Sunteți pe pagina 1din 55

Metode de testare a

imunitatii
Generalitati

Explorarea functiei imunitare permite aprecierea


raspunsului imun normal care apare in cursul bolilor
infectioase si a devierilor mecanismelor imunitare.
Reactiile serologice permit detectarea anticorpilor
sau aprecierea titrului acestora.
Metode de testare a imunitatii
• Sunt reactii Ag-Ac si pot fi grupate in:
• 1. Reactii de agregare- aglutinare
• - precipitare
• 2. Reactii in care intervine Complementul
• 3. Reactii de neutralizare
• 4. Reactii de marcare prin artificii tehnice:
• - imunofluorescenta IF
• - marcarea enzimatica ELISA
• - testarea radioimuna RIA
⚫Reactia de aglutinare
Aglutinarea bacteriana

• Este o reactie Ag-Ac de agregare, in care Ag-nul


este reprezentat de celule bacteriene sau
fragmente de celule bacteriene in suspensie.( Ag
particulat)
• Sub actiunea anticorpilor specifici, complexele
imune Ag-Ac, formeaza retele tridimensionale in
prezenta unor electroliti din mediu si in anumite
conditii de temperatura si ph, constituind
agregate vizibile. Reactia de aglutinare se
foloseste pentru identificarea unor bacterii sau a
unor Ac. din serul bolnavilor.
Reactia de aglutinare
• Tehnici de efectuare a reactiei de aglutinare
• 1. Aglutinarea pe lama
• Se foloseste in diagnosticul bacteriologic pentru
identificarea rapida a unor tulpini bacteriene izolate din
produsul patologic.
• Pe o lama microscopica degresata se pune o picatura de ser
imun si alaturi o picatura de ser fiziologic. Din cultura
bacteriana pe geloza simpla se ia cu ansa o cantitate mica si
se se suspenda omogen in serul imun, apoi se repeta in
serul fiziologic.
• In cazul unei corespondente Ag-Ac in serul imun vor
aparea grunji fini vizibili cu ochiul liber. In serul fiziologic
germenul raman in suspensie omogena. Agl pe lama este o
reactie calitativa. Pentru confirmare se face aglutinare in
tuburi.
Reactie de aglutinare pe lama
Reactia de aglutinare
• 2. Aglutinarea in tuburi
• Se efectueaza in 6 tuburi in care se fac dilutii
crescande din serul de cercetat sau din serul imun
standard.
• Principiul reactiei
• La dilutii crescande de ser se adauga cantitati
egale de Ag. Titrul reactiei este dat de dilutia cea
mai mare in care se mai observa aglutinare.
Reactia de aglutinare
• In aglutinarea bacteriana se observa doua tipuri de
aglutinare:
• aglutinare somatica sau O
• aglutinare ciliara sau H
• Aglutinarea O este data de Ag-ul O somatic din
peretele bacterian ( endotoxina). Este un antigen de
natura glucidopolipeptidica, termostabil,
alcoolorezistent, distrus de formol.
• Aglutinarea O se evidentiaza sub forma de grunji fini
care nu disociaza la o agitare brusca.
• Apare lent –incubare la 52o C, 2 ore si 20 de h la temp.
camerei.
• Este o aglutinare polara, bacteriile se unesc cap la
cap.
Reactia de aglutinare
• Aglutinarea H
• Flagelara, este data de Ag-ul H, prezent la
bacteriile mobile.
• Ag-ul H este de natura proteica, termolabil,
distrus de alcool, rezistent la formol.
• Apare sub forma unor flocoane care formeaza un
sediment abundent si lax, care dispare la agitare.
• apare dupa o incubare de 2h la 52oC sau 20 de h la
37oC. In cursul ei bacteriile se unesc prin flageli.
Aplicatii
• identificarea unor bacterii izolate din produsul
patologic: se identifica speciile si tipurile de
Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Streptococ,
etc.
• diagnosticul serologic al unor infectii prin
evidentiarea anticorpilor in serul bolnavului.
• Ex R. Widal-in febra tifoida
• R. Wright-in bruceloza
• R. Weil-Felix-in tifosul exantematic
Reactii de aglutinare pasiva sau
aglutinare pe suport

