Electroforeza

Definite - generalitati
• Electrophoresa este miscarea particulelor disperse fata
de un mediu fluid sub influenta unui camp electric
uniform spatial. Prima constatare a acestui fenomen
electocinetic apartine lui Ferdinand Reuss (1807) care s
observat ca particulele de argila dispersate in apa
migreaza la aplicarea unui camp electric constant.
• Aceasta deplasare este provocata de existenta unei
interfete incarcate electric intre particule si lichidul
inconjurator.
• Tehnica electroforetica sta la baza unui mare numar de
aplicatii analitice foosite in biochimie, pentru separarea
particulelor dupa dimensiune, sarcina sau afinitate de
legare.
 Principii generale
• Moleculele polare, cum sunt aminoacizii, proteinele, nucleotidele sau acizii
nucleici, migreaza intr-un camp electric.
• Directia si viteza de migrare a moleculelor sunt determinate de mai multi
factori, intre care:
– Sarcina (incarcarea) electrica a moleculei
– Dimensiunea moleculei / masa moleculare
– Forma moleculei

• Incarcarea electrica a proteinelor este determinata de numarul de

aminoacizi cu catene laterale acide sau cu catene laterale bazice.
• La un anumit pH numit punct izoelectric (pI), numarul gruparilor incarcate
pozitiv este egal cu numarul gruparilor incarcate negativ, astfel ca, la un pH
mai mare decit pI, proteinele vor fi incarcate negativ, iar la un pH mai mic
decit pI, proteinele vor fi incarcate pozitiv.
• La pH-ul utilizat in electroforeze de 8.6, proteinele plasmatice sunt incarcate
negativ si vor migra spre anod cu viteze depinzind de marimea sarcinii
Electroforeza: principii
Electroforeza: principii
 Principii generale – electroforeza
proteinelor
• Tehnica electroforetica
“moderna” a fost prima data
pusa la punct de Arne
Tiselius
(Arne Tiselius - A new apparatus for
electrophoretic analysis of colloidal
mixtures - Trans. Faraday Soc.,
1937,33, 524-531)
 Electroforeza- istoric
Tehnica initiala utiliza medii lichide (solutii tampon)
in care se aplica campul electric.
Separarea necesita aplicarea de potentiale ridicate
(sute-mii de volti), de-a lungul unei “cai de
migrare”) foarte lungi.
In timp ce separarea este determinata de forta
electromotoare, alti factori concura la largirea
bezilor de separare – de exemplu, miscarea
browniana. Din acest motiv, rezolutia acestei
tehnici lasa de dorit.
 Separarea electroforetica
• Pentru a ameliora rezolutia (puterea de separare), au fost adoptate
diferite solutii, prin care sa se reduca efectele miscarii dezordonate
a moleculelor. In general, daca faza lichida este inculsa intr-un
material cu vascoszitate marita, sau daca se utilizeaza spatii
capilare sau microcapilare, efectele dezordinii termice sunt reduse.
De asemenea, coborarea temperaturii are ca efect o mai neta
separare a fractiilor.
• Solutii tehnice pentru reducerea spatiului de migrare electroforetica:
– Electroforeza pe hartie
– Electroforeza in geluri (poliacrilamida, agaroza)
– Electroforeza capilara
– Electroforeza pe chip (microcapilara)
• Electroforeza capilara si microcapilara utilizeaza de regula migrarea
prin medii similare gelurilor de poliacrilamida, dar uzual cu un grad
mai mic de reticulare
 Separarea electroforetica a
proteinelor serice
Electroforeza pe hartie s-a utilizat
pana spre sfarsitul anilor 90
pentru analiza proteinelor
pasmatice.
In prezent, se utilizeaza geluri
subtiri de agaroza, care se
rehidrateaza inainte de
utilizare.
Separarea se face la un pH superior
pH izoelectric al poteinelor serice,
astfel, proteinele sunt polarizate
negativ si migreaza dinspre catod
(-) spre anod (+)
 Separarea electroforetica a
proteinelor in gel de PAA
Electroforeza in gel de poliacrilamida utilizeaza ca
mediu de migrare un gel de poliacrilamida, cu
porozitate si densitate ce pot fi adaptate in functie
de conditiile experimentale.
Se utilizeaza mai multe alternative de realizare, intre
care:
- electroforeza proteinelor native (nedenaturate)
- elecroforeza prteinelor denaturate cu dodecilsulfat de sodiu
(SDS)
- electroforeza peptidelor (dupa reducerea puntilor disulfurice
din proteine cu ditioteritol au cu 2-mercaptoetanol)
 Separarea electroforetica a
proteinelor in gel de PAA
- In separare, conteaza sarcina neta (contribuie la
constituirea fortei electroforetice), masa (cu cat este
mai mica migrarea este mai rapida),
- electroforeza proteinelor native: forma proteinelor intervine
ca un factor de intarziere a migrarii si de largire a benzilor
- electroforeza proteinelor denaturate cu dodecilsulfat de
sodiu (SDS): toate proteinele sunt acoperite cu dodecilsulfat
de sodiu, capata o conformatie sferica, uniforma, ceea ce
omogenizeaza modul de migrare
- electroforeza peptidelor: se aplica si denaturarea cu SDS,
permite vizualizarea subunitatilor peptidice din proteinele cu
structura cuaternara
 Etapele electroforezei in gel PAA
1. Se toarna amestecul de gel: acrilamida, bis-
acrilamida, tampon de gel, initiatorul de
polimerizare – tetrametilendiamina – TEMED si
persulfatul de amoniu, in suportul de gel.
Se poate controla porozitatea gelului prin raportul dintre acrilamida (care geereaza polimeri
lineari) si bisacrilamida (care creaza punti intre lanturi). De asemenea, dependent de
materilaul separat, se poate controla concentratia gelului, de regula se lucreaza intre 6
si 18%. CU cat creste concetratia se separa proteine si peptide din ce in ce mai mici.

