Sunteți pe pagina 1din 49

Preparate microscopice

Preparate microscopice

⚫Examenul bacteriologic urmareste evidentierea si


identificarea bacteriilor in produsele patologice.

⚫Bacteriile au dimensiuni de micrometrice, deci


nu pot fi vizualizate decat la microscop.
Preparate microscopice
⚫Sunt de doua feluri:

⚫Preparat nativ cu germeni vii.

⚫Preparat colorat-frotiu cu germeni omorati.


Examenul microscopic da
indicatii asupra

⚫ prezentei microorganismelor in preparat


⚫ proprietatilor morfotinctoriale:
- forma (bacili, coci, spirili)
- marimea
- mobilitatea ( in preparatul nativ )
- existenta eventuala a formatiunilor
neobligatorii ( cili, capsula, spori)
⚫ Asezarii bacteriilor in frotiu ( lant, ciorchine, diplo,
tetrade, etc)
⚫ Proprietatile tinctoriale ( colorabilitatea )
Examenul microscopic
⚫Examenul microscopic direct din produsele
patologice permite in unele infectii stabilirea
diagnosticului :
�-gonococ –frotiu col.Gram din secretia uretrala
(criteriu suficient de diagnostic)
�-bacil tuberculos-frotiu col.ZN din sputa
-stafilococ –frotiu col.Gram din secretii purulente

Constituie o etapa esentiala in identificarea


bacteriana.
Preparatul nativ
⚫Este un preparat ce contine germeni vii
⚫ Ex. microscopic al preparatului nativ se face prin
examinarea directa intre lama si lamela a unei
suspensii de germeni vii, intr-o picatura de ser
fiziologic, sau mediu de cultura lichid, precum si
a produsului patologic (singe, sediment urina,
lcr).
Examinarea se face cu obiectiv uscat ( 40x).
Preparatul nativ
⚫Principiu:citoplasma este incolora si are indice de
refractie putin diferit de al mediului de montare
al preparatului.De aceea in preparatele umede
microbii devin vizibili numai in conditii speciale
de iluminare:
⚫Reducerea diafragmei de apertura la microscopul
cu fond luminos
⚫Examinarea pe fond intunecat
⚫Microscopie in contrast de faza.
Efectuarea unui preparat nativ

⚫O picatura din suspensia bacteriana se pune pe o


lama microscopica cu ajutorul unei pipete
Pasteur si peste picatura se pune o lamela.
⚫Preparatul se examineaza la microscopul optic,
pe fond intunecat sau prin contrast de faza.
Examinarea la microscopul optic
⚫Se face cu un obiectiv uscat, cu condensatorul
coborat, obtinandu-se un contrast cat mai
mare.
⚫Privind din lateral apropiem obiectivul de
preparat
⚫Privind prin ocular ridicam obiectivul pana
apare imagine in campul microscopic
⚫Miscand viza micrometrica vom obtine detalii.
⚫Aceasta examinare permite observarea
mobilitatii, formei si a numarului bacteriilor.
Examen nativ
Examen nativ
Examenul microscopic pe fond
intunecat

⚫Utilizeaza un condensator special de tip cardioid


care evidentiaza conturul bacteriilor, corpul fiind
luminos.
⚫Metoda se foloseste la studiul mobilitatii
bacteriene si la evidentierea speciilor greu de
colorat prin metode obisnuite: Treponema,
Leptospira
Examenul microscopic in contrast de
faza

⚫Foloseste condensator
si obiective speciale cu
contrast de faza.
⚫Evidentiaza detalii
morfologice: spori,
capsula
Examenul microscopic al unui
preparat colorat (frotiu)
⚫Proprietatile morfotinctoriale ale bacteriilor pot
fi studiate mai detailat , pe preparate fixate si
colorate, cu germeni omoriti .

