Acizi nucleici

• Tipuri de acizi nucleici

• Componenţi structurali ai acizilor nucleici
• Structra primară covalentă a acizilor nucleici
• Conformaţia moleculei de ADN
• Denaturarea şi renaturarea ADN
• Hidroliza ADN
• Organizarea superioară a ADN
– Structura terţiară ADN
– Cromozomii eucariotelor
– Distribuţie ADN
 Ce sunt acizii nucleici ?

• Sunt produşi de policondensare a nucleotidelor;

• Păstrează şi mijlocesc transferul de informaţie

genetică în lumea vie.

 Dogma centrală a biologiei
moleculare
• ADN conţine informaţia genetică sub forma unor
secvenţe de nucleotide
Replicare

Transcriere Traducere
ADN ARNm Proteine

Revers transcriere

• Toată informaţia din celula parentală este

transferată celulelor fiice.
 Tipuri de acizi nucleici

• ADN

• ARN

– ARNm, ARNt, ARNr, ARN de mici dimensiuni,

miARN, siARN
• ADN

– stochează o cantitate mare de informaţie cu privire

la biosinteza proteinelor

– informaţia poate fi accesată imediat

• ARN :
– mesager: transferă informaţia din nucleu în citosol în
formă de secvenţă de nucleotide

– de transport: face legătura între ARNm şi aminoacizi;

– Ribozomal: intră în structura ribozomilor (complexe

ribonucleoproteice, sediul biosintezei proteice);

– de mici dimensiuni: rol în excizia intronilor

 Componenţii structurali ai acizilor
nucleici

• Pentoza sub forma ciclică b-furanozică

• Acidul fosforic (H3PO4)

• Bazele azotate: purine şi pirimidine

 Riboza şi dezoxiriboza
sub forma ciclică b-furanozică

HC O HC O H C OH
H C OH H C OH H C OH O HOH 2 C
O
H C OH H C OH H C OH
OH
H C OH HO CH2 C H HO CH2 C H
OH OH
H2C OH OH

D-Riboza -D ribofuranozã

 Baze azotate

6 7 4
5 N
1N 3N 5
8
2 2 6
N 4 NH N
3 9 1
Purinã Pirimidinã
 Tautomeria lactam  lactim a
bazelor azotate
• Formele lactam sunt mai stabile
O OH
C NH C N
forma lactam forma lactim

• Tautomerie imino-amino
NH2 NH

N C NH C
forma amino forma imino
 Purine

• Adenina

• Guanina
 Pirimidine
OH O OH O
N HN CH 3 CH 3
N HN
HO N O NH HO N O NH
Lactim Lactam Lactim Lactam
Uracil (2,4-dihidroxi-pirimidina) Timina (5-metil-uracil)
NH 2 NH 2

N N

HO N O NH
Lactim Lactam
Citozina (2-hidroxi-4-amino-pirimidina)
Legătura N-glicozidică
numerotare atomi ????
 Nucleozide
(ribo- şi dezoxiribonucleozide)
• Ribonucleozidele
NH 2 O
N N
N NH
9 9
5` N
HO H2 C N N N NH 2
O HO H2 C
4` 1` O
3` 2`
OH OH Adenozinã (A) Guanozinã (G)
OH OH
NH 2 O
N NH
1 1
5` N O O
HO H2 C N
O HO H2 C
4` 1` O
3` 2` Citidinã (C)
OH OH Uridinã (U)
OH OH
 Dezoxiribonucleozidele
NH 2 O
N N
N NH
9 9
5` N N NH 2
HO H2 C N HO H2 C N
O O
4` 1`
3` 2`
OH H HO H Dezoxiguanozinã (dG)
Dezoxiadenozinã (dA)
NH 2 O
H3 C
N NH
1 1
5` N O N O
HO H2 C HO H2 C
O O
4` 1`
3` 2`
OH H OH H
Dezoxicitidinã (dC) Dezoxitimidinã (dT)
 Nucleotidele
• Sunt esteri fosforici ai nucleozidelor
NH 2
 b  N
N Adeninã
O O O Adenozinã
5` sau
O- P O P O P O N N
O Dezoxiadenozinã
O- O- O- 4` 1` (nucleozide)
X=H Dezoxiribozã
3` 2` X=OH Ribozã
OH X
AMP (adenozinmonofosfat)
ADP (adenozindifosfat)

ATP (adenozintrifosfat)
 Proprietăţile nucleotidelor şi
nucleozidelor
• sunt stabile în mediu bazic

• Solubilitatea nucleotidelor în apă este mai

mare decât a nucleozidelor

• Nucleotidele prezintă absorbanţă maximă

la 260 nm, la pH = 7
 Conformaţia nucleotidelor şi
nucleozidelor

• Determinată de:- flexibilitatea ribozei

3`
PO 5` 2` PO 5`
4` O O Bazã
Bazã 4`

1` 1`
3` . PO 2`
. PO 5,9 A
7,0 A C-2` endo C-3` endo
"South" "North"
-în funcţie de orientarea bazelor azotate

faţă de legătura N-glicozidică

conformerii anti şi syn

 Nucleotide naturale libere
• Rolurile lor în ţesuturi:

