ANALIZA MEDICAMENTULUI

ANUL III

ASISTENTA DE FARMACIE

1
 Calitatea medicamentului
 Structura organizatorica ANM
 Departamentul de materii prime si produse finite
 Analize fizico-chimice – medicamente, forme
farmaceutice si substante;
 Laborator de toxicologie;
 Laborator de imunogenitate si anatomie patologica;
 Laborator de microbiologie;
 Unitate nucleara;
 Biobaza.


2
 Departamentul de inspectie farmaceutica
 Se ocupa cu inspectia in industria medicamentului;
 Servicii de inspectie privind regulile de buna practica de fabricatie;
 Servicii de inspectie privind regulile de buna practica de studii
clinice;
 Probleme de farmacovigilenta;
 Serviciul de primire a probelor si de certificare a acestora;
 Serviciul de supraveghere a medicamentului si de alertare;
 Serviciul de inspectie in unitatile de distributie en-gros;
 Unitatile teritoriale de inspectie (UTI) – UTI fac inspectia in farmacie
si preleveaza probe pe care le trimit ulterior la ANM Bucuresti pt
analiza.


3
 ANM – infiintata in 1998, functioneaza ca insitutie de
sine statatoare incepand din 1 ianurie 1999;
 Este subordonata MS si constituie domeniul politicii
statului in privinta controlului medicamentului si a altor
produse de tip uman;
 Productia, importul, distributia si utilizarea
medicamentelor in Romania sunt admise numai dupa ce
au fost autorizate si inregistrate de ANM;
 Autorizarea = eliberarea certificatelor de autorizare
(APP) – autorizatia de punere pe piata;
 Elaboreaza FR si o armonizeaza la cea europeana (RO a
aderat la conventia privind EP, ceea ce o inseamna ca
prevederile EP privind standardele de calitate sunt
olbigatorii pt toate medicamentele de uz uman sau
veterinar, de import de fabricatie.

4
 Analiza medicamentului se face si la nivel de industrie (de
producator);
 Analiza materiei prime, a produsului finit si a produsilor intermediari
– la nivel de industrie;
 Analiza si controlul medicamentului se face si la nivelul unor
laboratoare autorizate de ANM (la nivel de universitati sau
laboratoare private autorizate de ANM);


 Analiza de buna practica de laborator se face in conformitate cu:

 Monografii din FRX sau EP (identificare, dozare, puritate);
 Specificatii tehnice;
 Stass-uri.

5
  Specificatii tehnice:
 Generalitati – carui tip de forma farmaceutica apartine calea de administrat,
grupa terapeutica, compozitia unui comprimat;
 Conditii tehnice – proprietati fizico-chimice (aspect, diametru, culoare, gust,
uniformitatea masei, testul de dizolvare, dozare etc.)
 Reguli pt verificarea calitatii (cf FRX)
 Metode de analiza – control organoleptic;
 Ambalare, depozitare, transport;
 Garantii – termen de valabilitate.
 Etape in analiza medicamentului

 Prelevarea probelor (pentru determinari cantitative si calitative)

 Serie = totalitatea unitatilor de produs care au fost obtinute in conditii
identice intr-un singur ciclu de operatii;
 Lot = cantitatea de materie prima presupusa a fi unitara din care se obtin
unul sau mai multe serii de produs;
 Proba trebuie sa reprezinte sub toate aspectele caracteristice produsului
prelevat din lot sau seria respective;
 Unitatile de produs se introduc in ambalaje primare sau secundare. 6
 Medicamentul
 Orice substanta sau combinatie de substanta prezentata ca avand
proprietati pentru tratarea bolilor la om;
 Orice substanta sau combinatie de substante folosita sau
administrate la om pentru corectarea, restabilirea sau modificarea
functiilor fiziologice sau pentru stabilirea unui diagnostic medical.
 Substanta – orice materie indiferent de origine (umana, animala,
vegetala, chimica) si care este utilizata in vederea obtinerii de
medicamente.
 Substante de uz farmaceutic (de origine organica sau
anorganica)
 Definite in suplimentele FRX – sa sau excipienti folosite in scopul
obtinerii de medicamente de uz uman sau veterinar;
 Se obtin prin sinteza, extractie, fermentatie sau natural.
 Substante de uz farmaceutic de calitate speciala
 Obtinerea de forme farmaceutice prevazute in FRX, cu exceptia
cazurilor in care se mentioneaza ca nu se pot utiliza;
 Medimente imunologice: vaccinuri.
7
 Reguli de buna practica de lab (BPL)
 Au fost stabilite prin 2 hotarari nr 63/24.01.2002 ulterior completata
cu hotararea nr 266/22.02.2006
 Principiile se bazeaza pe reglementari internationale si anume
Organizarea pt cooperare si dezvoltare economica (OCDE)
 Au stabilite reguli de BPL
 Regulile privind etichetarea, ambalarea sunt aplicate tuturor
substantelor;


 Sunt definite :
 Preparatele chmice;
 Modul in care se efectueaza testele clinice sau nonclinice etc
 In Romania – autoritatea e ANM

8
 Principii care stau la baza bunei practici de lab;
 Organizarea si personalul instalatiei de testare;
 Programul de asigurare a calitatii;
 Instalatiile de laborator;
 Aparatele. Materialele. Reactivii;
 Sisteme de testare (chimice, biologice);
 Substante chimice testate (SCT)/referinta (SCR);
 Metode standard de studii in laborator;
 Planul de studiu in laborator;
 Cum se introduce raportul in laborator;
 Stocarea si pastrarea materiei si arhivei.

9
 Stabilitatea medicamentului
 Principii generale
 „Niciodata nu a existat ceva facut de mana omului, care sa fie atat de
bine elaborat sau atat de bine stabilit incat sa fie nedegradabil odata cu
trecerea timpului...” Thomas Cranmer
 Tot ce este facut de mainile omului – de la sublimul Parthenon la uzualul
milkshake este supus degradarii. Produsele farmaceutice nu fac exceptie
de la aceasta afirmatie generala. Daca exista un atribut relevant al
calitatii unui produs medicamentos care sufera modificari odata cu
timpul, evaluarea acestei modificari face obiectul oamenilor de stiinta si
a celor ce impun normele in industria medicamentului, cuantificand
stabilitatea.
 Timpul in care produsele medicamentoase se degradeaza variaza
puternic. Unele produse farmaceutice radioactive trebuie folosite in
interval de 1-2 zile.

10
 Alte produse farmaceutice, pe de alta parte, daca sunt depozitate si
conditionate corespunzator isi mentin stabilitatea pentru un deceniu sau
chiar mai mult, desi, in multe state, durata maxima de viata pe care o va
aproba o agentie de reglementare a normelor este de 5 ani.
 Aceasta restrictie nu cauzeaza in general probleme, avand in vedere ca si
pentru produsele cu durata de viata de 5 ani este probabil ca peste 95%
din produs sa fie vandut si folost in treizeci de luni de la fabricatie, cu
conditia ca toti cei implicati sa asculte prima regula a depozitarii: primul
intrat, primul iesit.
 De vreme ce evaluarea stabilitatii unui produs medicamentos este foarte
elaborata, nu se pune accentul pe testarea organoleptica a produsului de
catre pacient.
 Astfel, guvernele din mai multe parti ale lumii – in special din Vestul
Europei, America de Nord si Japonia – au decis ca este necesara
instituirea obligatorie a testarii stabilitatii datorita grijilor ridicate de
siguranta, eficacitatea si calitatea produsului medicamentos. Totusi,
trebuie sa luam in considerare ca diverse companii reputabile acordau
atentie stabilitatii medicamentelor si luau masurile care se cuveneau
inainte de implicarea activa a guvernului.
11
 Inactivarea substantei medicamentoase
 Evident, pierderea s.m. este de o importanta majora in studiile de
stabilitate ale multor produse farmaceutice.
 Din pacate, avem impresia ca unii oameni iau in considerare acest
lucru doar cand se gandesc la efectele adverse ale stabilitatii
produsului medicamentos.
 Acest lucru este in mod evident neadevarat, iar pentru unele
produse inactivarea nu este factorul determinant al perioadei de
valabilitate.
 Totusi, este adevarat ca pentru multe produse, pierderea potentei
este de o importanta majora.
 In general, privim orice produs care contine mai putin de 90% din
cantitatea de s.m. mentionata pe prospect ca fiind de calitate
inacceptabila.

12
 Medicamentul in canalele de distributie
 Nu este suficient sa avem grija de stabilitatea produsului
medicamentos numai prin calitatea substantei pure a materialului
proaspat preparat, pe care il privim cu incredere in timp ce acesta
asteapta in depozit pentru distributie, dupa ce a fost scos din
carantina de catre Departamentul Controlului Calitatii/ Asigurarii
calitatii.
 Totusi, evaluarea probelor, care au fost depozitate in conditii ideale
in conele de depozitare pentru testarea stabilitatii ale fabricantului
sunt de valoare limitata.
 Probele retinute pentru testarea stabilitatii nu sunt scapate pe jos
dintr-un camion; nu sunt lasate in soare intr-un spatiu de incarcare;
nici nu sunt lasate in frig puternic; astfel, este destul de nepotrivit
sa ne asteptam ca probele de stabilitate sa reflecte cu acuratete
intervalul de stabilitate al produselor aflate in canalele de distributie.

13
 Medicamentul sub controlul pacientului
 Exista motive temeinice sa credem ca, in multe cazuri, conditiile in
care pacientii pastreaza medicamentele sunt departe de a fi optime.
La un anumit moment, autoritatile din domeniu luau in considerare
posibilitatea de a introduce termene de valabilitate obligatorii, care sa
garanteze eficacitatea, pana cand pacientul foloseste ultima doza din
produs. Acum este general acceptat faptul ca aceasta idee nu este
fezabila. Se cuvine, totusi, ca farmacistii sa isi faca timp sa consilieze
pacientii asupra modurilor adecvate de depozitare a medicamentelor.
 Stabilitatea in vivo
 Ultimul aspect al stabilitatii care ne preocupa este degradarea
medicamentului in-vivo. Mai exact, hidroliza medicamentului in
conditiile scazute de pH din stomac pot fi foarte serioase. Raspunsul
traditional la aceasta problema particulara este sa acoperim tabletele
cu pelicule gastrorezistente. In trecut, materialele folosite ca pelicule
gastrorezistente nu erau totdeauna eficiente. Polimerii disponibili la
ora actuala pentru pelicelel gastrorezistente sunt mult mai de
incredere.

14
 Cerintele institutiilor care reglementeaza piata farmaceutica
 In multe parti ale lumii, exista cerinte in ceea ce priveste testarea
stabilitatii, cerinte impuse de institutiile care reglementeaza piata
farmaceutica. Este totusi gresit sa nu luam in calcul aspectele
stiintifice particulare si sa efectuam doar acele teste obligatorii. Intr-
adevar, exista cazuri in care orice producator, cu o adevarata
inclinatie catre calitate, va efectua teste de stabilitate care sunt cu
mult peste testele obligatorii.


 Crearea unei baze de date care poate fi de folos in

formularea altor produse
 Datele obtinute in evaluarea stabilitatii produsului X in anul 1999 se
pot dovedi a fi de folos cand vom incepe dezvoltarea produsului Y,
in anul 2003. Pot exista situatii, desi probabil sunt rare, cand se va
merita sa continuam testarea stabilitatii in perioada de cercetare si
dezvoltare a formularii unui produs medicamentos, desi stim ca
acesta nu va fi comercializat, doar pentru ca suntem interesati de
stabilitatea unui nou excipient pe care l-am introdus in formulare.