2. Se introduce “pieptenele” pentru formarea

godeurilor de probe. Se pastreaza la temperatura
camerei pana la polimerizare (20 minute cel putin)
 Etapele electroforezei in gel PAA
3. Se monteaza suportul de gel in aparatl de
electroforeza
4. Se toarna soutia tampon “tampon de cuva) in cele
doua compartimente ale aparatului de
electroforeza, fara insa sa acopere zona de
plasare a probei
5. Se extrage cu grija pieptenele si se toarna probele
de proteine in godeuri
6. Se acopera complet cu tampon gelul din cuva
superioara.
7. Se indeparteaza eventualele bule de aer
 Etapele electroforezei in gel PAA
8. Se monteza capacul aparatului, observand cu grija
respectarea polaritatii
9. Se cupleaza cablurile de alimentare la sursa.
10. Se porneste electroforeza, initial la un curent mic
(cira 10 mA) pana a intrarea probelor in gel; circa
15 minute.
11. Se mareste curentul la circa 60 mA si se
efectueaa electroforeza; electroforeza se intrerupe
cand “frontul” de solvent ajunge la cca 1 cm de
capatul de jos al gelului.
12. Dupa decuplarea cablurilor de alimentare si a
capacului si indepartarea tamponului, se pot
scoate suporturile de gel
 Etapele electroforezei in gel PAA
13. Cu ajutorul unei pene, se forteaza desprinderea
uneia din lamelele suportului de gel, apoi se
desprinde gelul si se transfera in vasul de colorare
14. Se acopera cu reactiv de colorare (Coomassie
briliant blue) si se mentine la temperaura camerei
timp de 2 ore
15. Se indeparteaza colorantul (se poate recicla) si se
adauga solutie de decolorare.
16. Se repeta ciclul de decolorare de 2-3 ore, timp de
circa 1 ora fiacare decolorare.
17. Se examineaza gelul
Ansamblul instalatiei de electroforeza in gel
Aspectul unui gel de
electroforeza
Determination of molecular mass
 Electroforeza “on chip”
13. Cu ajutorul unei pene, se forteaza desprinderea
uneia din lamelele suportului de gel, apoi se
desprinde gelul si se transfera in vasul de colorare
14. Se acopera cu reactiv de colorare (Coomassie
briliant blue) si se mentine la temperaura camerei
timp de 2 ore
15. Se indeparteaza colorantul (se poate recicla) si se
adauga solutie de decolorare.
16. Se repeta ciclul de decolorare de 2-3 ore, timp de
circa 1 ora fiacare decolorare.
17. Se examineaza gelul
Bioanalizorul Agilent 2100
 Etapele pregatirii
• Se prepara reactivii din kit:
– Amestecul de gel-colorant
– Amestecul de decolorare
– Stocul de markeri de greutate moleculara
– Solutia de denaturare
• Se prepara probele de proteine, adica markeri
de greutate moleculara si probele biologice: 4
microL de proba si 2 micoL de solutie
denaturanta; se incalzesc pe baie de apa la
95oC timp de 5 minute
 Etapele pregatirii
• Se dilueaza cu 84 microL de
apa deionizata dupa racire
• Se incarca chipul dupa cum
urmeaza:
– 12 L de amestec gel-colorant
in spotul A; chipul se afla
montat in statia de initiere si
dupa pipetare, se
presurizeaza cu 1 mL de aer
din seringa atasata (v. figura)
Statia de amorsare a chipului
 Etapele pregatirii
• Se continua incarcarea
dupa cum urmeaza:
– 12 L de amestec gel-colorant
in spoturile B si C si D

– 12 L de amestec decolorant
in spotul DS
 Etapele pregatirii
• Se continua incarcarea
dupa cum urmeaza:
– 6 L de proba in godeurile 1-
10

– 6 L de etalon de mase
moleculare in spotul “Ladder”
 Analiza electroforetica
• Se porneste aparatul Agilent 2100
• Se cupleaza la calculator
• Se porneste programul “Expert 2100”
• Se selecteaza aplicatia corespunzatoare:
Analiza de proteine de ex. Protein 80

• Se aseaza chipul in aparat

Analiza electroforetica
Aplicatii ale analizei electroforetice
in biologie celulara
• Analiza compusilor macromoleculari cum
ar fi proteinele, peptidele, acizii nucleici,
de exemplu in lizate celulare, medii de
cultura, omogenate tisulare,e tc.