-compuşi macroergici (ATP, GTP);

-acceptori de fosfat în fosforilarea oxidativă

(ADP);

-efectori alosterici ai activităţii enzimelor;

-componenţi structurali ai coenzimei FAD
NH 2
N
N
O O
N N
CH 2 CH CH CH CH 2 O P O P O H2 C
O
OH OH OH O- O-
H3C N N O
OH OH
NH
H3C N adenozinã

O
(H)
lumicrom
lumiflavinã (H)
(OH)
riboflavinã (H) adenozin 5`-monofosfat
(H) (AMP)
flavin adenin mononucleotid (FMN)
flavin adenin dinucleotid (FAD)
• componenţi structurali ai coenzimelor
NAD+, NADP+
CONH 2

+
CONH 2 N
COOH O H2 C
O
O P O-
NH 2
N N
O OH OH
Acidul nicotinic Amida acidului nicotinic N
- N
(niacina) (niacinamida) O P O

O H2 C N N
O

OH OR
Nicotinamid-adenin dinucleotid (NAD+)

(R = H formeazã NAD+ ; R = -PO3H2 formeazã NADP+)

mesageri secunzi (AMPc şi GMPc);
• donori ai grupărilor metil
 Metilxantinele
(compuşi naturali cu proprietăţi farmacologice)
O 7 O CH 3
N H3 C N
HN 1 N
3
O NH NH N
O N
Xantina Cofeina
(2,6-dioxipurina) CH 3
(1,3,7-trimetilxantina)

O
O CH 3
H3 C N
N N
HN
O N NH
O N N
CH 3 Teofilina Teobromina
(1,3-dimetilxantina) CH 3 (3,7-dimetilxantina)
 Analogi structurali sintetici ai
bazelor azotate, nucleozidelor şi nucleotidelor

• Inhibă sinteza ADN

• Sunt folosiţi în chimioterapie
O O SH
F I N
N HN N 6
5 5
9
N NH
O NH O N
5-Fluorouracil 6-Mercaptopurina
HO H2 C
O
Timinã SH
HO H2 C
O 2` N
N 6
OH
5-Iodo-2`-deoxiuridinã H2 N N NH
N3 OH
6-Tioguanina
Azidotimidina
 O NH 2 O
CH 3
N
HN 6
HN N 8N N
NH N
6N H2 N N
O N O N
8-Azaguanina S NO 2
HO H2 C HO H2 C
O O
HO HO N 6 N
8
N 6 NH
OH N
OH OH 9 N
Arabinozil citozinã NH Azatioprin
6-Azauridinã N
Alopurinol
• Structura primară covalentă a acizilor
nucleici
• Conformaţia moleculei de ADN
• Hidroliza acizilor nucleici
• Distribuţie ADN
• Structura superhelicoidală a ADN
• Cromozomii eucariotelor
• Replicare
Structura primară covalentă a acizilor nucleici

• Nucleozidele legate fosfat diesteric

formează:
-oligonucleotide
-polinucleotide

Polinucleotidul ARN conţine:

b-Riboză şi A, G, C, U
Polinucleotidul ADN conţine:
b-Dezoxiriboză şi A, G, C, T
 O

N
NH
O
5`
G 5` GCA 3`
O
-
P O N N NH 2
O
-
O
3`
NH 2
X
N
O C
N O
O P O CH 2
O
-
O
3`
NH 2
X
N
NH
O A

O P O CH 2 N N
O
-
O
3`

3` OH X
• Cine determină diversitatea polinucleotidelor ???
 Conformaţia moleculei de ADN;
tipuri de conformaţii

• Structura secundară de dublu-helix a ADN

a fost propusă de

Watson şi Crick
-analiza cromatografică
în toate tipurile de ADN

numărul de baze purinice este egal cu

cel de baze pirimidinice

A+G=T+C
-difracţia razelor X, efectuată pe cristale de ADN

existenţa a două perioade de identitate de-a

lungul axei lungi a moleculei:

una mare de 34 Å şi

una mică de 3,4 Å.

 Două catene antiparalele (una cu polaritate 5’-3’ şi cealaltă
antiparalelă cu polaritatea 3’-5’) complementare nu identice
formează o dublă helice cu orientare dreaptă

O H
N O H N
H2 C
O
N G N H N C H
O N
H N O
N
H O
Dezoxiguanozinã H O

Dezoxicitidinã CH 2
O
H
O
N N H
H2 C O
O
N A N H N
T
O H
N N
H O
O
O
Dezoxiadenozinã
H2 C
Dezoxitimidinã
O
• Dublul helix cu conformaţiile
–A
–B
–Z
 Caracteristici structurale ADN
forma B
• 2 catene complementare NU identice,
formează o scară în spirală cu 10 trepte;

• Scheletul extern al dublului helix:

– cicluri de riboză legate fosfat diesteric,
• ionizat şi încărcat negativ la pH fiziologic;

• Bazele azotate, sunt orientate spre interior şi

perpendicular pe axul helixului.
 ADN forma B
• 3,4 Å;
• 34 Å;
• 20 Å
 Polaritatea catenei
5` O 3`