15
 Tipuri de degradare
 Degradarea chimica (reducere, oxidare, hidroliza etc.) este des
intalnita. Cunostintele de cinetica ne pot fi de folos cand avem de-a face
cu degradarea chimica.
 Degradarea fizica poate fi cauzata de o varietate de factori (de
exemplu: impact, vibratie, abraziune, fluctuatii de temperatura precum
inghetarea sau topirea si fragmentarea).
 Degradarea biologica (si, mai ales, microbiologica) – In America de
Nord, Japonia si Europa de Vest, cei mai intalniti factori biologici care
sunt implicati in problemele de stabilitate sunt cei microbiologici. Totusi,
in unele parti ale lumii, sobolanii, viermii, mustele si alte organisme non-
microbiologice pot fi responsabile pentru problemele de stabilitate.
 Cunostinte stiintifice solide
 Nu mai este nevoie sa precizam ca testarea stabilitatii produselor
medicamentoase necesita o cunoastere corespunzatoare a formularii
farmaceutice, evaluarii, analizei si statisticii. Din pacate, inca mai sunt
companii unde personalul cu o astfel de educatie corespunzatoare
lipseste.
16
 Cunostinte la zi cu toate normele relevante ale institutiilor care
reglementeaza piata farmaceutica si cu standardele aplicate ale
Farmacopeei:
 Reglementarile oficiale si metodele standard de testare continua sa
evolueze. Astfel, este important ca cel putin o persoana din fiecare
companie sa fie insarcinata cu responsabilitatea de a pastra documente
la zi asupra datelor de la FDA si Conventia Farmacopeei USA sau de la
alte astfel de entitati, pentru ca ar putea avea un efect semnficativ
asupra designului, executiei, sau interpretarii testelor de stabilitate.
Folosirea forumului farmacopeei, jurnalul in care conventia Farmacopeei
SUA publica informatii esentiale despre metode sau monografii noi de
testare, ar trebui sa fie obligatorie in toate companiile in care
standardele sunt importante.
 Comunicarea eficienta intra statia pilot, productie, controlul
calitatii/evaluarea calitatii, reclamatii si diferite reglementari:
 Pentru a avea un program de succes de testare a stabilitatii, este
important sa existe o comunicare clara, eficare si rapida intre toate
entitatile organizatorice dintr-o companie, care pot furniza date
folositoare in programul de stabilitate.
17
 Monitorizarea atenta a bugetului alocat stabilitatii medicamentului
Este surprinzator ca unele companii nu au un buget de stabilitate. Este
si mai surprinzator sa aflam ca exista oameni de stiinta care dezvolta
protocoalele de stabilitate pe baza exclusiva a diferentei de pret. Nu este usor
sa elaboram un mecanism pentru evitarea unui buget de stabilitate despre
care putem spune cu siguranta ca ne va costa o suma fixa de bani. Totusi, desi
suma estimata este relativa, poate fi totusi foarte folositoare.
 Abilitatile manageriale pentru a coordona si optimiza programul
Piatra de capatai a unui program de stabilitate cost-eficienta de inalta
performanta o constituie abilitatile manageriale care promoveaza si
coordoneaza abilitatile personale si profesionale ale tuturor celor implicati in
program.
 Perioada de conformitate, termenul de valabilitate si data de expirare
Perioada de conformitate a unui produs medicamentos este definita de
cele mai vulnerabile calitati dependente de timp. Dupa cum a fost indicat si
mai devreme, pierderea activitatii este pentru multe produse, parametrul critic.
In acele cazuri in care alte atribute sunt mai vulnerabile, atributul in cauza va
defini perioada de conformitate.
 Perioada de viata atribuita unui produs este egala sau mai mica decat
perioada de conformitate, fiind de obicei un numar rotunjit convenabil.
18
 Data de expirare plasata pe eticheta oricarui lot indica data la care
ia sfarsit perioada de viata pentru fiecare lot. Astfel, daca produsul
este depozitat conform instructiunilor de pe eticheta, se asteapta ca
produsul in cauza sa isi pastreze valabilitatea pana la acea data.


 Cateva strategii posibile pentru a imbunatati termenul de valabilitate

 Din fericire, multe substante medicamentoase si produse sunt
inerent stabile si, astfel, cu putina dificultate putem justifica o
perioada de valabilitate de 3 ani sau mai mult. Totusi, exista s.m.
care sunt mult mai supuse degradarii este nevoie de multa munca
pentru a dezvolta un produs cu o perioada de viata comerciala
acceptabila.

19
 Oxidarea in solutie
 Reactiile de oxidare sunt relativ rare in formele farmaceutice, ca
reactii principale. De cele mai multe ori oxidarea duce la canitati
mici de compusi de degradare neidentificate. Cand o reactie de
oxidare este una dintre reactiile principale, atunci avem de-a face cu
o problema serioasa, iar formularea poate deveni destul de dificila in
acest caz. Exemple notabile sunt constituite de produsele lichide cu
vitamina A.


 Mecanisme de oxidare
 Oxidarea, dupa cum sugereaza si numele, este o interactiune intre
s.m., A si oxigenul, iar reactia ar fi de tipul:
 A + O2 -> produsi;
 In practica, complexarea metalelor grele (de ex, prin folosirea
EDTA), este adesea folosita de vreme ce, dupa cum am vazut si mai
devreme, ionii metalici actioneaza in detrimentul stabilitatii
medicamentului, in ceea ce priveste situatiile oxidative.

20

 Antioxidanti
 Functioneaza prin consumptia de oxigen la o viteza mai mare decat
viteza la care s.m. reactioneaza cu oxigenul; in astfel de cazuri
acestia vor proteja s.m. pana ce sunt epuizati complet.


 Cataliza, complexare, fotoliza

 Cataliza acida si bazica, constituie doar un exemplu de cataliza.
Cand discutam despre acest subiect, totusi descompunerea indusa
de metal este preocuparea cercetatorului din industria farmaceutica.
Se pune un mare accent pe eliminarea metalelor, mai ales in
produsele parenterale, deoarece si descompuneri infime ale urmelor
de metale pot cauza o schimbare a culorii, incat produsul sa devina
nesatisfacator. Exemple pentru acest caz sunt injectabilele cu
clorhidrat de tiamina si cele cu acid ascorbic.

21
 Complexarea – este evident ca, in multe cazuri, medicamentele pot
contribui la reactii de complexare cu una sau mai multe din
substantele unei forme farmaceutice. Uneori aceste lucruri sunt
intentionate – biodisponibilitatea in anumite cazuri poate fi
imbunatatita. In alte cazuri, stabilitatea unui medicament este afectat
favorabil de complexare, desi in multe cazuri este afectata nefavorabil.


 Agentii de complexare – cafeina si polivinilpirolidona erau cei mai

intalniti agenti de complexare folositi in farmaceutica pentru o mare
perioada de timp. Recent, ciclodextrinele au devenit foarte
importante.
 Ciclodextrinele sunt agenti puternici de complexare, studii numeroase
fiind efectuate pe tema folosirii acestora in solubilizarea si stabilizarea
medicamentelor.
 Fotoliza – un mare accent in Codul de Buna Practica din 1993 este
pus pe stabilitatea in prezenta luminii, desi la acest moment, metodele
de testare nu sunt finalizate.

22
 Stabilitatea pentru starea de agregare solida – stabilitatea
medicamentelor din formele farmaceutice solide este cea mai
importanta, de vreme ce formele farmaceutice solide sunt mai intalnite
decat alte forme si pentru ca primele probe clinice sunt de obicei
efectuate asupra acestui tip.
 Interactiuni ce implica o faza lichida
 Uneori, o s.a. sau un produs de descompunere dintr-o forma
farmaceutica solida este lichid si poate interactiona cu alte ingrediente
din forma farmaceutica.
 Un exemplu tipic il constituie cercetarile efectuate de Troup si Mitchner
(1964) ce implica aspirina si fenilefrina. Autorii au aratat ca
descompunerea fenilefrinei este direct proportionala cu formarea
acidului salicilic.
 Acestia au aratat ca descompunerea fenilefrinei este o reactie de
acetilare. Acest lucru poate fi privit din mai multe perspective. Trebuie
sa existe umiditate pentru ca hidroliza aspirinei sa aiba loc. C6H4

23
 Daca acidul saliclic este format prin interactiunea aspirinei cu urme de
apa, atunci acidul acetic format poate reactiona cu fenilefrina
(R(OH)3), care pune din nou in libertate apa, astfel incat umiditatea nu
joaca un rol cantitativ in reactia globala.
 Cu alte cuvinte:

 C6C4(OCOCH3) +H2O -> C6H4(OH)COOH + CH3COOH;

 CH3COOH + 1/3R(OH)3 -> 1/3 R(OCOCH3)3 + H2O

24
 Cazuri de interactiune ale unui solid cu un medicament
putin solubil

 Exista cazuri in care lichidele se afla intr-o forma farmaceutica

solida. Un exemplu il constituie pantenolul in comprimatele de
multivitamine.
 Aici se obisnuieste sa se adsoarba lichidul pe un transportor solid,
iar in cazul pantenolului este folosit trislicat de magneziu. La
temperaturi ridicate (si la temperatura camerei sub presiune, de
asemenea) pantenolul va iesi din transportor si va veni in contact
direct cu celelalte solide.
 Daca exista potentiale de interactiune, atunci se recurge la
tabletarea tristratificata (sau filmarea sub presiune).
 In acest caz, lichidul inca va mai curge in stratul ce contine
reactantul, dar reactia va fi controlata prin difuzie.

25
 Reactii prin intermediul fazei gazoase
 Cateodata presiunea de vapori a unui medicament este suficient de
ridicata, incat poate interactiona cu alte substante prin intermediul
fazei de vapori.
 Un astfel de exemplu este ibuprofenul (B). Acesta este un acid
Lewis si poate interactiona cu bazele Lewis. Masurile uzuale, cum ar
fi comprimatele tristratificate, nu functioneaza in acest caz, de
vreme ce reactantul va fi prezent in faza gazoasa.

 Daca reactia cu alt medicament (D) este: D+B->descompunere,

atunci viteza reactiei initiale este data de d{D}/dt=-kPB[D]a
 Unde {D} este densitatea de suprafata a D molecule (nr de
molecule pe cm patrat) la momentul t, iar A este aria suprafetei.

26
 Fotoliza in stare solida
 Nu exista un volum mare de munca sistematizat pe subiectul
fotolizei solidelor. Lachman si colab (1961) au aratat de multe ori ca
un comprimat solid se va descompune prin descompunere fotolitica
doar in zona de suprafata, a.i. o tableta poate fi practica neafectata
in interior.


 Caracteristicile fizice ale solidelor

 Inainte sa se discute despre stabilitatea medicamentelor in stare
solida, este necesar sa se sublinieze cateva caracteristici ale
acestora. Este de ajuns sa se mentioneze ca solidele pot fi
caracterizate ca fiind (a) cristaline sau (b) amorfe. Solidele cristaline
sunt asociate cu aranjamentul Bravais, iar solidele amorfe sunt
solide care nu sunt cristaline.

27
 Polimorfismul
 Solidele anorganice (in special ionice) sunt asociate uzual cu un (unul si doar
unul) sistem cristalin. Se stie, in general, ca sarea de bucatarie este cubica;
 Solidele organice, totusi, depinzand de faptul cum sunt recristalizate pot
aparea in mai multe forme cristaline diferite (polimorfism). Exista 2 tipuri de
polimorfism: enantiotrop si monotrop.
 Preformularea
 De-a lungul timpului, preformularile au evoluat – in special in anii 1950 si
1960 ca rezultatul unei schimbari in accentul pus pe dezvoltarea produselor
farmaceutice industriale. Pana la mijlocul anilor 1950, accentul principal in
dezvoltarea produselor era pus pe dezvoltarea armonioasa a formelor
farmaceutice, consideratiile organoleptice dominand grijile (care erau practic
inexistente la acea vreme) conform carora un colorant folosit in formulare ar
putea afecta stabilitatea sau biodisponibilitatea.
 De fapt, farmacocinetica si biofarmacia erau in stadiile lor incipiente si, in
pofida faptului ca stabilitatea era o grija principala, majoritatea
metodologiilor analitice erau de asa natura incat chiar si descumpunerea
primara avea loc fara a fi identificata.

 28
 Sincronizarea si obiectivele preformularii
 Obiectivele programului sunt astfel: (1) stabilirea parametrilor fizico-chimic
necesari, (2) determinarea profilului de viteza cinetica, (3) stabilirea
caracteristicilor sale fizice si (4) stabilirea compatibilitatii cu excipientii
uzuali.


 Solubilitatea – un obiectiv important al eforturilor de preformulare este de a

concepe o metoda pentru obtinerea solutiilor de s.m. Frecvent,
medicamentul nu este suficient de solubil in apa pentru a permite
concentratiile dorite, de exemplu pentru solutiile injectabile. Solubilitatile
sunt determinate prin expunerea unui exces de solid la lichidul in cauza si
dupa ce graficul la echilibru a fost trasat.
 Predictia solubilitatii – este avantajos pentru o noua s.m. sa se poata estima
care este valoarea solubilitatii, inaintea desfasurarii evenimentelor de
dizolvare. Exista mai multe sisteme de predictie ale solubilitatii si anume:
cercetarile efectuate de Amidon si colab (1974) si Yalkowsky si colab.
Ecuatia lor pt solubilitatea p-aminobenzoatilor in solventi polari si micsti este
un analog bidimensional simplificat al ecuatiei Scatchard-Hildebrand si se
bazeaza pe produsul tenstiunii interfaciale si pe aria de suprafata moleculara
a portiunii hidrocarbonat a moleculei.
29
 Dizolvarea – importanta dizolvarii este a.i. (din consideratii
biofarmaceutice) sunt folosite Farm. SUA si e necesara pentru
aplicarea pentru Noile Medicamente ale formelor farmaceutice soide.
Potrivit cercetarilor efectuate de Noyes si Whitney :
 dm/dt= VdC/dt = - kA(S-C)
 Unde m este masa nedizolvata, V este volumul de lichid, t este
timpul, k este asa numita viteza constanta de dizolvare intrinseca
(cm/s) si A este aria suprafetei solidului dizolvat.


 Solubilitatea polimorfilor metastabili

 Polimorfismul este un aspect important al proprietatilor fizice ale
s.m. Una dintre caracteristicile unei polimorfe metastabile este ca
sunt mai solubile decat cele stabile.

