido Ti, llamada T-ADN, que contiene los genes onc,
es transferida al núcleo de la célula vegetal y se inserta en un
cromosoma de la planta.

En la transfección vegetal con Agrobacterium se ha

ensayado un marcador inusual: el gen de la enzima
luciferasa, de las luciérnagas. El sustrato de esta enzima
es una proteina llamada luciferina, que con ATP y
oxígeno desprende luz. Plásmidos Ti con este marcador,
se transfirieron a células de tabaco, con las que se
formaron nuevas plantas.

El Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) es la institución que más trabajo tiene
en la aplicación de biotecnología y especialmente en el desarrollo de cultivos transgénicos.
clonación
Esquema de producción de
proteínas recombinantes

Envasado y
comercialización

Recuperación del
recombinación producto

Cultivo celular

Biorreactor de escala piloto

Biorreactor de
pequeña escala

Operación a escala industrial

 PDI

Los puentes S-S son enlaces

covalentes ( 2.08Å).
Formación de un PDI PDI
enlace disulfuro PDI

Proteina reducida Proteina oxidada

rearreglo de enlaces
disulfuro
PDI PDI
PDI

Proteina con puentes Proteina con puentes

disulfuro incorrectos disulfuro correctos
 Oligosacárido Hélice a
dolicol transferasa calnexina transmembrana

citosol Hélice a
luminal

Luz del RE
2 3
1a

PDI 1b

monómero de la Trímero de la
hemaglutinina hemaglutinina
calreticulina completado
Propiedades Químicas y
Biológicas de la Proteína

Es importante analizar:

 La posible toxicidad sobre el hospedero

La estabilidad al pH, temperatura y proteólisis

Su secuencia nucleotídica codificante para evaluar el uso de codones preferenciales y

la presencia de secuencias de finalización prematura de la transcripción.

 La secuencia aminoacídica para evaluar el peso molecular, y el punto isoeléctrico

 Tipo de modificaciones postraduccionales presentes

 El destino celular deseado (extracelular o intracelular) y el grado de pureza deseada.

 Alimentos
 Procesos industriales
 Aditivos
 Nutracéuticos
 Suplemento alimenticio
 Biomedicina
 Química de la transformación
 Reactivo diagnóstico
 Industria del papel
 Agente terapéutico
 Industria textil y del cuero
 Vacunas
 Industria farmacéutica
 Industria química

Reactivo químico Medio ambiente

 Reactivo analítico  Energía y combustibles
 Tratamiento de residuos

VENTAJAS
 Fácil manipulación.
Buen nivel de conocimiento
sobre su fisiología y genética.
 Se cuenta con gran variedad de
vectores de expresión y cepas
mutantes.
 Cultivos baratos con altas
densidades celulares.
 Niveles moderados de
producción de la proteína
recombinante.
DESVENTAJAS
 Ineficiente secreción de la proteína
al medio de cultivo.
 Formación de cuerpos de inclusión
insolubles en el citoplasma celular.
 La síntesis de las proteínas
heterólogas induce a un incremento de
la proteólisis celular.
 Realiza pocas modificaciones
postraduccionales.
 Generación de endotoxinas dañinas
para la salud humana y animal.
 Bacillus subtilis
VENTAJAS DESVENTAJAS

 Secreción de la proteína  Secreta una gran cantidad de

heteróloga. proteasas afectando el rendimiento
del producto recombinante.

 Dispone de pocos vectores de

expresión y elementos promotores
para la regulación de la expresión de
los transgenes comparado con E. coli.

 Menor estabilidad genética de los

plásmidos incorporados en el
hospedero.

Bacillus subtillis que ha sido exitosamente transformado con el vector pTG262-plac-RFP

 Saccharomyces cerevisiae
VENTAJAS

 Sistema eucariota mejor caracterizado desde el

punto de vista de la Biología Molecular y la fisiología.

 Genoma totalmente secuenciado.

 Vectores de expresión y cepas disponibles.

 Manipulación sencilla a nivel de laboratorio e

industrial.
DESVENTAJAS
 Cultivos baratos.
 Produce hiperglicosilaciones.
 Se producen altos niveles de la proteína
recombinante.  Baja eficiencia en la secreción de
la proteína heteróloga.
 Realiza modificaciones postraduccionales.

 Es considerado como organismo GRAS.

 Pichia pastoris

VENTAJAS

 Emplea los promotores más fuertes y eficientemente

regulados de los conocidos.