CH 2 O

5` B1 B1 5`
3` 3`

P P

5` B2 B2 5`
3` 3`

P P

5` B3 B3 5`
3` 3` 3` 5`
O CH 2
O
 O H
N O H N
H2 C
O
N G N H N C H
O N
H N O
N
H O
Dezoxiguanozinã H O

Dezoxicitidinã CH 2
O
 H
O
N N H
H2 C O
O
N A N H N
T
H
HO N
H N
O
O
H2 C
Dezoxitimidinã
 Formele structurale A şi Z ale
ADN
• Conformaţia de tip A, mai compactă :
- dublă helice dreaptă;
-pasul helicei este de 28 Å;
- numărul de baze per tur 11;
-predomină conformerii anty.
• Conformaţia de tip Z:
-corespunde la o helice stângă;
-12 perechi de baze per tur;
-pasul helicei aproximativ 57 Å;
-într-o succesiune GC dezoxinucleotidul guaninei
adoptă conformaţia syn iar cel al citozinei pe cea
anti, ceea ce face ca lanţul să evolueze în zig-zag
între cele două conformaţii.
• In vitro, structura Z modifică interacţiunile ADN-
proteine, importante în replicare, transcriere,
repararea leziunilor ADN.
Denaturarea ADN
Ruperea legăturilor de hidrogen şi a interacţiunilor van
der Waals dintre catenele moleculei ADN aflate în
soluţie.

Renaturare ADN Denaturare ADN

 Ce factori influenţează denaturarea ?

• creşterea temperaturii (topire);

• la valori extreme de pH
(molecula de ADN este stabilă la pH-uri cuprinse între 4 şi 10);

• modificarea tăriei ionice;

• prezenţa formaldehidei ;
 Proprietăţi fizice ale ADN care se
modifică prin denaturare

• scade vîscozitatea;

• creşte absorbanţa la 260 nm.

 Efectul hipercrom

• Prin denaturarea ADN-ului, creste capacitatea

de absorbtie a acestuia la l=260 nm.

 Compoziţia ADN în baze azotate
influenţează temperatura de topire

1.5
Hipercromicitate (l=260)

100

Denaturare (%)
1.4
G:C A:T 75
1.3
A:T G:C
1.2 50

1.1 25

1.0 0
Tm
0 70 80 90 100
 Renaturare
• Refacerea duplexului ADN prin legarea
catenelor complementare
• Renaturarea depinde de:
-temperatură;
-concentraţia catenelor complementare.

Renaturarea este proces folosit în tehnica hibridării

-determinarea poziţiei intronilor în molecula ADN
-evidenţierea deleţiilor cromozomiale.
 Hidroliza acizilor nucleici
• Chimică sau Enzimatică
• ADN este rezistent la hidroliza bazică
• ARN este hidrolizat în mediu bazic

O O O
H2 C H2 C
H2 C
3`3` 2`2` 3`3` 2`2` 3`3`
5`5` B1 5`5` B1 5`5` 2`2`
B
O - O
O 2-
:OH
-
O P O O PO 3 OH
O P O
- + H2O
- +
O
O
OH
OH 2`2`
B2 3`3`
5`5` 5`5` B2 5`5` B
OH OH OH
 Hidroliza enzimatică
• Nucleaze:
-exonucleaze (ADN polimerazele I şi III)
-endonucleaze
☺endonucleaze de restricţie (restrictaze)
▪evidenţiate la bacterii
▪recunosc secvenţe nucleotidice numite
palindroame
▪taie ADN dublu catenar nemetilat la resturile
de A sau C
Enzima Secvenţa recunoscută Sursa
BamH I 5`-G GATCC-3` Bacillus
amyloliquefaciens H
BglII 5`-A GATCT-3` Bacillus globigii
5`-T
5`-G
5`-GAT
5`-A
5`-GTT
5`-CAG

EcoR I 5`-G AATTC-3` Escherichia coli RY13

EcoRV 5`-GAT ATC-3` Escherichia coli B946

Hind III 5`-A AGCTT-3` Haemophilus influenzae

Rd
Taq I 5`-T CGA-3` Thermus aquaticus
 5`---AAGCTT---3` 5`---TGGCCA---3` 5`---GAGCTC---3`
3`---TTCGAA---5` 3`---ACCGGT---5` 3`---CTCGAG---5`

Hind III Bal I Sst I

5`---A 5`
AGCTT---3` 5`---TGG CCA---3` 5`---GAGCT3` C---3`
3`---TTCGA 5` A ---5` 3`---ACC GGT---5` 3`---C 3`TCGAG ---5`
 Formare ADN recombinant
ADN1 ADN2

5`---GAATTC---3` 5` GAATTC 3`
3`---CTTAAG---5`
3` CTTAAG 5`

EcoRI EcoRI

5`---G AATTC---3` 5` G AATTC 3`

3`---CTTAA G---5`
3` CTTAA G 5`

Renaturarea fragmentelor ADN si

sudarea lor de cãtre ADN-ligazã

5`---GAATTC 3` 5` GAATTC---3`
3`---CTTAAG 5` 3` CTTAAG---5`

Molecule de ADN recombinant

Separarea fragmentelor ADN rezultate
din acţiunea enzimelor de restricţie
• Electroforaza pe gel de poliacrilamidă
pentru fragmente <500 perechi de baze

• Electroforaza pe gel de agaroză pentru

fragmentele cu dimensiuni mai mari

• Hărţi de restricţie
 Distribuţia şi dimensiunile ADN

• ADN are formă liniară sau circulară

• Moleculele ADN dintr-o celulă alcătuiesc

cromozomii acelei celule.