30
 Higroscopicitatea
 Este, desigur, o caracteristica importanta a unei pulberi. Poate fi
demonstrat pentru un compus relativ solubil ca higroscopicitatea este
corelata cu solubilitatea (Carstense, 1977, VanCampen si colab 1980), desi
s-a demonstrat ca entalpia solutiei joaca un rol important in ceea ce este
cunoscut drept higroscopicitate (VanCampen si colab, 1983 a,b,c).
 Teste de compatibilitate
 Inainte de a testa prima formulare a unui nou medicament, cele mai multe
grupuri de cercetare desfasoara teste de compatibilitate (Carstensen si
colab, 1964). Principiul este de a descoperi rapoarte rezonabile pentru
amestecul s.m./excipient, pentru a vedea care excipienti sunt cei potriviti
pentru medicament.
 Compatibilitatea cu recipientele de conditionare
 Studiile asupra compatibilitatii pot include de asemenea si compatibilitatea
cu materialele containerelor. Hourcade si colab (1977), de exemplu, au
semnalat ca granisetronul in concentratii de 1mg/mL, cand este pastrat in
seringi de polipropilena era destul de stabil, pe cand dilutiile de 0,9% NaCl
sau de 5% glucoza au dus la o stabilitate de depozit nesatisfacatoare.

 31
 Probleme generale ale analizei
medicamentelor
FR X - capitolul “Monografii- Metode generale de analiză”:
 Prelevarea probelor pentru analiză.
 Controlul organoleptic
 Determinări fizice şi fizico-chimice
 Determinări cantitative
 Determinări farmacognostice
 Analiza farmacognostică este definită ca un ansamblu de metode
calitative şi cantitative, efectuate cu scopul determinării
identităţii, purităţii şi calităţii produselor vegetale.
 Determinări farmacotehnice
 Determinări biologice şi biochimice
 Controlul preparatelor radiofarmaceutice

 Analiza medicamentului defineste in sens larg

examinarea partilor constituiente ale unui intreg
reprezentat de medicament, presupunand specific
determinarea calitativa si/sau cantitativa a compozitiei
si/sau structurii substantelor sau amestecurilor utilizand
strategii, metode si instrumente caracteristice. 32
 MEDICAMENT/
SUBSTANTA 1. Prelevarea probei
MEDICAMENTOASA

2. Pregatirea probei
PROBA FINALA pentru analiza PROBA REPREZENTATIVA
DE ANALIZAT

3. Determinari experimentale
(preliminare, calitative, cantitative) DATE
- direct, fara pregatire EXPERIMENTALE
- dupa o prelucrare specifica

4. Evaluarea critica
a rezultatelor

REZULTATUL ANALIZEI
BULETIN DE ANALIZA
33
 PRELEVAREA PROBELOR PENTRU ANALIZA

« Probele prelevate pentru determinarile calitative şi

cantitative trebuie să reprezinte, sub toate aspectele,
caracteristicile produsului din lotul sau seria respectiva»
(FR-X)

FR-X:
• lot - o cantitate de materie primă, presupusă a fi unitară,
din care se obţin una sau mai multe serii de produse

• serie - totalitatea unităţilor de produs obţinute în condiţii

identice, într-un singur ciclu de operaţii

• recipient - conţine unităţile de produs care constituie o

serie, ex. flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii, pungi etc.

• ambalaj - conţine recipientele grupate adecvat

34
 PRELEVAREA PROBELOR

DEPOZIT FARMACII

Lot Serie Subst. farm. Prep. ind. Elaborate

Cantitate – 4p Cantitate – 3p Laborator Cantitate – 3p Cantitate – 2p

Masade analiza Cantitate – 3p
2p proba 2p proba 2p proba 1p proba
Cantitate – 1p 2p proba
2p contraproba 1p contraproba 1p contraproba 1p contraproba
1p contraproba

35
 Prelevarea probelor dintr-un lot
 1. Produsele lichide – se omogenizeaza, in prealabil, prin agitare
dupa care se face o prelevare.
 Daca lotul este repartizat in mai multe recipiente, se face prelevarea
(analiza) din fiecare recipient.


 2. Produsele solide (moi, vascoase) se preleveaza o proba din

stratul inferior, mijlociu, superior.
 Aceste 3 probe prelevate se amesteca intre ele si reprezinta proba
medie pe recipient;
 Din aceasta proba medie pe recipient se retine o cantitate de 4 ori
mai mare decat cantitatea necesara efectuarii tuturor analizelor
(identificare, puritate, dozare, analiza formei farmaceutice conf
FRX);
 Aceasta cantitate se imparte in 2: ½ este destinata efectuarii
analizelor mentionate si ½ reprezinta contraproba (se pastreaza pe
toata perioada de valabilitate a produsului respectiv;

36
 In procesul de prelevare a probelor se evita interactiunea intre
produsul analizat si ustensilele necesare analizei;
 Probele si contraprobele se introduc in flacoane (perfect uscate,
etanse si daca este cazul pentru cele fotosensibile in flacoane
inchise la culoare).
 Produsele vegetale se introduc in pungi sau cutii captusite cu hartie
pergaminata;
 Probele si contraprobele se sigileaza si pe eticheta se specifica:
 Denumirea produsului;
 Nr lotului;
 Provenienta;
 Calitatea prelevata;
 Nr. Procesului verbaL prin care s-a facut prelevarea;
 Data la care s-a facut prelevarea;
 Persoana care a facut prelevarea;
 Semnatura.

37
 Prelevarea probelor dintr-o serie
 Se face din recipienti a.i. proba respectiva sa fie reprezentativa pt
intreaga serie;
 Conditiile sunt stabilite de producator conform legislatiei in vigoare
din aceste probe prelevate se retine o cantitate de 3 ori mai mare
decat cea necesara efectuarii analizelor conform FRX;
 2/3 din aceasta cantitate reprezinta proba si 1/3 contraproba care
se pastreaza pe toata durata de valabilitate a produsului respectiv.


 Prelevarea de probe din farmacii/depozite

 Se preleveaza o cantitate de substanta de analizat – proces verbal
de scadere din gestiune;
 Reactiile de identificare la masa de analizat – reactii calitative;
 Masa de analiza este dotata cu reactivi necesari analizelor calitative
conform prevederilor FRX.

38
 Prelevari de probe din laborator
 Se preleveaza o cantitate de 3 ori mai mare decat cantitatea
necesara efectuarii tuturor analizelor;
 2/3 sunt destinate analizei si 1/3 reprezinta contraproba care se
pastreaza pe toata durata de valabilitate a produsului repspectiv.


 Prelevari de probe in industria medicamentului

 Se preleveaza o cantiate de 3 ori mai mare decat cantitatea
necesara efectuarii tuturor analizelor;
 2/3 reprezinta proba de analizat si 1/3 contraproba care se
pastreaza pe toata durata de valabilitate a produsului respectiv;
 Probele se eticheteaza, se sigileaza si pe eticheta se scrie:
denumirea substantei, data, cantitatea prelevata, procesul verbal si
semnatura.

39
 CONTROLUL ORGANOLEPTIC

Aspect

Miros CONTROL ORGANOLEPTIC Gust

Culoare

40
 DETERMINARI FIZICE, FIZICO-CHIMICE ŞI
CHIMICE
DETERMINAREA SOLUBILITĂŢII

 prevederile de la alineatul "Solubilitate" au un caracter orientativ

privind solubilitatea substanţelor în diferiţi solvenţi
 prevederile înscrise în cadrul altor alineate, cum ar fi
"solubilitatea în alcool", au un caracter obligatoriu, fiind
considerate teste de puritate
 Solubilitatea poate fi exprimată prin specificarea volumului de
solvent (în mililitri) necesar pentru a dizolva 1 g substanţă solidă
sau 1 ml substanţă lichidă, la temperatura de 20  20C.
 Verificarea solubilităţii substanţelor farmaceutice nu este
necesar să se efectueze în toţi solvenţii prevăzuţi în monografie,
ci este necesar să se controleze solubilitatea în cel puţin doi
solvenţi diferiţi.
 Dacă se constată prezenţa unor impurităţi insolubile, se verifică
solubilitatea şi în ceilalţi solvenţi prevăzuţi.

41
 Diferitele solubilităţi pot fi exprimate şi cu ajutorul unor
expresii - în acest caz prevederile de solubilitate se referă la
temperatura de 20  5oC.

Expresii folosite Volumul de solvent (ml) necesar pentru a

dizolva 1 g substanţă solidă sau 1 ml
substanţă lichidă
foarte uşor solubil cel mult 1 ml
uşor solubil de la 1 ml până la 10 ml
solubil de la 10 ml până la 30 ml
puţin solubil de la 30 ml până la 100 ml
foarte puţin solubil de la 100 ml până la 500 ml
greu solubil de la 500 ml până la 1000 ml
foarte greu solubil de la 1000 ml până la 10.000 ml
practic insolubil mai mult de 10.000 ml

42
 DETERMINAREA INDICILOR
 Indice de aciditate = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor graşi liberi
conţinuţi în 1 g probă de analizat (uleiuri volatile, uleiuri grase,
balsamuri, ceruri etc.).

 Se calculează conform formulei:

5.61  V
I 
A m
în care:
- IA = indice de aciditate
- V = volumul de KOH 0.1 mol/l în apă folosit la titrare (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 5.61 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.1
mol/l.

43
 Indice de saponificare = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor liberi şi a acizilor
rezultaţi din saponificarea a 1 g probă de analizat.

 Se calculează conform formulei:

(V1  V2 )  28.05
IS 
m
în care:
- IS = indice de saponificare
- V1 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH
0.5 mol/l în alcool.

44
 Indice de ester = numărul de miligrame de hidroxid de potasiu
necesar pentru neutralizarea acizilor graşi rezultaţi din
saponificarea a 1 g probă de analizat.

 Se calculează conform formulei:

în care:
- IE = indice de ester
- IS = indice de saponificare
- IA = indice de aciditate.

45
 Indice de hidroxil = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1
g probă de analizat.

 Se calculează conform formulei:

(V1  V2 )  28.05
IH   IA
m

în care:
- IH = indice de hidroxil
- V1 = volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- IA = indice de aciditate
-28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.5
mol/l în alcool.

46
 Indice de iod = numărul de grame de iod fixat de 100 g probă
de analizat.

 Se calculează conform formulei:

(V1  V2 )  0.01269
II  .100
m

în care:
- II = indice de iod
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 0.01269 = numărul de grame de iod corespunzător la 1 ml Na2S2O3
0.1 mol/l.

47
 Indice de peroxid = numărul de mililitri de tiosulfat de sodiu
0.01 mol/l oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric prin
acţiunea peroxizilor din 1 g probă de analizat.

 Se calculează conform formulei:

10  (V2  V1 )
Ip 
m
în care:
- IP = indice de peroxid
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea martorului
(ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame).

48
 DETERMINAREA PUNCTULUI DE TOPIRE
 Punct de topire = temperatura la care o substanţă se topeşte
complet.
 Dacă substanţa se topeşte cu descompunere, se consideră punct de
topire sau punct de descompunere, temperatura la care substanţa
îşi schimbă aspectul (se brunifică sau apar bule de gaze).

 p.t. substanţe solide pulverizabile

 se efectuează în dispozitive speciale

sau într-un balon Kjeldahl cu
capacitatea de 150 - 250 ml, în care
se introduce un termometru potrivit.
 la termometru se ataşează, cu
ajutorul unui inel de cauciuc sau prin
aderenţă, un tub capilar din sticlă,
închis la un capăt.
 ca lichid de încălzire se foloseşte:
- apa distilată – p.t. < 700C
- parafina lichidă, acidul sulfuric sau
uleiul de silicon - p.t > 700C

49
 Determinare:
 proba de analizat pulverizată şi uscată se introduce în tubul capilar şi se tasează
pentru a forma un strat compact de 3 - 4 mm înălţime
 tubul capilar se ataşează la termometru
 incălzirea se efectuează astfel încât temperatura să se ridice cu 3 - 40C/minut.
 se citeşte temperatura la care substanţa se topeşte complet.
 În cazul substanţelor care se descompun prin încălzire prelungită, balonul se
încălzeşte, în prealabil, până la o temperatură cu aproximativ 100C sub punctul
de topire presupus, după care se ataşează capilarul cu substanţa şi se continuă
încălzirea astfel încât temperatura să se ridice cu 1 - 20C/minut.
 Dacă punctul de topire al probei de analizat nu este cunoscut, se efectuează, în
prealabil, o determinare orientativă.

50
 În unele cazuri, specificate în monografii, punctul de topire se determină
cu un microscop special prevăzut cu un dispozitiv de încălzire.

Termomicroscopie ( microscop Boetius ) 6

1 – sursă de lumină
2 – masă de probă încălzită
3 – termometru
4 – obiectiv
5
5 – sursă de lumină
6 – ocular
4
7 – mâner pentru poziţionarea probei
2

7 3
51
 DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ÎN ALCOOL
 se bazează pe distilarea alcoolului
 se determina densitatea sau indicele de refracţie a distilatului
hidroalcoolic.

 Determinare:
 se foloseşte un aparat de distilare cu alonjă care trebuie să pătrundă în
apă
 se distilă nu mai mult de 30 minute
 se determină densitatea relativă cu ajutorul picnometrului şi se citeste
concentraţia în alcool a distilatului (% m/V) din tabele alcoolmetrice.

 se calculează dupa formula:

în care:
- c = concentraţia în alcool a distilatului
corespunzătoare densităţii relative (% m/V)
- m = masa probei luate în lucru (g).
52
prin volatilizare cromatografice
- Distilare

METODE DE SEPARARE

prin extracţie:
- lichid-lichid
- solid-lichid
- in faza solida
- cu fluide supercritice
53
METODE DE SEPARARE PRIN VOLATILIZARE
- DISTILAREA -

 Distilarea este una din cele mai vechi metode de separare si

purificare a lichidelor.
 Separarea se bazează pe diferenţele dintre presiunile de vapori
ale lichidelor care compun un amestec.
 Pe scurt, distilarea presupune încălzirea lichidelor, separând
vaporii si recondensându-i pentru a obţine un nou lichid care
va fi concentrat în compuşi mai volatili.