⚫Se utilizeaza atunci cand antigenul este o solutie


moleculara. In urma fixarii pe un suport
particulat, acesta devine aglutinabil in prezenta
serului imun.
⚫Prin aceste reactii se pot identifica atat antigenle
cat si anticorpii.
⚫Prticulele inerte folosite sunt: latexul,
polistirenul, hematiile.
Aplicatii
• Reactii de agl. pasiva in care Ag-ul este adsorbit
pe particule de latex, polistiren
• Evidentierea factorului reumatoid: particulele de
latex acoperite cu IgG normale sunt aglutinate de
serurile pacientilor care contin FR( IgM care apar
fata de IgG proprii).Reactia este poz. in artrita
reumatoida,reactia este negativa in RAA si in
poliartrita cr.
• Evidentierea meningococului, pneumococului si
a haemophilusului in l.c.r.
Reactie de aglutinare pe suport
Aplicatii
⚫Aglutinarea pasiva in care Ag-ul este adsorbit pe
hematii se aplica in diagnosticul tiroiditei
autoimune, in poliartrita reumatoida ( testul
Waaler Rose), in evid. ac,. anti- toxoci.
⚫Reactii de precipitare
Reactii de precipitare

⚫Precipitarea este o reactie Ag-Ac de agregare in


care Ag-ul este reprezentat de macromolecule in
sol. coloidala. Punerea in contact a Ag-ului cu Ac-
ul corespunzator duce la formarea de complexe
Ag-Ac care precipita atunci cand elementele aflate
in reactie sunt in proportie optima.
Tehnici
⚫1. Precipitarea inelara
⚫Antigenul si serul imun sunt puse in contact in
tuburi cu diametrul mic, astfel ca ele sa nu se
amestece ci sa formeze o interfata de contact la
nivelul careia prin creerea unei zone de
concentratie optima de Ac-Ag, sa apara un inel de
precipitare. Reactia poate evidentia cantitati mici
de Ag si se utilizeaza in:
Precipitarea inelara
• industria alimentara- pentru detectia originii carnii
• In medicina legala pentru identificarea petelor de
sange
• In diagnosticul bolilor infectioase: Reactia Ascoli- in
dg. retrospectiv al infectiei cu bacilul carbunos. Ag-ul
carbunos rezista in timp si la temperaturi crescute.
Reactia consta in punerea in contact, a serului
anticarbunos cu antigenul extras la caldura din
fragmentele de organe, in tuburi capilare astfel ca cele
doua lichide sa nu se amestece. La interfata de contact
dintre ele va aparea un inel de precipitare opalescent.
Reactie de precipitare in tub
Precipitarea inelara
• Reactia Vincent-Bellot
• Se foloseste in dg. meningitei meningococice : in
l.c.r. se gaseste Ag-ul si acesta se pune in contact
cu serul antimeningococic astfel ca intere ele sa
se produca o interfata de contact, nivel la care se
observa aparitia unui inel de precipitare
opalescent.
• Identificarea grupului de streptococ: se extrage
carbohidratul C din peretele celular si se pune in
contact cu serurile de grup A, B, C, D, F, G si
reactia pozitiva identifica grupul de streptococ.
Reactia de precipitare
Reactii de precipitare
⚫2. Reactii de floculare
⚫Flocularea este o reactie in care precipitarea
apare prin amestecul Ag-lui cu serul imun in
toata masa amestecului, sub forma de flocoane.
⚫Reactia se utilizeaza pentru titrarea toxinelor
bacteriene si a serurilor antitoxice pornindu-se
de la observatia ca flocularea apare prima data in
eprubeta in care exista o proportie optima intre
Ag si Ac
Reactie de floculare
Reactii de floculare
⚫Reactia de precipitare Ramon este prototipul
reactiilor de floculare.
⚫Prin aceasta reactie se poate determina titrul
anticorpilor antidifterici in serul pacientului,
flosind ca Ag toxina, sau se poate titra toxina
folosind ser antidifteric.
Reactii de precipitare
⚫3. Precipitarea in gel
⚫Este o reactie de mare sensibilitate si specificitate
⚫Se foloseste gel de agar ca mediu in care
difuzeaza Ag si Ac, la locul lor de intalnire se
formeaza zone de precipitare vizibile in gelul
transparent.
Precipitarea in gel