• Ce sunt genele ?

secvenţe nucleotidice care conţin informaţia cu

privire la sinteza unui singur lanţ polipeptidic
sau a unei singure molecule de ARNr sau ARNt

• Genom = totalitatea genelor din cromozomii

unei celule.
 Dimensiunile ADN
• La procariote,
– ADN circular = un cromozom cu 4 x 106 p.b.

E. coli
ADN ~ 1,6 mm
diametrul celulei ~ 2 mm
☻La om: cel mai scurt cromozom 34 x 106 p.b.

cel mai lung 263 x 106

Lungimea moleculelor ADN dintr-o singură celulă umană

este de ~ 2 m
 Distribuţie ADN
• La procariote:
-ADN cromozomial

☺ Plasmide (ADN extracromozomial, circular)

-molecule mici care trec uşor prin membrana celulei gazdă
-conţin o cantitate redusă de informaţie genetică
-conţin gene care specifică proteine, ce conferă bacteriei
rezistentă la antibiotice
-se autoreplică extrem de rapid şi autonom faţă de ADN
cromozomial.
 La eucariote
• ADN se află în nucleu.

– 1% din ADN celular total se află în mitocondrii şi este

circular

• 5-10% din ADN este codificator pentru proteine şi ARN

• Genele sunt formate din exoni şi introni (discontinuitatea

genelor); excepţie histone şi interferon
• După gradul de repetare al secvenţelor nucleotidice:

– 60% din ADN celular sunt secvenţe ADN nerepetitive, unice;

codifică proteine

– 20% din ADN sunt secvenţe cu grad mediu de repetare

(zecisute copii/celulă); codifică ARNr, ARNt, histone

– 10% din ADN cu grad foarte mare de repetare (mii de

copii/celulă); se află în centromere şi telomere;
» au rol structural în cromozomi
 Structura superhelicoidală a ADN
• Suprarăsucirea moleculei ADN în jurul
axei proprii

Suprarãsuciri Suprarãsuciri
spre stânga spre dreapta
(superhelix (superhelix
negativ) pozitiv)

Helix circular normal

 Desrãsucirea Legare
unei spire capete

ADN circular cu
suprarãsucire pozitivã
spre dreapta

ADN normal ADN partial desrãsucit

 Axa de suprarãsucire

Axa de suprarãsucire
 Topoizomerazele
• Topoizomeraza I, nu necesită ATP

Topoizomeraza I Topoizomeraza I Topoizomeraza I

Tyr
Tyr Tyr
5` O
5` O
OH P Enzima P
P P OH
OH 3`
Incizie si legare 3` Rotirea Disocierea
la enzimã capãtului 3` enzimei
 Giraza (Topoizomeraza II)
• Necesită ATP şi face incizii în ambele
catene; introduce suprarăsuciri negative

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3

ADN suprarãsucit
• Topoizomerazele I şi II menţin în celulele vii un
grad potrivit de superhelicitate negativă.

• antibiotice care inhibă ADN-giraza suprimă

creşterea şi dezvoltarea bacteriană:
– acid nalidixic (negram)

– derivaţii săi fluoruraţi (norfloxacin, ciprofloxacin),

 Cromozomii eucariotelor
• Cromatina (cromozomii interfazici)=material amorf prezent în nucleu în
interfază; conţine ADN, proteine, ARN

• Cromozomii sunt complexe ADN-proteine rezultate prin condensarea

cromatinei în timpul mitozei
– Fiecare cromozom conţine o moleculă ADN liniar

– Nr. Cromozomilor variază de la o specie la alta (celulele somatice umane conţin

46 cromozomi; 23 perechi)
• Histonele = proteine bazice
– interacţionează ionic cu anionii fosfat din
ADN
 Sunt 5 tipuri de histone
• Histone bogate în lizină: H2A şi H2B
• Histone bogate în arginină: H3 şi H 4
care intră în structura nucleozomului

• Histone de legătură H1 care leagă

nucleozomii între ei.
 Nucleozomii = unitatea de bază a
cromatinei
• grad de compactare pentru ADN egal cu 7
• Cilindru: 11x11x5,5 nm
• 140 pb se răsucesc de 2 ori în jurul octamerului histonic

Miezul nucleozomului
ADN de (H2A, H2B, H3, H4)2
legãturã

ADN
Histona H1
Solenoizii asigură o scurtare de 40
de ori a formei B a ADN
 Proteinã nuclearã Cromozom

Fibra de 30 nm

ADN Octamerul histonic

Histone + ADN

Histona H1 ADN
BIOSINTEZA ADN

REPLICAREA
• Replicarea este
-semiconservativă
-bidirecţională
-semidiscontinuă
 Catenã parentalã Catenã parentalã

Catenã parentalã Catene fiice Catenã parentalã

 Catene parentale

Catene
fiice
 Replicarea este
semiconservativă

• Prin replicarea unei molecule ADN se formează două

molecule ADN fiice identice cu parentala

• replicare diviziune celulară

– fiecare celulă fiică primeşte
• catenă parentală de ADN

• catenă nou sintetizată, complementară cu parentala.