PARAMETRII DE LUCRU ŞI EFICIENŢĂ:

 echilibrul de distributie vapori-lichid
 volatilitatea relativa
 talerul teoretic

54
Curbe de distilare

55
 METODE DE SEPARARE PRIN EXTRACTIE

EXTRACŢIA LICHID – LICHID

 Extracţie = transferul unei substanţe dizolvate dintr-un solvent

în alt solvent nemiscibil cu primul.

 Distribuţia substanţei respective între cele două faze depinde de

solubilitatea acesteia în cei doi solvenţi.
 Componenţii supuşi distribuţiei interfazice manifestă preferinţe
pentru unul sau altul dintre solvenţi, participând selectiv la
procesul de transfer.

 Dacă la echilibru concentraţiile componenţilor sunt sensibil

diferite între cei doi solvenţi, procesul poate fi utilizat în scopul
separării lor.

56
 Etape in extracţia lichid – lichid:
1. formarea speciei extractibile şi punerea sa în contact cu
sistemul de solvenţi adecvaţi

2. sedimentarea

3. decantarea

4. determinarea cantitativă a componenţilor izolaţi

5. recuperarea solvenţilor

 Etapa cea mai importantă este cea de selecţionare a sistemului de

solvenţi şi stabilirea formei sub care este extrasă substanţa. Aceasta
se poate realiza prin cunoaşterea parametrilor procesului de extracţie
care sunt:
● constanta de repartiţie
● coeficientul de extracţie
● factorul de recuperare.
57
PROCEDEE DE EXTRACŢIE LICHID-LICHID

 După sensul de curgere al lichidului şi după principiul

de funcţionare al instalaţiei:

1. Extracţia simplă
2. Extracţia continuă
3. Distribuţia în contracurent.

58
 EXTRACŢIA SOLID-LICHID
Principii generale
 se aplică atunci cand este o fază solidă sau semi-solidă (material vegetal, pulberi
de forme farmaceutice solide etc.)
 implică operaţiile de extracţie de tip percolare, filtrare şi spălare.

 Are 2 etape, realizate în acelaşi aparat sau în aparate separate:

o contactul solventului cu materialul solid supus extracţiei şi transferul
constituientului solubil (solut) în solvent
o separarea sau spălarea soluţiei de reziduul solid

 Procesul complet include recuperarea solutului separat şi a solventului, prin

evaporare sau distilare.

APARATURA
 depinde de prima etapă
 termeni ce indicǎ tipul de aparat utilizat:
o “solid bed” sau “fixed bed” - se referă la orice operaţie în care prin materialul
solid fix trece solventul utilizat pentru extracţie
o “dispersed contact” - se referă la operaţiile în care particulele solide, suspendate
în fluid sunt în mişcare relativă unele faţă de altele şi faţă de solvent, în timpul
contactului solid-solvent.

59
 EXTRACTIA IN FAZA SOLIDA
(SOLID-PHASE-EXTRACTION, SPE)

 este un proces de separare prin care compuşi dizolvaţi sau suspendaţi

într-un amestec lichid sunt separaţi de alti compusi din amestec în funcţie
de proprietăţile lor fizice şi chimice

poate fi folosită pentru a izola analiţii de interes dintr-o mare varietate de

matrici, inclusiv urină, sânge, apă, băuturi, sol, şi ţesuturi de origine
animală

 utilizează afinitatea substanţelor dizolvate sau suspendate într-un lichid

(faza mobilă), pentru un solid prin care proba este trecută (faza staţionară)
pentru a separa dintr-un amestec componentele dorite şi nedorite

 rezultatul
 analiţii de interes doriţi sau impurităţile nedorite din proba sunt reţinute
pe faza staţionară
 partea care trece prin faza staţionară este colectată sau casată (daca
conţine analiţii doriţi sau impurităţile nedorite)
 in cazul în care porţiunea reţinută în faza staţionară include analiţii doriţi,
aceştia pot fi apoi separaţi din faza staţionară prin colectare printr-un
proces suplimentar, în care faza staţionară se spală cu un eluent
corespunzător.
60
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTĂ PERFORMANŢĂ
HIGH PERFORMANCE/PRESSURE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)
 Cromatografia de lichide de înaltă performanţă/înaltă presiune
(High Performance/Pressure Liquid Chromatography - HPLC) sau
de înaltă viteză (High Speed Liquid Chromatography – HSLC) este
o tehnică:
 modernă şi rapidă care elimină unele dezavantaje ale
cromatografiei planare
 utilizată pentru separarea şi determinarea soluţilor organici şi
anorganici din orice probe, în special substanţe şi produse
farmaceutice, biologice, alimentare, industriale, de mediu etc.

Clasificare
În funcţie de mecanismele care stau la baza separării
componentelor, cromatografia de lichide se clasificǎ astfel:
 cromatografie prin adsorbţie
 cromatografie prin repartiţie
 cromatografie cu faze inverse
 cromatografie prin schimb ionic
 cromatografie prin excluziune moleculară.
61
 APARATURA
Schema unui cromatograf HPLC

-1-2 sau mai multe rezervoare cu solventi

- o pompă de înaltă presiune
- sistem de degazare
- injector pentru introducerea probei
- (precoloane) coloane cromatografice
- detectoare
- sistem de prelucrare a datelor
62
 APLICAŢIILE HPLC
ANALIZA CALITATIVA
 Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase

Identificarea unui component prezent intr-un amestec se poate face dupa

cromatografiere prin:
 Metode cromatografice:
- Dupa marimile de retentie
- Metoda adaosului standard
- Metoda retentiei relative
 Metode spectrale
Alcaloizi din ergot
elimoclavina lisergol

CH2OH
H CH2OH

H
N CH N CH
3 3
H H

HN
HN

63
  Atenolol Condiţii:
 Coloana: -Burke, 2 4.6 mm x 25 cm
 Faza mobilǎ: CH2Cl2-EtOH-MeOH(85:10:5),15 mM
H2N
NH4OAc
O  Viteza de curgere: 1 ml/min;
O N  Detecţie: 254 nm
OH H  Timp de curgere = 16 min
 K’ = 4.41
 =1.13

Bupivacaina
Condiţii:
 Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm i.d.

CH3  Faza mobilã:hexan-n-propanol-trietilamina

H H
N (80:20:0.1)
N  Viteza de curgere : 1 ml/min
O  Detecţie : 254 nm
CH3 CH3  Timp de curgere: 7-8 min
 K’ = 1.89
  = 1.25

64
  Efedrina
Condiţii:
CH3  Coloana: Chiral AGP
H C NH CH3  100 x 4.0 mm
H C OH  Precoloanã: Chiral AGP, 10 x 3.0 mm
 Faza mobilã: ac. octanoic 0.001 M în
tampon fosfat pH 7.0
 Detecţie: 225 nm

Ketoconazol Condiţii:
•Coloana: (S,S)Whelk-O 1
•10/100(FEC) 25 x 4.6 mm
N
•Faza mobilã: Diclormetan-hexan-
IPA + 0.011 M acetat de amoniu
N
O (46:46:8)
O
N N O
•Viteza de curgere: 1.5 m>/min
H3C
H
O
•Detecţie: 254 nm
Cl
Cl
•Timp de reţinere: 16 min
•K’ = 6.60
• = 1.19

65
  Analiza produşilor modificaţi chimic (prin derivatizare)

 este adesea necesară pentru a atinge o cromatografie

satisfăcătoare.
 se aplică pentru componentele de toate polarităţile şi greutăţile
moleculare şi este un avantaj al HPLC faţă de gaz-cromatografie.
 Este utilizată pentru a creşte sensibilitatea detecţiei cand
detectările utilizate nu sunt satisfăcătoare pentru componentele
nederivate.
 Absorbţia în UV şi fluorescenţa pot fi obţinute cu ajutorul unor
reactivi.
 UV: N-succinimid-p-nitrofenilacetat (SNPA), fenilhidrazină şi 3,5-
dinitrobenzen (DNBC).
 derivaţii fluorescenţi pot fi formaţi cu agenţi de tipul: cloruri de
dansil (DNS-Cl), 4-bromometil-7-metoxicumarina (BMC) şi cu unele
amine fluorescente.

66
  Detectarea imunologică

 Tehnica implică colectarea de solvent în fracţiuni mici (1 ml) şi prelevări

de medicament în fracţiuni.

 Necesitã mult timp, dar au reversibilitate şi selectivitate mai mare decat

detectările convenţionale.

 În multe cazuri, lichidele biologice pot fi injectate direct în coloană.

 HPLC cu detectare imunologică este utilizată pentru analiza

metaboliţilor care sunt dificil de izolat din lichidele biologice prin extracţie
(glucuronidele). Astfel de compuşi polari nu pot fi observaţi în concentraţii
mici prin detectări convenţionale, ele fiind mascate de componentele
endogene.

 Poate fi utilizată pentru determinarea: canabinoidelor, opioidelor,

lisergidelor, glicozidelor cardiotonice din lichidele biologice.

67
ANALIZA CANTITATIVA
 Se bazeaza pe corelatia care exista intre aria (inaltimea)
picului si concentratia componentului respectiv.

 Metodele de determinare constau in masurarea:

 Aria picului:
- metode manuale
- metode electronice
 Concentratia probei:
- metoda normarii ariilor
- calibrare cu standard extern
- metoda standardului intern
- metoda adausului standard

68
 Determinarea cantitativã a substanţelor farmaceutice

 Determinarea cantitativã a vitaminei B-12 din ser

Condiţii:
• HPLC/ICP-MS
• ICP = Inductively coupled plasma emission spectrometer
• HPLC/ICP-MS cu sistem de lucru LC-10A, ELAN6100,
Waitress’s LC
• Coloana:COSMOSIL, 5C18-AR
• Faza mobilã: apã-ac.acetic-isopropanol (90:1:9)
• Viteza de curgere: 10 ml/min

 Determinarea amitriptilinei şi perfenazinei

Condiţii:
• HPLC/Agilent 1000
• Coloana: cianopropil
• Faza mobilã: acetonitril-metanol-fosfat monopotasic
• Viteza de curgere 2.0 mL/min
• Detecţie: UV 215 nm

69
 Determinarea omapatrilatului din plasmã (inhibitor de
endopeptidazã)
Condiţii
S H •HPLC: Waters 510 HPLC pump,
O Waters automated gradient
HS
N •Coloana analiticã BDS Hypercil C8 (3
H O
COOH
m, 50 mm×2 mm ID) precedatã de
Hypercil C8.
•Faza mobilã: 62.5 % apã şi 37.5 %
acetonitril, cu acetat de amoniu 1
mmol/L la pH 5.5.
•Viteza de curgere: 0.2 mL/min,
•Volumul injectat 25 L.
 Alte determinǎri cantitative
• Determinarea activităţii antioxidante a capsaicinei;
• Determinarea cantitativă a aminoacizilor din lichidul
cefalorahidian;
• Determinarea cantitativǎ a cumarinei din extracte alcoolice.

70
 GAZ – CROMATOGRAFIA
GAS-CHROMATOGRAPHY (GC)
Definitie
Atunci când se foloseşte un gaz ca fază mobilă într-un sistem
cromatografic, tehnica este denumită gaz-cromatografie (GC,
cromatografie de gaze, cromatografie in faza gazoasa). Această tehnică
se efectuează întotdeauna într-o coloană cromatografică deoarece faza
mobilă trebuie să curgă în mod continuu.

Clasificare
 cromatografia gaz-lichid (GLC):
- faza staţionară este un lichid
- fenomenul de separare are loc prin repartiţie cromatografică
 cromatografia gaz-solid (GSC)
- faza staţionară este o suprafaţă solidă
- fenomenul de separare are loc prin adsorbţie.

71
 APARATURA
Filters/Traps Data system
H

RESET

Regulators Syringe/Sampler

Inlets

Detectors
Gas Carrier
Hydrogen
Air

Column

72
APLICAŢIILE GAZ-CROMATOGRAFIEI

1. Identificarea compuşilor medicamentoşi si cercetarea

impuritatilor

 se folosesc mărimile de reţinere VR şi tR

 identitatea timpului de reţinere al unui component cu acela al aceluiaşi
component pur oferă un indiciu că cei doi componenţi sunt identici
 timpii de reţinere sunt proporţionali cu punctele de fierbere ale
componenţilor care ies din coloană în ordinea acestora
 folosind diferite faze staţionare selective componenţii se pot separa chiar
dacă au aceleaşi puncte de fierbere
 timpul de retenţie depinde de diferiţi factori (lungimea coloanei, diametru,
temperatura). Din această cauză, în scopuri calitative se utilizează aşa-
numiţii timpi de retenţie relativi, trr, definiţi prin relaţia:

unde:
tA = timpul de retenţie al componentei A;
tet = timpul de retenţie al etalonului.
73
 Se practică adăugarea în amestecul de analizat a unei componente
pure. Dacă are loc creşterea pe cromatogramă a maximului ce
corespunde componentului adăugat, aceasta se consideră drept
dovadă a identităţii componentei - etalon.
 Operaţia se efectuează pentru aceeaşi probă de analizat pe mai
multe coloane cu diferiţi adsorbanţi.