⚫Mai rar se folosesc coloratii vitale, spre ex. in


reactia de umflare a capsulei.
Examenul microscopic al unui
preparat colorat (frotiu)

⚫Principiu:fixarea colorantului pe structurile


protoplastului mareste refringenta
microorganismelor si permite observarea
detaliilor morfologice.
⚫Structuri speciale asociate peptidoglicanului
bacterian determina anumite afinitati tinctorilae
care apar dupa coloratii diferentiale.
Timpii de executie a
preparatului colorat
⚫Timpi pregatitori:

⚫ Etalarea = intinderea frotiului

⚫ Uscarea

⚫ Fixarea
Timpi terminali
⚫Colorarea

⚫Spalarea

⚫Uscarea
Etalarea
⚫ Intinderea frotiului
⚫ Se face pe lame microscopice perfect curate si
degresate
⚫ Daca produsul patologic este lichid de pune o picatura
pe lama microscopica si se intinde cu ansa.
⚫ Daca se face dintr-o cultura de pe mediu solid, se pune
pe lama o picatura de ser fiziologic in care se
suspensioneaza o colonie cu ajutorul ansei
bacteriologice.
⚫ Un frotiu corect trebuie sa fie bine intins, subtire,
uniform si trebuie sa lase o margine de de 1-2 cm pana
la periferia lamei.
Uscarea

⚫Se face lent la lasand lama la temperatura


camerei, ferita de praf sau de curenti de aer.
Fixarea
⚫Se face prin procedee fizice si
chimice

⚫Procedeul fizic
⚫Este cel mai utilizat si consta in incalzire prin
trecerea lamei printr-o flacara, de trei ori, pana
lama se incalzeste la o temperatura suportabila pe
dosul mainii.
Fixarea
⚫Procedee chimice

⚫Frotiul uscat se trateaza cu :


⚫alcool etilic, metilic
⚫ amestec alcool-acetona
⚫ saruri de metale grele.
Fixare

⚫Prin fixare microorganismele sunt omorate,


preparatul ne mai fiind infectios.
⚫Adera mai bine la lama.
⚫Creste permeabilitatea peretelui celular crescand
afinitatea fata de coloranti.
Colorarea

⚫Se folosesc coloranti organici: acizi, baze sau


coloranti neutrii sub forma de solutii apoase la
care se adauga cantitati mici de alcool.
⚫Ex .de coloranti: fuxina bazica, violet de gentiana,
albastru de metilen, verde malachit, verde metil .
Coloratia
⚫Este un proces fizico-chimic complex in care
colorantul se combina cu componentii celulari
facandu-i vizibili la microscop prin formarea
unor combinatii stabile.
⚫Se acopera suprafata frotiului fixat cu
colorant, se lasa sa actioneze o periada de timp
la cald sau la rece.
⚫In urma colorarii obtinem detalii vizibile la
microscop referitor la structura celulara,
dimensiuni, asezare, etc.
Tipuri de coloratii
⚫Coloratia simpla foloseste un singur colorant
⚫Coloratia combinata: colorantii actioneaza succesiv
sau simultan pe anumite elemente
⚫Coloratii speciale: pun in evidenta elemente
structurale: corpusculi, cili, spori, capsula.
Spalarea
⚫Se face cu apa de robinet sau cu apa
distilata pana la indepartarea excesului
de colorant de pe lama.
Uscarea

⚫Se face la temperatura camerei, punand


lama in pozitie verticala intr-un stativ.
Examinarea microscopica a unui
frotiu colorat
⚫ Se face cu obiectivul cu imersie
⚫ Lichidul de imersie( uleiul de cedru are un indice de
refractie apropiat de cel al sticlei.)
⚫ Se ridica condensatorul la maxim
⚫ Se deschide complet diafragam
⚫ Se fixeaza lama pa platina microscopului
⚫ Se pune o picatura de ulei de cedru
⚫ Se coboara obiectivul pana patrunde in uleiul de
imersie cu ajutorul vizei macrometrice, privind din
lateral
⚫ Se ridica din viza macrometrica pana apare imaginea,
privind prin ocular
⚫ Din viza micrometrica se clarifica imaginea
COLORATII SIMPLE

⚫ COLORATIA CU ALBASTRU DE METILEN


⚫ a) Componente
⚫ - solutie albastru de metilen
⚫ b) Prepararea solutiei colorante apoase
⚫ 1. Albastru de metilen
⚫ - albastru de metilen pulbere …………………...1g
⚫ - alcool etilic 96 grade ………………………10 ml
⚫ - apa distilata ……………………………….100 ml
⚫ c) Tehnica coloratiei
⚫ Frotiul uscat si fixat prin caldura se trateaza astfel:
⚫ - se acopera cu solutie albastru de metilen 2-3 min.
⚫ - se spala cu apa de robinet
⚫ - se usuca si se examineaza la microscop, cu imersie
⚫ d) Rezultate
⚫ - Bacteriile apar la examinarea cu imersie de culoare albastra
Coloratia simpla
⚫Coloratia cu fuxina tote elementele apar colorate
in rosu
COLORATII COMBINATE
COLORATIA GRAM
⚫Este o coloratie compusa folosita in
microbiologie pentru examenul microscopic al
bacteriilor,care a permis clasificareaq acestora in
functie de afinitatea tinctoriala a peretelui
bacterian.