 Unde începe replicarea ADN
bacterian ?
 Originea replicării

în “regiuni origine” (ori C) care

– conţin secvenţe “consens” bine conservate de-a

lungul evoluţiei,

• bogate în A=T, uşor de denaturat

• La E.coli
– o moleculă unică de ADN, alcătuieşte un
cromozom

• există o singură regiune Ori C care direcţionează

începerea replicării.
• Replicarea poate fi uni sau bi-direcţională
Cromozomul circular initial

ORI
ADN initial

1 Bifurcatii de
2
replicare

1 2
Puncte de initiere
replicare

Originea replicãrii
ADN dupã replicare
Replicarea este bidirecţională

în cele mai multe organisme

• ADN circular se replică simultan în ambele

direcţii.
Cromozomul bacterian are în timpul replicării
forma literei theta ()

Bucla de replicare formeazã o structurã în ADN circular

O singurã bifurcatie de replicare Douã bifurcatii de replicare

 Ce este Bifurcaţia de replicare ?

• “bifurcaţia de replicare” reprezintă regiunea

activă în replicare care se deplasează de-a
lungul duplexului parental
 Sensul de deplasare al bifurcatiei 3`
5`
ARN primer
5` Catena leading

3`
Catena lagging

Fragmente Okazaki 3`
5`
ARN primer
 Replicarea ADN bacterian este bidirecţională

Ori
Cromozomi

Terminarea replicãrii
Ori

Bifircatiile de replicare
Ori
Catene fiice

Cromozomul Catene parentale

circular initial
• Terminarea replicării

are loc atunci când

cele două bifurcaţii de replicare

se întâlnesc

într-o regiune

opusă regiunii Ori

 Elementele necesare pentru
sinteza de ADN
• Substraturi
dATP, dGTP, dCTP, dTTP şi
ATP, GTP, UTP, CTP necesari sintezei de
ARN în cursul replicării.
• Matriţa (template)
• ARN iniţiator sau primer necesar iniţierii
sintezei de ADN
 Enzimele implicate în replicare

• ADN polimeraze-ADN dependente

• Helicaza
• Topoizomeraze (giraza)
• ADN ligaza
• ADN primaza
 ADN polimeraze – ADN dependente
La procariote sunt 3 polimeraze: I, II şi III

Caracteristici comune ale celor 3 polimeraze:

-au activitate polimerazică
-necesită catenă ADN matriţă
-sintetizează catene ADN numai cu directia
5` 3`
-ADN polimerazele nu iniţiază catene ADN, necesită
ARN primer
-prezintă activitate exonucleazică 3` 5`
 Atribute specifice celor 3
polimeraze

ADN polimeraza I
☻are activitate polimerazică redusă
(comparativ cu ADN polimeraza III)

catalizează formarea a 20 de legături fosfodiesterice

înainte de eliberarea matriţei
ADN p I (10 nucleotide pe secundă)
ADN p III (1000 nucleotide pe secundă).
 5`
Catena parentalã 5`
ARN primer ADN
(10-12 nucleotide) Catena
3` complementarã 3`

-
O P O
-
O P O
O
O
CH 2 U A
O CH 2 U A
O

O OH
O OH
-
O P O
-
O P O
O
A O
CH 2 U
O U A
CH 2
O

3` PPa
..OH OH
-
O OH
O O O
-
O P O
-
O P O P O P O
O
- -
O O O
CH 2 T A
CH 2 T A O
O

OH H
OH H 5` 5`
☻ are activitate exonucleazică:

3`5` şi
5`3`

Fragment 36 Kd Fragment 67 Kd

Exonucleazã Exonuclezã Polimerazã COOH

H2N 5` 3` 3` 5`
 5` 3` 3`
5`
T ...... A C A
T ...... A C A

T ...... A C A
Locul de hidrolizã al Locul de hidrolizã al
exonucleazei 3` 5` T ......
A T ...... A
exonucleazei 5` 3`
T ...... A
C A
3` HO T ...... A
A
A T ...... A

5` 3` 5`
a) b)

• ADN polimeraza I îndepărtează ARN primer ca urmare a

activităţii exonucleazice 5` 3` şi îl înlocuieşte cu ADN ca
urmare a activităţii polimerazice.
 ADN polimeraza III are rol central în
procesul de replicare în vivo
• are o procesivitate mare adică leagă strâns şi
eliberează catena matriţă numai după replicarea
completă a acesteia;

• are o eficienţă catalitică foarte mare în calitate

de polimerază (polimerizează 1000 nucleotide
pe secundă);

• prin activitatea exonucleazică 3’ 5’ are rol

de corector (proofreading).
ADN polimeraza III asigură fidelitatea procesului
de replicare pe două căi:

• –respectarea principiului complementarităţii

bazelor; (acurateţe de 104 perechi de baze)

• –activitatea de corector (proofreading).