2. Studii de stabilitate pentru materii prime si produse finite cu

posibilitatea identificarii produsilor de degradare.

3. Studii farmacocinetice – studii de biodisponibilitate

(determinarea concentratiei plasmatice).

74
4. Determinarea cantitativă a compuşilor medicamentoşi

 Principala problemă a analizei cantitative în gaz-cromatografie este

măsurarea ariei picurilor.
 Aria picurilor este proporţională cu cantitatea de substanţă ce se
găseşte în zona eluată.
 Aria maximului picului poate fi calculată prin mai multe metode:
- măsurarea înălţimii maximului simetric, considerându-l de forma
unui triunghi, când aria este proporţională cu înălţimea: metodă
destul de precisă, dar exactitatea ei depinde de măsura în care forma
maximului rămâne neschimbată dacă cantitatea de substanţă
variază.

- planimetrarea ariei de sub pic - aparatele moderne evalueaza ariile

cu ajutorul dispozitivelor de integrare şi a computerelor.

 Prin metodele enumerate se măsoară aria sau cantitatea de

substanţă proporţională cu aria de sub pic. Aceste cantităţi trebuie
transformate în valori sau procente ale componenţilor analizaţi.

- Gaz-cromatografele moderne efectuează automat determinările

cantitative prin ataşarea la aparat a unui calculator adecvat.
75
 CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (IEC)
Definitie:

 Este o tehnica cromatografica in care faza staţionară este constituita din

compuşi în a căror structură se află grupări acide sau bazice ionizabile
capabile să reţină cationi sau anioni, in anumite conditii experimentale.

 Aceşti compuşi poartă numele de răşini schimbătoare de ioni.

 Ionii schimbatorului pot fi inlocuiti de alţi ioni fie din faza mobilă, fie din
probă, de unde denumirea de cromatografie prin schimb ionic.

Clasificare:

 cromatografie de schimb cationic:

 schimbătorul reţine ionii încărcaţi pozitiv, înlocuind ionul H+ al acestuia
 Ex: (-SO3H, -PO3H2)

cromatografie de schimb anionic:

 schimbătorul reţine ionii încărcaţi negativ, inlocuind ionul X- al acestuia
 Ex: (-RN+H3X-)
76
1 2 3 4

77
APARATURA

78
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI IONICE

Cromatografia ionica se dezvoltă în zilele noastre cu

aplicaţii în:
• analiza medicamentelor

• chimia anorganică

• chimia organică

79
 CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICE
SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY (SFC)

 Cromatografia cu fluide supercritice (SFC) derivă din metodele

convenţionale ale cromatografiei de lichide, în special din HPLC şi din
gaz-cromatografie (GC), fiind o metodă de separare puternică şi
universală, atât la scară analitică, cât şi la scară preparativă.
 Relaţia celor trei tipuri de cromatografie este redatã ma jos:

80
81
 Caracterisiticile fluidelor supercritice

Densitate (Kg/m3) Vâscozitate (cP) Difuziune

(mm2/s)
Gaz 1 0.01 1-10
Lichid 1000 0.5-1.0 0.001
Fluid 100-800 0.05-0.1 0.01-0.1
supercritic

Lichid Gaz Fluid

supercritic
Densitate mare X X
Difuzibilitate mare X X
Vâscozitate scăzută X X
Compresibilitate mare X X

82
APARATURA

83
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI CU FLUIDE SUPERCRITICE

1. Determinarea unor sulfonamide

Condiţii:
o Aparatura: Sistem Gilson SF3 pSFC
o Coloana: 250 x 4,6 mm cu fazã staţionarã cianopropil (mãrimea particulelor 5
mm)
o Temperatura: 50o C
o Sistem injecţie: Model 7125, 10 ml
o Faza mobilã: CO2 modificat cu metanol (10% primele 5 minute, creştere liniarã
la 15% timp de 10 minute)
o Viteza de curgere: 2 ml, 21 minute
o Presiunea: 180 bari
o Detecţie: UV 230 nm

TIC

84
2. Analiza unor substanţe anticancerigene şi anti-HIV

Taxol, R = CH3

3. Separări chiralice
Albendazol sulfoxid (ABZSO) - antihelmintic

- Chiralpak AD, eluţie cu 2-propanol

- Chiralcel OD, eluţie cu metanol

85
5. Alte aplicatii

o Separări de vitamine liposolubile

o Separări de acizi graşi
o Separarea benzodiazepinelor din ser
o Purificǎri de substanţe farmaceutice

Cromatografia cu fluide supercritice a fost conceputa mai ales

pentru separarea:
o substantelor termolabile
o compusilor nevolatili
o unor macromolecule

86
CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE

Definiţie: Cromatografia de excludere sterică este o metodă prin

care moleculele se separă pe baza mărimii lor sau în termeni
tehnici, pe baza volumului hidrodinamic. În mod curent, se aplică
moleculelor mari sau complecşilor macromoleculari, cum ar fi
proteinele şi polimerii industriali.

Clasificare:
 cromatografie de filtrare prin gel (Gel Filtration
Chromatography, GFC) - faza mobilă este o soluţie apoasă.
 cromatografie de permeaţie prin gel (Gel Permeation
Chromatography, GPC) - faza mobilă este de natură organică.
 cromatografia de excludere de mărime

87
Calibrare/
Echilibrare Introducerea probei

Eluţia

88
APARATURA

89
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUDERE
1. SEPARAREA MOLECULELOR

 Separarea moleculelor cu mărime diferită

 gelurile care exclud substanţele cu mase moleculare mai mari de 5.000
u.a.m. realizează o veritabilă desalefiere, deoarece ionii minerali care
difuzează liber pot fi eliminaţi în acest mod
 separarea iodului nefixat în cursul purificării unui trasor, după marcarea
unei proteine cu 131I.

 Analiza unui amestec de macromolecule

 purificarea fracţiunilor plasmatice pentru prepararea de medicamente sau
reactivi de diagnostic
 analiza stabilităţii materialelor plastice (ambalaje)

 Separarea celulelor
 limfocitele izolate de monocite

 Fracţionarea moleculelor mici

 analiza peptidelor
 analiza coloranţilor

90
2. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE
 etalonarea directă a coloanei cromatografice cu etaloane de masă
molară cunoscută
 etalonarea indirectă, plecând de la determinarea volumului
hidrodinamic
 determinarea masei molare a imunoglobulinelor IgG din forme
farmceutice, presupunând că 90 % sunt sub formă de monomeri
şi 10 % sub formă de dimeri.

3. DETERMINAREA DISTRIBUŢIEI MASELOR MOLECULARE

 se bazeaza pe relatia liniara dintre volumul de elutie si logaritmul
masei moleculare.

4. DETERMINAREA PURITĂŢII UNOR SUBSTANŢE

FARMACEUTICE
Ex: determinarea unor proteine cu mase moleculare mari (ca
impuritati) in insulina.

91
Diagrama spectrului electromagnetic al luminii 92
 SPECTROMETRIA UV - VIS
 Regiunea spectrală:
UV - îndepărtat: 100 - 200 nm
UV - apropiat: 200 - 400 nm
VIS: 400 - 800 nm.

Absorbtia luminii in UV-VIS se datoreaza prezentei cromoforilor.

 Cromofori (grupe cromofore)

 sunt grupe de atomi, care prezente într-o substanţă pot da naştere
la spectre electronice (de absorbţie).
 Grupă auxocromă
 este o grupă de atomi saturată care, ataşată unui cromofor,
modifică lungimea de undă (max) la care are loc absorbţia şi
intensitatea maximă de absorbţie.

93
Tipuri de tranziţii:
- tranziţii  - * (alcani)
- tranziţii  - * (alchene, compuşi carbonilici, alchine, azo compuşi)
- tranziţii n - * (oxigen, azot, sulf, compuşi halogenaţi)
- tranziţii n - * (compuşi carbonilici)
- tranziţii d – d* (metale)

94
Spectrometru UV-VIS cu monofascicul

Spectrometru UV-VIS cu fascicul dublu

95
Substante determinabile spectrometric

96
 SPECTROSCOPIA ÎN INFRAROŞU
INFRARED SPECTROSCOPY (IR)

 Grupeaza metode de identificare si dozare nedestructive bazate

pe absorbtia sau reflexia de catre probe a radiatiilor
electromagnetice cuprinse intre 0,75 - 1000 µm:

 Regiunea fundamentala 2,5 - 25 µm = regiunea IR analitic

97
98
99
 APARATURA
 Elementele constitutive ale unui spectrofotometru în IR:
- sursa de radiaţii
- monocromatorul
- cuva pentru proba
- detectorul
- amplificatorul
- dispozitivul de înregistrare.

100
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI ÎN IR
 nu există compuşi care să prezinte spectre IR identice.

domeniul frecvenţelor < 1500 cm-1 (regiunea amprentelor digitale) sunt

mult utilizate pentru stabilirea identităţii substanţelor analizate.

1. IDENTIFICAREA SUBSTANŢELOR MEDICAMENTOASE

 se compară spectrul substanţei de analizat cu spectrul obţinut în aceleaşi

condiţii cu substanţe etalon

 se compară spectrul substanţei de analizat cu spectrul etalon (din

cataloage sau monografii) la care s-au precizat valorile benzilor de absorbţie
caracteristice şi care trebuie să fie prezente şi în spectrul substanţei de
analizat.

Spectrul etalon = se obţine utilizând drept substanţe aşa - numitele

substanţe de referinţă pentru IR (s.r.i.r.) înscrise în capitolul Standarde al
farmacopeelor.

101
 Exemple:

 acetazolamidă, acid iopanoic, acid nalidixic

 p-aminobenzoat de etil, ampicilina sodică, trihidrat de
ampicilină, benzilpenicilina potasică, palmitat de
cloramfenicol, clordiazepoxid, acetat de clortestosteronă,
cloxacilina sodică
 clorhidrat de cocaină, acetat de cortizon, acetat de
dezoxicortizon, dexametazona, dextran 40 şi 70,
diazepam, ergocalciferol
 lactobionat de eritromicină, furosemid,
hidroclorotiazidă, hidrocortizonă, hidroxiprogesteronă

102
2. DECELAREA IMPURITĂŢILOR SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE

 Impurităţile substanţelor medicamentoase provenite din procesul

de obţinere, cât şi cele rezultate prin degradarea substanţei păstrate
în condiţii necorespunzătoare produc modificări vizibile atunci când
se efectuează o analiză atentă a spectrului înregistrat.

 Se observă:
 modificări ale benzilor de absorbţie care trebuie să caracterizeze
substanţa pură
 apariţia altor benzi caracteristice unor legături sau funcţii noi.

103
3. DETERMINAREA CANTITATIVĂ A SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE

 determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase ca atare

 determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase din
produsele farmaceutice.

 Probleme:
 realizarea unor condiţii standardizate
 respectarea legii Lambert-Beer.

 Exemplu: Alilestrenolul
- se foloseste solvent CCl4.
- maximele de absorbţie caracteristice = 1310 cm-1, 1650 cm-1.
- legea Lambert-Beer se verifică folosind soluţii de concentraţii = 0,5-2
g% (m/v).
- se poate determina în aceste condiţii şi din diverse produse
farmaceutice.

104
Componentele unui spectrometru FT-IR

105
 Avantajele FT-IR

 Viteză:
 deoarece toate frecvenţele sunt măsurate simultan, majoritatea
determinărilor FT-IR sunt de ordinul secundelor

 Sensibilitate:
 sensibilitatea metodei este mult îmbunătăţită deoarece detectorii utilizaţi
sunt mai sensibili, zgomotul de fond este mult scăzut, iar scanarea rapidă
permite coadiţia mai multor scanări, reducând zgomotul măsurat
întâmplător la nivelul dorit (semnal mediu)

 Simplitatea aparaturii:
 oglinda mobilă a interferometrului este singura parte a aparatului care se
mişcă continuu, astfel încât este foarte puţin posibilă o defectare mecanică

 Calibrarea internă:
 aceste aparate utilizează ca standard de calibrare internă a lungimii de
undă, lasere cu He, Ne. Aparatura are auto-calibrare şi nu necesită o
calibrare de către utilizator.
106
 APLICAŢIILE FT-IR

 metodă utilizată pentru identificarea oricărei probe.

 sensibilitatea va face posibilă identificarea unei cantităţi foarte
mici de impurităţi, ceea ce demonstrează că analiza FT-IR este o
metodă valoroasă în controlul de calitate sau în aplicaţiile asigurării
calităţii.
 sensibilitatea şi precizia detectorilor FT-IR, la care se adaugă
gama largă de software de algoritm au crescut utilizarea practică a
metodei în analiza cantitativă.

Evaluare şi identificare:
 de compuşi organici, anorganici
 în formularea medicamentelor
 în determinarea omogenităţii materialelor
 în medicina legală.