⚫A. Difuzia simpla


⚫Difuzeaza doar un reactant, celalalt fiind
incorporat in gel.
⚫Exemple:
⚫Metoda difuziei radiale Mancini se foloseste la
det. cantitativa a unor fractiuni proteice cum ar fi
IgG, IgM, IgA ( imunograma)sau C3 , transferina.
Imunograma
⚫Imunoplacile se folosesc la determinarea
cantitatii de imunglobuline in ser. Ele au
inglobata in gel antiimunglobulina care trebuie
determinata. In godeul central se pune ser de
referinta iar in godeurile periferice se pun
serurile pacientilor. Se incubeaza 4h la 370C si se
masoara diametrul fiecarui inel de precipitare.
Printr-un calcul matematic se stabileste
cantitatea de Ig continuta in ser.
Imunodifuzie radiala
Imunodifuzie radiala
Imunoplaca Imunograma
Precipitarea in gel
⚫B. Difuzia dubla
⚫Ambii reactanti difuzeaza si formeaza linii de
precipitare la locul de intalnire.
⚫Metoda Ouchterlony: pe o placa de sticla se toarna
geloza 1% iar dupa solidificare se fac godeuri.
⚫In godeul central se pune ser imun(Ac). In
godeurile periferice se pun diferite Ag. Daca exista
corespondenta Ag-Ac apar linii de precipitare dupa
incubarea placii .
⚫Prin aceasta metoda putem identifica bacterii,
virusuri, proteine patologice.
Difuzia dubla
Difuzia dubla
Testul Elek
⚫Este un tip particular de dubla difuzie prin care se
identifica tulpinile toxigene de bacil difteric.
⚫Testul se face in placi Petri in care este turnat mediu de
cultura. In centrul placii pe intreg diametrul ei se
scobeste un sant in care se introduce ser antitoxic
100UI/ml. Perpendicular pe acest sant se insamanteaza
tulpina de bacil difteric pe care o testam, tulpina de bacil
difteric toxigena ( martor pozitiv), tulpina de bacil
difteric netoxigena ( martor negativ). Se incubeaza placa
la 370C 18 h si apoi se interpreteaza: Aparitia unei linii de
precipitate in bisectoare unghiului format de tulpina de
testat si santul cu serul antidifteric =tulpina toxigena.
Dubla difuzie-Testul Elek
⚫1.martor pozitiv
⚫2. martor negativ
⚫3.tulpina netoxigena
⚫4. tulpina toxigena
Reactii de precipitare
⚫C. Difuzia in camp electric( IEF)
⚫Imunoelectroforeza este o metoda care asociaza
principiul electroforezei cu principiul difuziunii
in gel. In primul timp are loc separarea
antigenelor componente din antigenul complex.
In al doilea timp se adauga un ser imun
corespunzator si se lasa sa reactioneze in dubla
difuzie cu antigenele separate. Cand se intalnesc
Ag si Ac coresp. apar arcuri de precipitate
caracteristice.
Difuzia in camp electric
Difuzia in camp electric
⚫Contraimunelectroforeza( CIEL)
⚫Datorita incarcaturii electrice diferite, Ag si Ac
migreaza in sens opus intr-un camp electric si la
locul de intalnire cu Ac-ul corespunzator se
produce in gel o linie de precipitare.
⚫Metoda se foloseste pentru detectarea unor Ag
bacteriene sau a Ac-lor din serul pacientilor.
⚫Reactii Ag-Ac cu participarea
complementului
Reactii Ag-Ac cu participarea
complementului
⚫Complementul este un factor esential al rezistentei
naturale si al homeostaziei imunologice naturale.
⚫Este constituit din 12 componente
macromoleculare care sunt prezente natural in
umorile organismului intr-un stadiu inactiv
( molecule precursoare).
⚫Participarea complementului in reactiile imune
este caracterizata prin capacitatea lui de-a induce
liza bacteriilor sensibilizate de Ac. ( bacterioliza
sau imunohemoliza).
⚫Complementul este principalul sistem de
amplificare a reactiilor Ag-Ac.
Efectul bactericid al complementului
⚫In prezenta Ac , complementul poate determina
efect bactericid asupra unor bacterii gram -.
⚫Acest fenomen se poate demonstra in vivo si in
vitro.
⚫Fenomenul de imunhemoliza
⚫In prezenta Ac-lor specifici antihematie
( hemolizina sau serul hemolitic) si a
Complementului, hematiile sunt
lizate=fenomenul de hemoliza imuna sta la baza
determinarii activitatii Complementului prezent
in ser, plasma si lichide extravasculare.
Fenomenul de imunhemoliza