 Helicazele

• Desfac duplexul ADN pe portiuni mici, cu

consum de ATP, introducând suprarăsuciri
pozitive
 ADN-giraza
ADN-giraza (topoizomeraza II),
cu consum de ATP,

introduce suprarăsuciri negative în ADN

cu scopul de a contracara în avans suprarăsucirile
pozitive introduse de helizază în procesul de
replicare.
• Este prezentă numai la procariote.
 ADN ligaza

• ADN ligaza catalizează

formarea unei legături fosfo diesterice între

gruparea 3`-OH de la capătul unei catene ADN, cu

gruparea 5`-fosfat de la capătul altei catene ADN
 ADN ADN
A AMP ADN
5` 3` 5` 3` 5` 3`
5` R
O P O P PP

3`
OH OH
Ligazã
P-R-A
3` 5` Ligazã-AMP 3` 5` AMP 3` 5`
• ADN-ligaza necesită AMP

Sursa de AMP este:

ATP pentru eucariote şi
 NAD  pentru E.coli şi alte bacterii.

• ADN ligaza NU poate cataliza

legarea a două fragmente

monocatenare de ADN
• Enzima are rol în:
-sinteza catenelor de ADN;
-repararea ADN;
-recombinarea genetică.

• Uneşte endergonic fragmentele ADN din

catena lagging (sintetizată discontinuu)
 ADN primaza
• Sintetizează fragmente scurte de ARN,
8-10 nucleotide

• Este o ARN polimerază -ADN dependentă

• Pentru sinteza catenei leading (continuă) este

necesar un singur ARN primer.

• În cazul catenei lagging (discontinuă), fiecare

fragment Okazaki necesită un ARN primer.
 Sensul de deplasare al bifurcatiei 3`
5`
ARN primer
5` Catena leading

3`
Catena lagging

Fragmente Okazaki 3`
5`
ARN primer
Replicarea este semidiscontinuă

• ADN polimerazele, din orice sursă, sintetizează

numai catene cu direcţia 5` 3`

• Cum are loc sinteza catenei având ca matriţă catena

cu direcţia 5`  3` ?

• Okazaki a propus un model, conform căruia

replicarea este semidiscontinuă
 Sensul de deplasare al bifurcatiei 3`
5`
ARN primer
5` Catena leading

3`
Catena lagging

Fragmente Okazaki 3`
5`
ARN primer

• catena în avans sau catena leading este sintetizată continuu,

în direcţia 5`  3`, de către ADN polimeraza III

• catena în întîrziere sau catena lagging este sintetizată

discontinuu de către ADN polimeraza III.
– Enzima sintetizează fragmente Okazaki (150-200 nucleotide), în direcţia
5`  3` fiecare cu ARN primer.
Replicarea se desfăşoară in vivo cu viteze
egale pentru ambele catene
5` ADN ligaza

3` ADN polimeraza I
Catena "lagging"
Primaza
Helicaza Primozom

3`

5`
ADN polimeraza III
ADN giraza
Catena "leading"

5`
3`
 Replicarea cromozomului bacterian

Iniţiere
Elongare
Terminare

☺Iniţierea replicării presupune formarea

replizomului ( enzimele şi factorii replicării )

In regiunea ori C  helicaza + primaza formează

primozomul.

Primozom + ADN polimeraza III + ADN giraza +

proteine  replizomul
ADN
Ori C
1

Segment ADN ATP-dnaA responsabilă de

corectitudinea iniţierii
replicării
2

dnaB
Helicaza
dnaC-ATP
3

dnaC

dnaB

Replicare
Iniţierea

Helicaza denaturează ADN parental în regiunea OriC

Proteine stabilizatoare împiedică renaturarea ADN

Primaza iniţiază sinteza unui ARN primer

Primerii, furnizează gruparea 3`-OH necesară iniţierii sintezei

de ADN de către ADN polimerază
 Proteine care se leagã
Catena la ADN monocatenar
leading

Catena
lagging Polimeraza
Helicaza
Primaza
 Elongarea ARN iniţiator

• ADN polimeraza III catalizează

adăugarea dezoxiribonucleozid trifosfaţilor,

la capătul 3` al ARN primer,

în ordinea dictată de matriţă.

• ADN polimeraza III sintetizează ADN în direcţia

5`  3`

• Deoarece catenele ADN sunt antiparalele, polimeraza

funcţionează asimetric
 5`
Catena parentalã 5`
ARN primer ADN
(10-12 nucleotide) Catena
3` complementarã 3`

-
O P O
-
O P O
O
O
CH 2 U A
O CH 2 U A
O

O OH
O OH
-
O P O
-
O P O
O
A O
CH 2 U
O U A
CH 2
O

3` PPa
..OH OH
-
O OH
O O O
-
O P O
-
O P O P O P O
O
- -
O O O
CH 2 T A
CH 2 T A O
O

OH H
OH H 5` 5`
Replicarea se desfăşoară in vivo cu viteze
egale pentru ambele catene
5` ADN ligaza

3` ADN polimeraza I
Catena "lagging"
Primaza
Helicaza Primozom

3`

5`
ADN polimeraza III
ADN giraza
Catena "leading"

5`
3`
 Terminarea replicării

• Proteine specifice

se leagă la secvenţa terminatorie

împiedicând helicaza

(proteina dna B)

să desfacă duplexul ADN

 Fidelitatea replicării ????
• Crearea unei catene noi complementare
cu matriţa
• Activitatea de corector a ADNp III
• Necesitatea unui primer
• Alegerea unui sens unic al replicării 5`3`
• Existenţa unui sistem reparator constitutiv
post-replicativ
• Existenţa unui sistem inductibil de
reparare
 Replicarea la eucariote

• Replicarea la eucariote:
-este semiconservativă
-se desfăşoară bidirecţional
-din mai multe origini.