107
 SPECTROSCOPIA ÎN IR APROPIAT
NEAR INFRARED SPECTROSCOPY (NIRS)

 este o tehnică rapidă şi nedistructivă, capabilă de a furniza date despre

constituenţii oricărei matriţe
 acoperă lungimi de undă cuprinse de la mijlocul infraroşului până la
domeniul vizibil.
 13000-4000 cm-1 sau 800-2500 nm

108
 APARATURA

Spectrofotometru NIR:
 sursă de lumină
 monocromator
 suport care să ţină proba sau o suprafaţa pe care se pune proba
 detector prin intermediul căruia se fac măsurători de reflexie sau
transmitanţă.

109
Moduri de masurare NIR

110
 AVANTAJE NIR

 nu este necesara prepararea probei → reducere timp de analiza

 metoda nedistructiva
 cantitati mici de reactivi
 metoda excelenta pentru analiza probelor solide

 metoda neinvaziva

111
 SPECTROSCOPIA DE MASA - MASS
SPECTROSCOPY (MS)
Definitie:

Spectroscopia de masă este o metodă instrumentală de analiză care se

bazează pe fragmentarea moleculelor substanţelor organice sub acţiunea unor
radiaţii cu energii mari de până la 100 eV, iar din analiza
- numărului
- sarcinii
- masei fragmentelor rezultate - se obţin informaţii asupra
• structurii
• identităţii substanţelor cercetate.
Datorită acumulării de energie are loc fragmentarea moleculelor cu
ruperea unor legături interatomice, proces prin care rezultă :
- mai ales ioni pozitivi (rar negativi)
- radicali
- ioni radicali
- molecule neutre.
Aceste fragmente constituie piese importante de reconstituire a structurii
moleculare.

112
 Reprezentarea spectrelor de masă:
a) spectrul de bare al metanolului;
b) spectrul de masă continuu al unei substanţe organice
oarecare
113
 Sistem de presiune inalta

Sursa Analizor Sistem

Injector de masa Detector date
de ioni

Diagrama unui spectrometru de masă

114
 Surse de ionizare

1. Ionizarea prin impact electronic (Electron ionisation

- EI)
2. Ionizarea chimicã (Chemical ionisation – CI)
3. Bombardarea cu atomi rapizi (Fast Atom/Ion
Bombardment – FAB)
4. Ionizarea prin desorbţie laser asistată de o matrice
(Matrix assisted laser desorption ionization -
MALDI)
5. Ionizarea la Presiune Atmosferică (Atmospheric
Pressure Chemical Ionization - APCI)
6. Ionizarea prin electrospray (Electrospray Ionization
- ESI)
115
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI DE MASĂ
Interpretarea spectrelor

+
+
+
+ +

116
 Identificarea unui compus cu ajutorul spectrotecii MS

Există spectroteci care corespund unor colecţii (biblioteci) de spectre de

masă ale substanţelor cunoscute, în care sunt incluse (codate) principalele picuri ale
acestora.
Utilizarea acestor spectroteci, în care se caută picurile care interesează,
implică următoarele etape:

-reducerea datelor, prin care spectrul substanţei care ne interesează este redus la
cel mult 16 picuri, acordând preferinţă picurilor mai grele, mai semnificative decât
picurilor uşoare; fiecare spectru este redus în bibliotecă la 8 picuri

-precercetarea, care constă în selecţionarea spectrelor reduse din spectrotecă, la

acelea care au picuri cu aceleaşi poziţii ca şi picurile din spectrul redus al substanţei
cercetate, chiar dacă intensitatea lor este diferită

- cercetarea principală, care constă în reluarea selecţiei precedente printr-un

algoritm mai subtil care include printre criteriile de alegere:
• intensitatea
• masa
• raritatea picului, afectând un indice de identitate de la 0 la 1000 fiecărui spectru,
prin aceasta realizându-se o clasare prin similaritatea descrescătoare.
Există numeroşi algoritmi de cercetare, iar prin modificarea criteriilor de
alegere se poate reduce cercetarea prin verificarea şi alegerea între diverse
clasamente.
Cea mai importantă spectrotecă de masă este aceea a NIST (National
Institut of Standards and Technology), care includea peste 250000 de spectre la
nivelul anului 1996, iar în prezent numărul spectrelor este desigur mai mare.
117
Stabilirea formulei moleculare

Spectrele de masă pot fi utilizate cu şanse mari de certitudine

pentru stabilirea formulei moleculare a unei substanţe, deoarece poziţia
fiecărui pic care provine din fragmentarea unui ion precedent (exceptând
cazul unor reamenajări) oferă informaţii care se pot utiliza pentru stabilirea
ionului în cauză. Exemplu:
- prezenţa unui pic cu (M-1)+ - ionul s-a format prin pierderea unui atom de
hidrogen
- prezenţa unui pic cu masa (M-15)+ - ionul provine din ionul M+ prin
pierderea foarte probabilă a unei grupe de metil (CH3 cu masa M=15)
- daca ionul M+ conduce la un ion cu masa (M-18)+ - ionul a pierdut o
moleculă de apă.

Trebuie să se ţină seama că, de regulă, procesul de fragmentare sau

cel de reamenajare a ionilor care se formează din ionul molecular trebuie să
conducă la radicali sau ioni mai stabili decât ionul din care provin.

118
119
Puritatea substantelor farmaceutice. Impuritati farmaceutice

Exista un interes din ce in ce mai mare in ceea ce priveste

impuritatile prezente in medicamente (API – substante active). In
ultimul timp, nu numai profilul puritatii, dar si profilul impuritatii a
devenit esential dupa cum reglementarile in vigoare o specifica. In
lumea farmaceutica, o impuritate este considerate ca orice alt material
organic, pe langa s.a. sau excipienti ce apare in urma sintezei sau din
substante chimice nedorite care raman cu API (active pharmaceutical
impurities).
Impurificarea poate fi dezvoltata atat in timpul formularii cat si
dupa expirarea timpului de valabilitate atat a substantelor folosite dar
si a preparatelor formulate.
Prezenta acestor substante chimice nedorite, chiar si in
cantitate mica, poate influenta eficacitatea si siguranta produselor
farmaceutice. Profilul impurificarii (de exemplu, identificarea, precum si
cantitatea de impuritati din produsele farmaceutice), a castigat in
ultimul timp atentia din partea autoritatilor de reglementare.

120
 Diferite farmacopei, cum ar fi farmacopeea britanica, sau farmacopeea
SUA, indiana precizeaza limitele, nivelurile admisibile de impuritati
prezente in substantele utilizate sau preparatele formulate.
 Impurificarea poate fi evitata doar daca fiecare etapa este
realizata cu grija, evitandu-se sinteza prin realizarea mai multor etape
odata; in cazul paracetamolului brut exista un test de limitare pentru
p-aminofenol care poate fi un materiale de pronire in unele cazuri sau
un intermediar in altele.
 In chimia organica de sinteza, este foarte rar atins randamentul
de 100% in obtinerea unui produs final singur; in obtinerea unui
produs final singur exista intotdeauna o sansa de a avea produsi
secundari. Spre exemplu, in cazul producerii paracetamolului brut se
poate forma ca produs secundar paracetamol diacetilat.

121
 Impuritatile pot fi de asemenea rezultate prin degradarea produsului
final in procesul de fabricatie a medicamentelor. Degradarea
penicilinei si a cefalosporinelor sunt exemple bine cunoscute ale
produselor de degradare. Prezenta unui inel beta-lactamic, precum si
a unei grupari amino la C6-C7 joaca un rol critic in degradarea lor.


 Aceste impuritati poseda adesea efecte nedorite farmacologic sau

toxicologic, dar pot avea si beneficii care la administrarea lor pot
compensa. Compozitia impuritatilor ne permite sa tragem concluzii in
ceea ce priveste procesul de fabricatie a produselor si falsificarea
acestora care este din ce in ce mai raspandita in toate tarile din lume,
prin urmare, este necesar a controla cu strictete calitatea produselor
farmaceutice si a determina concentratia de impuritati in toate etapele
productiei, de la materiile prime la produsul finit.

122
 Surse de impurificare
 Impuritatile pot proveni din diverse surse. Sursa cea mai
evidenta de impurificare este sinteza, caz in care intermediarii din s.a.
pot constitui impuritati sau pot sa devina o sursa de alte impuritati
care rezulta din acestea.
 Orice impuritate prezenta in materia prima este posibil a se
regasi in s.a. de interes. In plus, impuritatile care se refera la
substantele inerte (excipientii) si solventii utilizati in timpul sintezei
trebuie sa fie, de asemenea, luati in considerare. Impuritatile pot fi
produse in timpul diferitelor etape ale formularii produsului
medicamentos.
 Exista posibilitatea ca aceste impuritati sa fie prezente in
produsul medicamentos final. Potentialii produsi de reactie care au
legatura cu aceste impuritati trebuie sa fie, de asemenea, evaluati.
 Impuritatile din produsele medicamentoase pot proveni nu numai
din s.m. sau din substantele inerte folosite pentru formularea unui
produs medicamentos, ele pot fi introduse in produsul medicamentos
in timpul procesului de formulare sau in urma contactului cu
ambalajul.
123
 Surse de impuritati organice
 Impuritatile organice pot aparea in timpul procesului de fabricatie
si/sau la depozitarea s.m. Ele sunt derivate din procesele de sinteza si
din reactiile de degradare a s.m. si produselor medicamentoase.
Impuritatile rezultate din procesul de sinteza pot proveni din materiile
prime, intermediarii, reactivii, liganzii si catalizatorii utilizati in sinteza
chimica, precum si din produsii secundari rezultati in urma reactiei
chimice de sinteza.
 Produsii de degradare se obtin in urma degradarii chimice a s.m.
si a produselor medicamentoase in functie de conditiile de depozitare
sau solicitare. Acestea pot fi identificate sau neidentificate, volatile sau
non-volatile si pot sa includa urmatoarele tipuri de impuritati:
 Impuritati provenind din procese de sinteza a s.m.;
 Impuritati rezultate in urma degradarii s.m.

124
 Impuritati provenind din procese de sinteza a s.m.
 Entitatile chimice, altele decat s.m., care sunt implicate sau produse in
procesul de sinteza pot ajunge in s.m. finala sub forma de urme de
impuritati. Aceste entitati chimice includ materii prime, produse
intermediare, solventi, reactivi chimici, catalizatori, produse secundare,
impuritati prezente in materialele de baza si entitati chimice formate din
aceste impuritati (in special a celor implicate in ultimele etape de sinteza).


 Materiile prime si produsii intermediari

 Materiile prime si produsii intermediari sunt structurile chimice folosite
pentru a construi forma finala a unei molecule de s.m. Materiile prime
nereactionate si produsii intermediari, in special cei implicati in ultimele
etape ale sintezei, pot supravietui procesului de sinteza si purificare si
apar in produsul final sub forma de impuritati.
 Impuritatile prezente in materiile prime ar putea urma aceeasi cale de
reactie ca si materialul de baza in sine, iar produsii de reactie pot duce la
formarea de impuritati in produsul final.
 Cunoasterea impuritatilor din materiile prime de baza ajuta la
identificarea impuritatilor prezente in produsul final si la intelegerea
mecanismelor de formare a acestor impuritati. 125
 Reactivi, liganzi si catalizatori:
 Aceste substante chimice sunt mai rar intalnite in API-uri; cu toate
acestea, in unele cazuri, ele pot constitui o problema ca impuritati.
 Reactivii chimici, liganzii si catalizatorii utilizati in sinteza unei s.m. pot
fi regasite in produsele finale ca impuritati sub forma de urme.


 Produsi secundari de sinteza

 Selectivitatea unei reactii este rareori de 100%, iar reactiile
secundare sunt frecvente in timpul sintezei de s.m. Produsii secundari
sunt printre cele mai comune impuritati de proces.


 Produsi „over-reaction”:
 In multe cazuri etapele precedente sau cele finale ale sintezei nu sunt
suficient de selective si reactivii ataca si produsul intermediar/produsii
intemerdiari.

126
 Impuritati provenite de la solventi utilizati in reactie

 De exemplu, clorura de metilen, care este adesea folosita ca solvent intr-

o reactie Friedel-Craft de acilare a benzenului sau a derivatilor de fenil
poate constitui o sursa de impuritati. Impuritatile din solventi pot fi, de
asemenea, o sursa de impuritati. De exemplu, 2-hidroxitetrahidrofuran
este o impuritate in tetrahidrofuran, care este adesea folosit ca solvent al
reactivului Grignard.

 Impuritati rezultate in urma degradarii s.m.

 Impuritatile pot fi, de asemenea, formate in urma degradarii produsului
final, in timpul procesului de fabricatie.
 Produsele de degradare care rezulta din depozitarea sau formularea
diferitelor forme dozate sau datorita „imbatranirii” produselor sunt
impuritati comune in medicamente.

127
 Impuritati enantiomerice
 Activitatea biologica a substantelor chirale de multe ori depinde de
stereochimia lor, deoarece organismul viu este un mediu chiral. Un
procent mare de compusi farmaceutici comerciali si experimentali sunt
enantiomeri si multi dintre ei prezinta diferente semnificative de
enantio-selectivitate in farmacocinetica si farmacodinamia lor.
 Importanta chiralitatii medicamentelor a fost recunoscuta de
mult timp, iar consecinta utilizarii lor ca racemi sau enantiomeri a fost
discutata frecvent in literatura de specialitate. Cu o crestere evidenta
a problemelor legate de stereoselectivitate in actiunea
medicamentelor, cromatografia chirala a devenit un instrument
important in analiza lor. Mari eforturi au fost dedicate dezvoltarii unei
metodologii mai bune pentru cromatografia enantioselectiva in
ultimele doua decenii.