⚫In titratarea activitatii hemolitice a


complementului se ia in calcul dilutia cea mai
mare de complement care lizeaza 50% din
hematii in prezenta unei cantitati optime de Ac.
Antihematie. Aceasta este doza hemolitica: DH
50%.
⚫Imunoliza este indicator in reactia RFC
Reactia de fixare a complementului

⚫Daca reactia Ag-Ac are loc in prezenta C acesta se


fixeaza doar pe complexul imun format si se
consuma in timpul reactiei, dispare din reactie,
iar in tub nu apar modificari vizibile.
⚫Fixarea C pe sistemul Ag-Ac poate fi indirect
evidentiata prin fenomenul de imunhemoliza
folosind sistemul hemolitic ca indicator.
Reactia de fixare a complementului
⚫In reactia de fixare a C ( RFC ) intra doua sisteme:
⚫1. Sistemul care este format din Ac si Ag dintre
care unul este cunoscut iar celalalt trebuie
identificat
⚫2. Sistemul hemolitic cu rol de sistem indicator al
fixarii C pe sistemul Ag-Ac ( de fapt al activarii si
consumului de C). Acest sistem este format din
hematii de oaie si Ac omolog, hemolizina.
⚫Intre cele doua sisteme oscileaza complementul.
Reactia de fixare a complementului

⚫Daca C se fixeaza pe complexul Ag-Ac, nu apar


modificari vizibile in amastecul de reactie, care
ramane tulbure.
⚫Daca reactia este negativa, fixarea C se face pe al
doilea sistem ( cel hemolitic) si duce la liza
hematiilor cu eliberarea Hb si limpezirea
amestecului.
Timpii reactiei RFC

⚫1 Se pune in reactie serul de cercetat


⚫2 Se adauga Ag-ul cunoscut
⚫3. Se adauga Complementul
⚫Se incubeaza la 370C, o ora, si 20 de ore la 40C
⚫4. Se adauga sistemul hemolitic
⚫Se incubeaza o ora la 37oC
⚫Citire: Reactia este pozitiva in absenta hemolizei
⚫ Reactia este negativa daca apare hemoliza.
Reactia de fixare a complementului
Materiale necesare

⚫A. Serul de bolnav inactivat 30’ la 560C pentru


distrugerea C propriu sau seruri standard pentru
identificare de Ag.
⚫B. Ag cunoscut sau de cercetat: (suspensii
bacteriene, virale).
⚫C. Complementul din ser de cobai ( cantitatea
care se foloseste se stabileste prin titratarea C la
fiecare RFC).
Tehnici

⚫1. Tehnica Wasserman


⚫RFC in tuburi, este o reactie calitativa. Nu da
titrul de Ac, stabileste daca in serul de cercetat
sunt Ac anti Treponema palidum.
⚫Hemoliza = R. negativa
⚫Amestec tulbure= R. pozitiva
Tehnici
⚫2. Tehnica Ida- Bengston
⚫Este o reactie semicantitativa care stabileste
titrulAc-lor din serul pacientului. Se face in
eprubete in care se realizeaza dilutii ale serului la
care se adauga Ag si C iar apoi sistemul hemolitic.
Se lucreaza cu seruri pereche recoltate la debutul
bolii si in convalescenta. Titrul trebuie sa creasca
de 4 ori intre cele doua seruri pentru ca reactia sa
fie considerata pozitiva.
Tehnica Ida- Bengston

⚫Se foloseste pentru diagnosticul infectiei cu:


⚫Leptospira
⚫Rickettsia
⚫Clamydia
Tehnica Kolmer
⚫Este o reactie de fixare a complementului la rece
⚫Avantajul metodei consta in faptul ca are o
sensibilitate crescuta, unirea Ag-lui cu Ac-ul este
favorizata de temperatura de 40C .
⚫Este o reactie cantitativa in care dilutiile de ser de
bolnav puse in contact cu Ag-ul si Complementul
se incubeaza la 40C timp de 20 h, apoi se adauga
sistemul hemolitic. Urmeaza o incubare de 1h la
37oC si citirea.
Tehnica Breadstreet- Taylor

⚫Se face in diagnosticul infectiilor virale, in


infectia cu Mycoplasma, si in febra Q
⚫In aceasta reactie se face o titrare speciala a
Complementului = in tabla de sah, in placi cu
godeuri. Incubarea se face la rece.
Reacţia de neutralizare (RN):

⚫formarea complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea


efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor,
enzimelor, virusurilor).