⚫Metoda a fost inventata de bacteriologul danez


Hans Christian Gram in anul 1884!
COLORATII COMBINATE
COLORATIA GRAM
⚫ Tehnica coloratiei
⚫ Frotiul uscat si fixat prin caldura se trateaza astfel:
⚫ se acopera cu sol.Violet de gentiana 1 – 2 min
⚫ se inlatura colorantul si se spala cu apa
⚫ se acopera cu sol. Lugol 2 min
⚫ se inlatura sol. Lugol
⚫ se decoloreaza cu alcool-acetona
⚫ se acopera cu sol.Fucsina diluata 1/10, 30sec-1min
⚫ se spala frotiul cu apa
⚫ se usuca si se examineaza la microscop, cu imersie
⚫ d) Rezultate
⚫ - Bacteriile Gram negative apar la examinarea cu imersie
colorate in rosu
⚫ - Bacteriile Gram pozitive apar la examinarea cu imersie
colorate in violet
Rolul solutiei Lugol
⚫ Mordansarea este tratarea frotiului cu anumite
substante chimice, numite mordanţi (de
exemplu, solutia Lugol), in scopul de a intensifica
activitatea coloranţilor. Mordantii, prin afinitatea
puternica pe care o au atat fata de colorant, cat si fata
de substratul supus colorarii, faciliteaza si
intaresc legatura dintre acestia, contribuind astfel la
obtinerea unei coloratii mai intense si de o
calitate mai buna.
COLORATIA GRAM
⚫ Bacteriile Gram-pozitive rezista la decolorare,
ramanand colorate in violet, dar cele
Gramnegative sunt decolorate de alcool-acetona
si recolorate in rosu.

⚫Comportarea diferita a bacteriilor in coloratia


Gram tine de diferenta in structura peretelui
celular
COLORATIA GRAM

⚫reteaua de peptidoglican tridimensionala cu


ochiuri stranse micsorata si mai mult sub
actiunea deshidratanta a agentilor de diferentiere
poate explica retinerea complexului colorant
violet-iod de catre bacteriile grampozitive
COLORATIA GRAM

⚫ reteaua de peptidoglican bidimensionala cu


ochiuri laxe si dizolvarea unor lipide asociate
peretelui sub actiunea agentilor de diferentiere
poate explica decolorarea bacteriilor
gramnegative.
Bacili grampozitivi
Bacili gramnegativi
Bacili grampozitivi si gramnegativi
Coci grampozitivi
Coci gramnegativi
Coci grampozitivi si bacili
gramnegativi
COLORATIA ZIEHL-NEELSEN

⚫ Tehnica coloratiei
⚫ Frotiul uscat si fixat prin caldura se trateaza astfel :
⚫ se acopera lama cu fucsina fenicata
⚫ se incalzeste la flacara pina emite vapori, de trei ori
⚫ se mentine 10 min.
⚫ se spala cu apa de robinet
⚫ se decoloreaza cu amestec alcool- acid
⚫ se spala cu apa de robinet
⚫ se acopera cu sol. Albastru de metilen 1-2 min.
⚫ se spala cu apa de robinet
⚫ se usuca si se examineaza la microscop, cu imersie
⚫ d) Rezultate
⚫ - Bacilii acid – alcool rezistenti apar la examinarea cu
imersie colorati in rosu
COLORATIA ZIEHL-NEELSEN

⚫Frotiu col.ZN -sputa


Coloratii speciale
⚫Obtinem detalii de structura bacteriana
⚫Col. Moller pentru spori sporul se coloreaza in
rosu;
Bacili sporulati
Coloratia Hiss
⚫Capsula bacteriana se coloreaza in roz iar corpul
bacteriei in violet
Coloratia cu tus de China
Coloratia cu tus de China