• Replicarea la eucariote are loc în faza

S, de sinteză, a ciclului celular (durata 8
ore)
• Diviziunea celulară la eucariote are loc în
patru faze distincte

G2
Mitoza
Faza S

G1

G0
• Faza S este separată de faza mitotică prin
perioadele de gol sintetic, G1 şi G2

• Faza G0, de nondiviziune (resting phase).

• Trecerea G0 G1 S mitoză

– este reglată de kinaze activate de

• cicline – proteine a căror concentraţie creşte sau

scade dramatic în cursul ciclului celular.
• Celulele tumorale ştiu să evite faza G0 a
ciclului celular.
La eucariote s-au identificat cinci
polimeraze
, b,,dşi e.

  şi d sunt implicate în replicarea ADN

nuclear.
 pentru sinteza catenei “lagging”
d pentru sinteza catenei “leading”.
(Are acţiune 3`  5` exonucleazică)

 b şi e sunt implicate numai în repararea

ADN
• La eucariote 100 de bifurcaţii de replicare

pe cromozom
la procariote: 1000 perechi de baze/secundă

la eucariote: 100 perechi de baze/secundă), ca urmare a

interferenţelor cu nucleozomii şi proteinele cromozomiale.

ADN
 La eucariote ADN nuclear este replicat în
întregime şi o singură dată per ciclu celular.

• ADN replicat este marcat prin

– metilarea, în general a citozinei, la 5-metil-
citozină pentru a se evita o nouă replicare
până la mitoză.

• Gradul de metilare este de 3-5% pentru

regnul animal.
 Terminarea replicării la
cromozomii liniari

Indepărtarea primerului din capătul 5` al catenei

lagging şi degradarea ADN monocatenar rămas
– duce la scurtarea cromozomului la fiecare rundă de
replicare

– şi pierderea de informaţie genetică de la capetele

cromozomilor.
• Cromozomii eucariotelor conţin la ambele
capete telomere.

• Cromozomii fără telomere sunt instabili:

– fuzionează cu alţi cromozomi
– sunt degradaţi.

• Telomerele sunt secvenţe de cca. 1000

nucleotide bogate în G care se repetă în
tandem.

oligonucleotid telomeric (GGGGTTTTGGGG)

quadruplex telomeric, reglează
activitatea telomerazei
T
T T
G G
T
G G
G G
G G
G G
G G
G G
G G T

T T
T
 Telomerazele sunt
ribonucleoproteine

• Telomeraza funcţionează astfel similar

cu o revers transcriptază
• Absenţa telomerazei, care permite
trunchierea graduală a cromozomilor la fiecare
rundă de replicare a ADN, poate contribui la
senescenţa normală a celulelor.

• Creşterea activităţii telomerazei poate

permite replicarea şi creşterea celulară
necontrolată, proces care se produce în
cancer.
 Reconstituirea cromatinei

• In faza S cantitatea de ADN şi histone se

dublează

• În timpul replicării:
– histonele existente se asociază cu duplexul
care conţine catena fiică „leading“

– cele nou sintetizate se asociază cu duplexul

care conţine catena fiică „lagging“.
 Compuşi care afectează replicarea

folosiţi ca medicamente antibacteriene şi antivirale

• Antimetaboliţii (5-fluorouracilul, metotrexatul, 6-

mercaptopurine) reduc sau inhibă producerea de
substrate (dNTP) pentru replicare.

• Substratele analoage (azidotimidina, citozin

arabinozidul) pot fi încorporate în molecula de ADN de
către ADN polimeraze inhibând viitoarea replicare.

• Inhibitori ai ADN girazei (acidul nalidixic şi

fluorochinolonele), enzimă care elimină torsiunile
introduse de girază în procesul replicării.
 Reverstranscrierea
Sinteza de ADN pe matriţă de ARN
• Revers transcriptaza este prezentă în virusurile
oncogene care conţin ca material genetic ARN

• Enzima este o ADN polimerază – ARN dependentă,

care se activează numai la pătrunderea în celula gazda.