128
 Metode de detectare
 Profilul impurificarii s.m. si formularea medicamentelor incepe cu
detectarea impuritatilor. Metodele cele mai frecvent utilizate pentru
aceasta sunt CSS (TLC), HPLC, dar, in cazul materialelor volatile, stabile
termic, gaz cromatografia (GC), joaca, de asemenea, un rol important.
 Alte tehnici cromatografice si electroforetice, cum ar fi cromatografia
cu fluide supercritice, electroforeza capilara si electrocromatografia
capilara pot fi, de asemenea, utilizate. Spectrostopia de masa (MS) si
rezonanta magnetica nucleara se inalta rezolutie (RMN) pot contribui, de
asemenea, la detectarea impuritatilor.
 Metode de caracterizare
 Metode spectroscopice
 Urmatoarele tehnici spectroscopice de masurare au fost utilizate
pentru caracterizarea impuritatilor; cele mai multe dintre aceastea sunt
foarte utile ca detectori pentru metodele cromatografice:
 Ultraviolet;
 Infrarosu;
 Spectroscopia Raman; Spectroscopia de masa;
 Rezonanta magnetica nucleara (RMN).
 Spectrometria in UV
 Spectrofotometria UV la o singura lungime de unda furnizeaza o
selectivitate minima a analizei; cu toate acestea, datorita accesibilitatii
detectorilor campului de diode se pot obtine simultan suficiente informatii,
la diferite lungimi de unda, pentru a asigura o mai mare fiabilitate.
 Spectrometria in IR
 Ofera informatii specifice privind unele grupari functionale care ofera
selectivitate si permit cuantificarea. Cu toate acestea, datorita nivelului
scazut de detectibilitate, este dificil. Acest lucru necesita abordari mai
complexe care sunt, in general, un factor de descurajare pentru analisti.
 Spectroscopia Raman
 Se bazeaza pe masurarea radiatiilor electromagnetice difuze care
rezulta din iradierea materiei. Concret, atunci cand un material este iradiat
cu o sursa de lumina monocromatica puternica (de exemplu: laser), o
cantitate mica de radiatii este difuzata la o lungime de unda diferita.
 Exista aceeasi diferenta in energia vibrationala dintre fasciculul
dispersat si fasciculul incident care este masurat. Spectroscopia Raman
este considerata complementara spectroscopiei IR, cele 2 tehnici oferind o
imagine completa vibrationala asupra materialului.
 Spectrometria de masa
 A avut un impact semnificativ asupra procesului de dezvoltare
farmaceutica in ultimele decenii. Progresele in proiectarea si eficienta
interfetelor care conecteaza direct tehnicile de separare cu spectrometrie
de masa au acordat noi oportunitati pentru monitorizarea, caracterizarea
si cuantificarea s.a. ca atare cat si din formele farmaceutice.
 Dotata cu o specificitate analitica si o sensibilitate exceptionale,
spectrometria de masa reduce semnificativ timpul ciclului metodei de
dezvoltare cromatografica, validarea si analiza probei.
 RMN
 Are capacitatea de a furniza informatii cu privire la structura si
stereochimia moleculei de interes constituind o metoda de analiza utila in
elucidarea structurii. Din pacate, RMN a avut in mod traditional o
sensibilitate limitata in comparatie cu alte metode analitice.

 Metode de izolare
 Metodele de izolare includ atat metode cromatografice dar si
metode non-cromatografice. La inceput ar trebui incercate metodele
simple, deoarece acest lucru poate duce la economii considerabile in
timp si pot produce o cantitate mai mare de informatii cu o mai mare
usurinta.
 Pentru izolarea unui compus dat dintr-un amestec complex,
metodele cromatografice utilizate pentru separarea de impuritati in
determinarile analitice sunt metode de prima alegere, care sunt
corespunzator modificate in scopul izolarii impuritatilor in cazul in care
o fractiune adecvata este colectata.

132
 Metodele de izolare:
 Extractia fazei solide;
 Extractia lichid-lichid;
 Extractia accelerata a solventului;
 Cromatografia in strat subtire (TLC);
 Cromatografia in faza gazoasa (GC);
 HPLC;
 Electroforeza capilara (CE).
 Metode de separare utilizate pentru separarea impuritatilor si a
produsilor de degradare:
 Electroforeza capilara;
 Separarea chilara;
 GC; HPLC;
 Cromatografia cu gluide supercritice; CSS.
 Natura si complexitatea componentei ce trebuie separata determina ce
metoda ar trebui utilizata. Scopul principal al unei metode de separare bune
este rezolutia tuturor impuritatilor de interes. Un rezumat al avantajelor
metodelor amintite mai sus este dat aici pentru a oferi o scurta trecere in
reviza a utilizarii lor potentiale. 133
 Electroforeza capilara

 Este o tehnica eficienta in situatiile in care avem de-a face cu cantitati

foarte mici de proba si o inalta rezolutie este esentiala.

 Reproductibilitatea sa relativ mica este principala dificultate a acestei

proceduri. Este o metoda fizica de analiza, care se bazeaza pe
migrarea particulelor incarcate electric, dizolvate sau dispersate intr-o
solutie de electroliti si supuse actiunii unui camp electric.

 Mobilitatatea electroforetica a unei particule este viteza de deplasare

in metri pe secunda a particulei supuse actiunii unui camp electric de
un volt pe metru si se exprima in metri patrati pe volt si pe secunda
(m2 x V-1 X s-1). Submultiplul curent folosit este centimetrul patrat pe
volt si pe secunda (cm2/VXs).


134
 Separarea chirala

 Proprietatile stereochimice ale medicamentelor chirale au fost in multe

cazuri factorul de control privind activitatea acestora. Un enantiomer
poate avea o functie biologica. Altii pot fi inactivi sau avea o alta
functionalitate care ar putea avea efecte secundare. In unele cazuri,
un izomer optic poate fi daunator. FDA impune producatorilor de
medicamente testarea enantiomerilor individuali pentru noile
medicamente pentru a le cunoaste toxicitatea.

 Cromatografia chirala reprezinta separarea cromatografica a

compusilor enantiomerici. Fazele lichide stationare comune nu poseda
o selectivitate adecvata pentru separarea enantiomerica. Adaosul
macromoleculelor de ciclodextrina derivatizate la fazele fixe comune
creeaza coloane capilare care au capacitatea de a separa numerosi
enantiomeri.

135
 Gaz-cromatografie
 Gaz – cromatografia este o tehnica extrem de utila pentru cuantificare. Se
poate oferi rezolutia dorita, selectivitate si usurinta de cuantificare.
Principala sa limitare, insa, este faptul ca proba trebuie sa fie volatila sau
trebuia sa devina volatila prin derivatizare. Aceasta tehnica este foarte
practica pentru impuritatile organice volatile (OVI).
 Cromatografia de lichide de inalta presiune
 Este adesea mentionata ca HPLC in zilele noastre. Ambii termeni pot fi
abreviati ca HPLC si termenii pot fi folositi alternativ. Aplicatiile acestei
tehnici foarte eficiente au fost semnificativ extinse prin utilizarea unei
varietati de detectori, cum ar fi fluorescenta, electrometria, MS s.a.m.d.
 CSS
 Este una dintre tehnicile de separare cele mai utilizate datorita usurintei
de utilizare, costului redus, inaltei sensibilitati, vitezei de separare, precum
capacitatii sale de a analiza simultan mai multe probe. Ea a fost aplicata in
disciplinele de biochimie, toxicologie, farmacologie, stiinta mediului si in
chimie. CSS poate fi utilizata pentru separarea, izolarea, identificarea si
cuantificarea componentelor intr-un amestec.
 Spectrometria de absorbtie UV-VIS in analiza si controlul
medicamentelor
 Spectrometria in UV-VIS se aplica in domeniul spectral 180-1100 nm;
 Domeniul spectral UV-VIS este alcatuit din 3 zone spectrale:
 UV apropiat – 185-400 nm;
 Vizibilul – 400-700 nm;
 IR – 700-1100;
 Determinarile spectrometrice in acest domeniu se bazeaza pe fenomenul
de absorbtie a radiatiilor cuprinse in acest domeniu spectral de catre
speciile chimice analizate.
 Determinarile in acest domeniu au la baza masuratori de absorbanta
(sau transmitanta) cu ajutorul spectrofotometrelor automatizate, inclusiv
pentru analiza multicomponent;
 Unele spectrofotometre UV-VIS sunt utilizate ca detectori ai mai multor
analiti, din amestecuri cu mai multe componente, dupa prealabila lor
separare prin cromatografia de lichide;
 Spectrofotometrele UV-VIS disponibile in prezent lucreaza intre 185 si
900 nm. Limita inferioara se opreste la cca 185 nm datorita aerului care
devine opac sub aceasta limita.
137
 Spectrofotometria UV-VIS
 Pentru inregistrarea spectrelor electronice se utilizeaza un
spectrofotometru UV-VIS care este compus dintr-o sursa de radiatii,
un sistem dispersiv combinat cu un monocromator si un detector.


 Legea fundamentala a absorbtiei

 In spectrometria de absorbtie in UV-VIS se masoara de regula
absorbanta care este proportionala cu concentratia analitului, conform
legii Lambert-Beer:
 A= e X b X c
 In care:
 A=absorbanta; b=grosimea stratului de solutie (cm); c=concentratia
analitului determinat; e=absorbanta molara.


138
 Inregistrarea spectrelor
 Este una dintre problemele de mare importanta in detectia si dozarea
substantelor medicamentoase;
 Inregistrarea spectrelor se poate face fie prin reprezentarea grafica a
absorbantei in functie de lungimea de unda fie a transmitantei in
functie de lungimea de unda;
 Aceasta inregistrare se face automat, datele experimentale fiind
inmagazinate in calculator, acesta avand programe de prelucrare a
datelor;
 Inregistrarea spectrelor in UV-VIS se face in solutiile analitilor in
solventi potriviti, iar alegerea solventului in fiecare caz este o
problema deosebita;
 Spectrometria UV se poate utiliza si in studiul unor reactii chimice care
se petrec in solutie. De exemplu, salicilatul de metil sufera in solutie
apoasa alcalina o reactie de hidroliza din care rezulta acid salicilic, iar
cu exces de baza salicilatul alcalin corespunzator.

139
 Spectrometria IR in analiza si controlul medicamentului
 IR analitic grupeaza metode de identificare si dozare (nedistructive)
bazate pe absorbtia sau reflexia de catre proba a radiatiilor
electromagnetice cuprinse intre 0,78 microni (780 nm) si 1000 microni
(1 mm) fiind subdivizat in IR apropiat, IR mijlociu si IR indepartat.
 Regiunea fundamentala situata intre 2,5 si 15 microni este regiunea
care furnizeaza cele mai multe informatii privind structura moleculara,
majoritatea spectrometrelor fiind limitate la masuratori in aceasta
regiune;
 Spectrele de absorbtie in IR sunt spectre de vibratie ale moleculelor.
Atomii situati la cele doua extremitati ale unei legaturi sunt supusi
unei miscari de vibratie.
 Prin absorbtie de energie legatura chimica isi creste nivelul energetic
vibrational. Moleculele probei vor absorbi energii din radiatia IR numai
la anumite lungimi de unda dand nastere in spectrul IR unor maxime
de absorbtie;

140
 Aspecte tehnice ale spectrometriei in IR
 In IR aparatura utilizata se subimparte in:
 Spectrometre cu transformata Fourier;
 Analizoare specializate;
 Spectrometre de tip dispersiv – pentru IR apropiat;


 Spectrometru cu transformata Fourier

 Radiatiile provenite de la o sursa lovesc o interfata constituita dintr-un
film semitransparent de germaniu depus pe lama de KBr. Acest
dispozitiv permite generarea a doua fascicule, unul dirijat spre o
oglinda fixa, celalalt spre o oglinda mobila care permite modificarea
distantei fata de interfata. Cele doua fascicule recombinate pe aceeasi
directie traverseaza proba inainte de a ajunge la detectorul care
masoara intensitatea luminoasa globala.