 Vectores de expresión y cepas disponibles.

 Manipulación sencilla a nivel de laboratorio e

industrial.

 Secreción eficiente de la proteína heteróloga.

 Medios de cultivos son baratos y formulados libre de

DESVENTAJAS
toxinas y pirógenos.
 Produce patrones glicosilaciones no deseables
 Los cultivos alcanzan altas densidades celulares. para algunas proteínas.

 Altos niveles de producción.  Actividad proteolítica.

 Bajos niveles de secreción de proteínas endógenas  Algunas proteínas no se producen de forma

facilitando la purificación de la proteína heteróloga. eficiente.
 Pichia pastoris, Aspergillus nidulans,
Día 1
Trichoderma reesei
Día 2

Día 3

Días 4 y 5
Preparación
Usario de lote Inicio de
de semilla Cultivo primario Inicio de
Banco de Preparación del Cultivo
células biorreactor y la secundario
80 ºC autoclave Biorreactor
en circuito Inicio en
biorreactor
Generación
de biomasa
(glicerol) Generación
de producto
(etanol)
 Producción de Proteína en Células de Mamíferos

Transferencia del gen cribado Desarrollo del proceso

Proteína o.i.

marcador

seleccionar
Línea celular
clonal

Mínimo 12 meses

 Es posible el cultivo continuo a gran escala

 requieren una superficie sólida sobre la cual crecer (discos, cuentas de celulosa, etc)
 las tasas de crecimiento y las densidades celulares máximas son muy inferiores a las
de las células animales
 el enfoque más costoso para la producción de proteína recombinante
 “Pharming” - proteína recombinante de animales vivos

animal transgénico (ovejas, cerdos, etc; caro de producir pero costo-efectivo)

 Ejemplo gen de lactoglobulina (secreción de proteínas correctamente modificadas)
Insulina
 SCID
Hay varios tipos de SCID. El más común es
causado por una mutación en el gen SCIDX1
localizado en el cromosoma X. Este gen
codifica una proteina utilizada para construir
el IL2RG (receptor de la interleuquina-2).

Otra forma de SCID es causada por una Diagrama en cintas de la

mutación en el cromosoma 20 y se adenosina desaminasa bovina . El
caracteriza por una deficiencia de la enzima ion Zinc visible en el centro.
adenosina desaminasa. Tomado del PDB 1VFL

2'-Desoxiadenosina

adenosina
desaminasa

2'-desoxi-inosina
 Gen clonado
SCID (alelo normal)
Se inserta el
gen normal en
el virus

Ácido
nucleico viral
Retrovirus
Se infecta la célula
de la médula ósea
con el virus

ADN viral insertado

en el cromosoma

Célula de la médula
ósea del paciente

médula
ósea

Síndrome del Niño Burbuja

Se Inyectan células
al paciente
 Superficie
HMWK
Cascada de la coagulación PK

XII VII

XIIa
Ca++ XIa
HMWK VIIa + TF
Ca++
XI IXa
IX
Ca++ Lesión vascular
VIII VIIIa PL
X
Xa
X
V Va Ca++
PL
protrombina

trombina

XIII
fibrinógeno monómero de fibrina
XIIIa
Polímero de fibrina

Polímero cruzado de fibrina

Imagen Computarizada del Interferon-g
 Vacunas
Extracción del
ADN de virus Integración del plásmido
híbrido en el núcleo de una
célula de levadura

ADN
Plásmido
bacteriano

La levadura fabrica las

proteínas víricas con poder
inmunológico

Inyección de proteínas
víricas en un chimpancé
 Envenenamiento por Organofosfatos
 Los organofosfatos son esteres, amidas, u otros derivativados de los
ácidos fosfórico y tiofosfórico e incluyen algunos de los más tóxicos
insecticidas utilizados en la agricultura.
enzima
 Inhiben la acetilcolinesterasa. OPDA

paratión
  La terapia enzimática para el envenenamiento por
organofosfatos depende de la disponibilidad de cantidades
grandes de colinesterasas.

 Las plantas transgénicas han sido evaluadas por su costo-

efectividad para la bioproducción de proteínas.

 El tratamiento
convencional emplea
atropina y 2-PAM

H
C N OH
N+
Cl
CH3

pralidoxima o 2-piridina
cloruro de metilo
aldoxima
acetilcolinesterasa humana