• Primerul folosit de revers transcriptază est un ARNt

înglobat în particular virală
• Enzima prezintă
– activitate de revers transcriptază:
–activitate ribonucleazică (ribonucleaza H);
–activitate ADN polimerazică – ADN dependentă.
Virus cu 2 molecule ARN
si revers transcriptazã

Pãtrundere în calula gazdã

ARN legat de revers transcriptazã

Sinteza ADN de cãtre
revers transcriptazã
ARN-ADN hibrid
ARN viral Sinteza ADN dublu catenar
ADN dublu catenar
Genom gazdã Integrarea ADN în genomul celulei gazdã
ADN din celula gazdã
• Revers transcriptaza nu prezintă activitate
exonucleazică 3` 5`, putând face greşeli în
replicare, ceea ce explică numărul mare de
tulpini virale.
• HIV este un virus versatil răspunzător de SIDA
(virusul conţine genele: pol, env şi gag)

• Revers transcriptaza poate utiliza ca matriţă

orice ARN pe care construieşte un ADNc
(complementar), această posibilitate putând fi
utilizată în obţinerea unor gene sintetice.
 MUTAŢII. REPARAREA ADN

• Notiunea de mutatie a fost elaborata in anul1901

de catre Hugo de Vries care este autorul
binecunoscutei teorii mutationiste.

• Mutaţiile sunt modificări permanente ale secvenţei

nucleotidice a ADN

• Mutaţiile punctiforme= modificări ale unei singure

perechi de baze
Mutaţiile pot fi produse prin:

☺Substituţia unei baze cu altă bază

 tranziţia A…..T
G….C

 transversia A……T
C……G

☻Deleţia
☻Inserţia
 Cauzele care determină apariţia
mutaţiilor

a.Erori în procesul de replicare care scapă

celor 2 sisteme:
-activitate de corector a ADN polimerazei III.
-sistemele specializate de reparare postreplicative
 5` 3` 3`
5`
T ...... A C A
T ...... A C A

T ...... A C A
Locul de hidrolizã al Locul de hidrolizã al
exonucleazei 3` 5` T ......
A T ...... A
exonucleazei 5` 3`
T ...... A
C A
3` HO T ...... A
A
A T ...... A

5` 3` 5`
a) b)

• ADN polimeraza I îndepărtează ARN primer ca urmare a

activităţii exonucleazice 5` 3` şi îl înlocuieşte cu ADN ca
urmare a activităţii polimerazice.
• b.Factori chimici
Agenţii nealchilanţi:
–formaldehida (H2C=O): reacţionează cu grupările
amino;
–hidroxilamina (NH2-OH) reacţionează specific cu
citozina;
–acidul azotos (HNO2) determină dezaminarea oxidativă
a citozinei, adeninei, guaninei modificând
împerecherea bazelor deoarece o amină se transformă
în cetonă.

Agenţii alchilanţi.
–etilmetan sulfonatul, adaugă o grupare metil la azotul
din nucleul purinic labilizând legătura N-glicozidică prin a
cărei hidroliză apare un loc depurinat;
• c.Analogi structurali ai bazelor azotate pot fi
încorporaţi în catena de ADN.
5-bromuracilul, se împerechează de obicei cu adenina. Forma
enolică se leagă cu guanina. Tranziţia produsă este
A…T cu G…..C
2-amino purina se împerechează de obicei cu timina. Forma sa
tautomeră normală (amino), se poate lega cu citozina
producând mutaţia prin tranziţie GC la AT.
O

Br N
HN 5 N

O N H2N 2 N NH
H
5-bromo uracil 2-amino purina
• d.Factori fizici
Radiaţiile ultraviolete (200-400 nm) induc
formarea dimerilor de timină TT

UV

Formarea dimerului de Structura unui dimer

timinã într-o catenã ADN de timinã intracatenar
Radiaţiile ionizante
Razele X, radiaţiile , determină deschiderea
nucleului purinic, depurinarea şi ruperea
legăturilor fosfo-diesterice.
• e.Depurinări-Hidroliza legăturilor glicozidice

• f.Dezaminări spontane
CU
G  Xantină
A  Hipoxantină
• g.Inserţie: Acridină

• h.Deleţie: pH şi temperatură
 Repararea ADN
• Prin:
a.excizie
-excizia dimerilor de timină
-excizia unei secvenţe ce conţine o
bază dezaminată
b.directă
-fotoreactivare
-dealchilarea guaninei
c.prin recombinare.
 Repararea prin excizie

a.Repararea ADN la procariote prin excizia dimerilor

de timină 5` 3`

3` 5`
Excizia unui fragment
de 12 nucleotide

Sinteza de ADN de cãtre

ADN polimeraza I

Formarea unei legãturi covalente

de cãtre ADN ligazã
• Repararea ADN în cazul dezaminarii uneia
dintre bazele azotate
– prin dezaminarea citozinei uracil

– adeninei hipoxantina

– guaninei xantina

se face analog reparării prin excizie

 DE ce timină în ADN şi nu uracil ?

• Prezenta timinei şi nu a uracilului în ADN

permite repararea ADN ce conţine citozina
dezaminată (uracil).

• Folosirea timinei în structura ADN şi nu a

uracilului măreşte fidelitatea mesajului
genetic.
 Repararea directă a ADN
• prin fotoreactivare
• ADN fotoliaza,
o enzimă care se află în toate organismele şi care este activată
de radiaţiile din domeniul vizibil (l = 400-600 nm).

clivează legătura covalentă timină-timină din

dimerii de timină

• Absenţa genetică a fotoliazei duce la creşterea

riscului de apariţie a cancerului de piele.