141
 Surse si detectori in IR
 Surse luminoase
 In IR sursele se prezinta sub forma unor filamente groase fie sub forma
unor batoane subtiri cu lungimea de 3-4 cm formate dintr-un amestec de
oxid de zirconiu si pamanturi rare incalzite de o rezistenta interioara sau
de o bara de carbura de siliciu. Aceste surse sunt alimentate la o tensiune
joasa, ajung la 1500C si, in conditiile lipsei unui invelis protector, ele disipa
o putere de ordinul sutelor de watt, emitand intr-un domeniu larg cuprins
intre vizibil si IR termic.
 Materiale optice
 Materialele optice utilizate in mod obisnuit in vizibil sau in IR apropiat sunt
in IR mediu opace;
 Prismele monocromatoare aparatelor secventiale utilizate in trecut erau
confectionate din NaCl sau KBr si au fost inlocuite in aparatele moderne de
retele metalice a caror suprafata asigura reflexia luminoasa;
 Pentru peretii celulelor sau ferestrelor detectorilor se aleg materiale
cristalizate sau amorfe, fiecare acoperind o anumita plaja spectrala.
 Detectori
 In functie de tipul de aplicatie sau aparat se utilizeaza ca detectori
termistori, termocupluri sau alte dispozitive asociate.
 Analiza calitativa in IR
 Identificarea compusilor se poate realiza cu ajutorul spectrotecilor generale
sau a celor speciale propuse de societati sau edituri;
 Pentru realizarea comparatiilor, spectrele arhivate trebuie sa fie obtinute
plecand de la compusi aflati in aceeasi stare fizica cu cei supusi identificati;
 Analiza calitativa consta in compararea matematica a spectrului compusului
necunoscut cu toate cele care formeaza spectroteca considerata in vederea
stabilirii unui clasament al spectrelor cele mai asemanatoare.
 Analiza cantitativa in IR
 Analistul trebuie sa examineze cu atentie rezultatele si in cazul schimbarii
algoritmului de comparare, acestea nu trebuie sa difere;
 In lipsa unor spectre de referinta, interpretarea spectrelor in IR urmareste
punerea in evidenta a unor grupari functionale, asocieri prin legaturi de
hidrogen inter si intramoleculare, configurari sterice etc.
 Precizia cu care se masoara absorbanta si posibilitatile de repliere a
spectrelor constituie avantaje ale analizei cantitative in IR;
 Metoda este frecvent utilizata, pe de o parte datorita faptului ca in IR mediu
gasirea intr-un spectru al unui amestec al benzilor caracteristice compusului
dozat este relativ usoara, iar, pe de alta parte, exista la dispozitie metode
statistice de prelucrare a datelor.
 Analiza cantitativa in IR mediu
 In cazul probelor solide, acestea sunt dispersate in interiorul unui disc
de KBr carora li se adauga un standard intern in cantitati egale atat
pentru standard cat si pentru proba;
 Pentru lichide determinarea absorbantei se face in cuve pe parcurs
optic mic pentru a minimaliza absorbtia proprie solventului in cazul in
care solventul nu este transparent in acest domeniu.
 Analiza cantitativa in IR apropiat
 Aceasta metoda utilizeaza domeniul spectral situat intre 800 si 2700
nm. Benzile observate in acest domeniu sunt date nu numai de
tranzitiile electronice ci si de benzile de vibratie de tipul armonicelor si
benzilor de combinare;
 Benzile armonice sunt mai putin intense decat cele corespunzatoare
vibratiilor fundamentale si de aceea se lucreaza in cuve cu parcursul
optic de 1 cm si pe probe nediluate.
 Chiar daca metodele de dozare in IR apropiat nu sunt sensibile,
intotdeauna ele sunt usor de utilizat.

144
 IDENTIFICAREA MEDICAMENTELOR CU SUBSTANTE ACTIVE
ORGANICE


 INTRODUCERE
 Identificarea medicamentelor este poate cea mai importanta proba din
controlul medicamentelor, deoarece experienta a aratat ca accidentele
cele mai deosebite au avut loc atunci cand identificarea nu s-a facut la
ambalarea subst sau foremlor farmaceutice.
 Din aceasta cauza legislatia in vigoare prevede efectuarea probelor de
identificare a substantelor medicamentoase destinate a fi folosite la
prepararea medicamentelor pe tot circuitul lor si anume la intrarea in
fabrica pentru conditionare si la iesirea din fabrica sub forma de
medicamente conditionate la intrarea in depozitele oficiilor
farmaceutice si la intrarea substantelor in farmacii.
 Pentru identificarea substantelor medicamentoase si a
medicamentelor conditionate se utilizeaza dupa caz reactii chimice,
constante fizico-chimice, metode fizico-chimice, spectrofotometrice si
cromatografice.
 IDENTIFICAREA PRIN REACTII CHIMICE
 La identificarea medicamentelor cu reactii chimice se disting 3 cazuri :
substanta unitara cunoscuta, amestec de 2 sau mai multe substante
cunoscute si substante necunoscute.


 SUBSTANTE UNITARE
 Pentru identificarea SM ca atare sau a SA dintr-o forma farmaceutica,
FRX si alte farmacopei straine recomanda una sau mai multe reactii
chimice completate de constante fizico-chimice si de teste bazate pe
metodele fizico-chimice.
 Este obligatorie executarea tuturor acestor reactii chimice si dupa
tehnicile indicate in FR sau specificatiile tehnice, deoarece numai cu
respectarea acestor tehnici ele sunt reproductibile si valabile in caz de
litigiu.
 FR la alegerea reactiilor tine seama de cateva criterii :
 Specificitatea reactiei;
 Exactitatea reactiei;
 Tehnica simpla;
 Utilizare de reactivi comuni;
 Stabilirea unui nr mic de reactii.
 Electroforeza capilara
 Electroforeza capilara este o metoda separativa de analiza care s-a
dezvoltat datorita experientei dobandite in HPLC si procedeelor mai
vechi de electroforeza. Ea permite separarea atat a biomoleculelor
pentru care HPLC este mai putin performanta cat si a compusilor cu
mase moleculare mici, dificil de studiat prin procedeele clasice de
electromigrare pe suport.
 Electroforeza capilara de inalta performanta (HPCE) si-a facut debutul
in laboratoarele de biochimie de la inceputul anilor 1990 alaturi de o
alta metoda numita electrocromatografia capilara.


 Principii de baza in electroforeza capilara

 Electroforeza capilara corespunde unei adaptari particulare a metodei
generale de electroforeza. Aceasta metoda separativa se bazeaza pe
migrarea speciilor purtatoare de sarcini electrice globale din proba
aflata in solutie sub efectul unui camp electric si in contact cu un
suport corespunzator.
 In tehnica clasica obisnuita, larg utilizata in domeniul bioanalitic, se
utilizeaza benzi de material plastic acoperite cu o substanta poroasa
impregnata cu un electrolit. Capetele sunt imersate in 2 rezervoare
independente, continand acelasi electrolit si cuplate la electrozii unui
generator de tensiune continua.
 Proba este depusa sub forma unui strat subtire transversal pe banda,
eventual presarata intre 2 placi izolante. Speciile hidratate prezente
migreza intr-un timp variabil cuprins intre cateva secunde pana la
cateva ore spre una dintre extremitatile benzii. Fiecare compus se
diferentiaza prin mobilitatea sa. Detectia speciilor prezente dupa
migrare se efectueaza in general prin transferul acestora printr-un
procedeu de contact pe o membrana unde sunt relevate cu ajutorul
unor reactivi specifici. Prelucrarea datelor se face ca si in CSS.
 In electroforeza capilara suportul plan din tehnica clasica este inlocuit
de un tub capilar deschid la ambele capete, din sticla de siliciu cu
diametrul variind intre 15 si 150 microni. Acest capilar cu lungimea 20-
80 cm este umplut cu un electrolit tampon.

148
 Mobilitatea electroforetica si fluxul electroosmotic

 Particulele aflate in suspensie intr-un lichid la fel ca si moleculele

solvatate pot fi incarcate cu o sarcina electrica a carei marime si semn
depind de natura lor si a electrolitului si, in particular, de pH.

 Aceasta sarcine provine din fixarea pe suprafata lor a ionilor continuti

in electrolitul tampon. Sub efectul diverselor fenomene (agitare,
temperatura, vascozitate, diferenta de potential) aceste particule vor
avea viteze de migrare cu atat mai mari cu cat ele sunt mai mici si au
sarcina mai mare.

 Pentru fiecare ion de raza r, viteza limita de migrare este rezultatul

echilibrului intre forta electrica F care se exercita intr-un camp electric
E cu particule de sarcina q si fortele de frecare care decurg din
vascozitatea (niu) a mediului.

149
 Separarea depinde de asemenea de raportul volum/sarcina ionului
hidratat. Speciile neutre se separa greu fiind necesara adaugarea unui
agent ionic in electrolit care sa se asocieze cu acesta si sa provoace o
antrenare diferentiata a lor.
 Speciile prezente in proba sunt supuse la doua fenomene principale care
se manifesta atat pentru ioni cat si pentru molecule: este vorba, pe de o
parte, de mobilitatea electroforetica proprie lor iar, pe de alta, de fluxul
electroosmotic.
 Electromigrarea
 Toti compusii incarcati electric se deplaseaza in electrolit cu o viteza v
care depinde de conditiile experimentale si de mobilitatea lor
electroforetica.
 Mobilitatea electroforetica se poate obtine plecand de la
electroforegrama, calculand viteza electroforetica a compusului intr-un
camp E si tinand cont de viteza electrolitului.


 Al doilea factor care controleaza migrarea solutiilor este curgerea

electrolitului numit flux electro-osmotic caracterizat prin mobilitatea
electro-osmotica.
 Electroosmoza
 Pentru calcularea mobilitatii electro-osmotice trebuie determinata viteza
electroosmotica. Viteza electroosmotica este raportul intre lungimea
capilarului parcursa de un marker neutru in timpul t. Se utilizeaza ca
marker o molecula organica nepolara la pH-ul electrolitului folosit si care
este usor detectabila prin absorbtia in UV apropiat.
 Fluxul electroosmotic aflat la originea deplasarii tuturor speciilor prezente
in proba depinde de natura peretelui intern al tubului capilar.
 Acest perete de silice este captusit de grupari silanice care se ionizeaza
daca pH-ul este mai mare de 3, formand o suprafata cu pozitii anionice
fixe ce creeaza un potential negativ (potential zeta) alaturi de un strat
cationic.
 In interiorul solutiei, campul electrolitic provoaca migrarea cationilor spre
catod. Acesti ioni sunt solvatati si antreneaza moleculele de apa din
electrolit dirijiandu-le spre catod. Anionii se deplaseaza intr-o maniera
contra-electroosmotica. Daca se trateaza peretele capilar cu un surfactant
de tipul tetraalchilamoniu, polaritatea se inverseaa, ceea ce conduce la o
inversare a fluxului electroosmotic.
 In general o suprafata a peretelui capilar negativa provoaca un flux
electroosmotic dirijat spre catod si invers, o suprafata pozitiva provoaca
151
o
dirijare a acestuia spre anod.
 Aparatura utilizata in electroforeza capilara
 Modul de injectare
 Pentru introducerea unui microvolum de proba care nu trebuie sa
depaseasca 1% din lungimea utila a capilarului, pentru a nu diminua
rezolutia, se utilizeaza procedeele:
 Injectarea hidrodinamica – consta in aplicarea unei diferente de
potential intre cele doua extremitati ale capilarului. Procedeul poate fi
ameliorat prin crearea unei presiuni de circa 50 mbar in solutia de
proba.
 Injectare electrocinetica – se utilizeaza in electroforeza pe gel si
consta in aplicarea unei diferente de potential intre extremitatile
capilarului pentru crearea unei diferente de polaritate.
 Injectarea prin gravitatie – bazata pe diferenta de inaltime intre
capetele capilarului.

152
 Metode de detectie
 Detectie UV/VIS;
 Detectie prin fluorescenta;
 Cuplarea cu un spectrometru de masa;
 Detectie electrochimica.


 Tehnici electroforetice
 Tehnicile electroforetice sunt urmatoarele:
 Electroforeza capilara de zona;
 EC micelara;
 EC pe gel:
 EC prin izofocalizare;
 EC capilara

153
 EC de zona
 Se mai numeste si electroforeza in solutie libera si este procedeul
electroforetic cel mai frecvent utilizat. In acest procedeu capilar este
parcurs de electrolit intr-un mediu tampon fie acid (fosfat sau citrat) fie
bazic (borat) sau amfolit (molecule posedand o functie acida si una
bazica). Fluxul electro-osmotic creste cu pH-ul fazei lichide sau poate
ramane neutru.
 Prin aceasta tehnica cationii sunt separati primii, apoi ansamblul neutru si
la sfarsit anionii. Tehnica nu permite separarea speciilor neutre unele de
altele.
 EC micelara
 Se mai numeste si EC electrocinetica micelara.
 In aceasta varianta, fazei mobile i se adauga un compus cationic sau
anionic pentru formarea de micele incarcate electric;
 Micelele care nu sunt miscibile cu solutia, absorb compusii neutri mai mult
sau mai putin eficace printr-o afinitate de tip hidrofil/hidrofob;
 Acest tip de electroforeza se aplica moleculelor care au teninda de a
migra fara separare (polipeptidele).
 EC pe gel
 Consta in transpunerea electroforezei pe gel de poliacrilamida sau
agaroza. Capilarul este umplut cu un electrolit continand un gel care
produce efect de filtrare ce retine moleculele mari si reduce fenomenul de
difuziune.
 Metoda se preteaza la separarea a trei clase mari de biomolecule:
polipeptide, oligonucleotide (fragmente de ADN sau ARN) mono si
polizaharide.
 EC prin izofocalizare
 Aceasta tehnica cunoscuta in egala masura ca electroforeza pe suport
consta in crearea unui gradient de pH liniar intr-un capilar cu peretele
tratat cu amfolit. Capilarul este introdus in acid fosforic la anod si in
hidroxid de sodiu la catod, fiecare compus migreaza si se focalizeaza la
pH-ul care are aceeasi valoarea cu potentialul lui izoelectric.
 Electrocromatografia capilara
 Acest tip de separare asociaza electromigrarea ionilor, proprie
electroforezei si procesele de repartitie intre faze prezente in
cromatografie.
