Universidad Central de Venezuela

CUANTIFICACIÓN DEL ONCOGEN BCR-ABL

POR TÉCNICA POLIMERASA EN TIEMPO REAL
EN LA LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA

Banco Municipal de Sangre

Dra. Mildred Borrego

Caracas, 25 de Abril de 2005

 i ón
uc c
r o d
In t
 Leucemia Mieloide Crónica (LMC)

Clasificación según tiempo de evolución:

Fase Crónica  Fase Acelerada  Crisis Blástica

4-6 años 1 año 3-6 meses

Prevalencia 1-2 casos por cada 100.000 habitantes

Promedio de edad de aparición: 45-55 años
85% de los casos debutan en fase crónica
Faderl et al. NEJM 1999;341:164
Goldman & Melo. NEJM 2003;349:1451
Goldman & Melo. NEJM 2003;349:1451
Goldman & Melo. NEJM 2003;349:1451
 LMC - Tratamiento

-) 1970: Busulfan e Hidroxiurea.

-) 1982: Trasplante alogénico de MO
Horowitz MM. Allogeneic bone marrow transplantation for CML: a
report from the International Bone Marrow Transplant Registry. Bone
Marrow Transplant 1996;17:Suppl 3:S5-S6.

-) 1983: Se introduce IFN-alfa

Talpaz M. y col. Leukocyte interferon-induced myeloid cytoreduction in
chronic myelogenous leukemia. Blood 1983;62:689-92.

-) 1997: Se asocia IFN-a con citarabina

Guilhot F. et al. Interferon alpha-2b combined with cytarabine versus
interferon alone in chronic myelogenous leukemia. N Engl J Med
1997;337:223-9.
 os
tic
ós
on SOKAL:
Pr
s
to
ec

Score LMC =
sp
A

EXP (0,0116 x (edad – 43,4) +

0,0345 x (tamaño del bazo (cms desde RCI) – 7,51) +
0,188 x [plaquetas / 700]2 - 0,563)
+ 0,0887 x (%blastos – 2,10))

Valores de Referencia

< 0,8 Riesgo Bajo

0,8-1,19 Riesgo Intermedio
>1,19 Riesgo Alto

Sokal JE et al. Blood 1984;63(4):789

 os
tic
ós
EUROSCORE (Hasford):
on
Pr
s
to

Score LMC =
ec
sp
A

0,6666 x edad ( 0 si < 50 años y 1 sí > 51 años) +

0,042 x tamaño del bazo (cms desde RCI ) +
0,0584 x (% blastos) +
0,0413 x (% eosinófilos ) +
0,2039 x ( basófilos = 0 si < 3% y 1 si > 4% ) +
1,0956 x (plaquetas = 0 < 1.500.000 y 1 > 1.500.001 ) x 1.000

Valores de Referencia

< 781 Riesgo Bajo

781-1479 Riesgo Intermedio
>1479 Riesgo Alto

Hasford et al. JNCI 1998;90(11):850-8

 Respuesta Citogenética
Completa: Ph(-)
Mayor: 1-35%
Menor: 36-65%
Sin Respuesta:>65%

FISH

Citogenética

t i cos
gnó s
os Dia
ét od
M
I. Sonda para doble cadena II. Sondas de hidrólisis II. Sondas de hibridación

Fluorescencia aumentada por Liberación de fluorescencia Incremento de fluorescencia

la unión a la doble cadena. por hidrólisis. por transmisión de energía.

Hochhaus. Best Pract & Res Clin Hemat 2002;15:159

 Diagnóstico / Recaída

Remisión Parcial

Células BCR-ABL positivas

Sensibilidad de PCR

RT-PCR positiva
Sujetos
Sanos
RT-PCR nested

RT-PCR negativa

Hochhaus. Best Pract & Res Clin Hemat 2002;15:159

 Imatinib
-) 1992: Novartis sintetiza el ST571 mientras
intenta fabricar una droga
antinflamatoria
-) 1996: Se constata que el ST571 bloquea el
complejo bcr-abl
-) 1997: Comienzan los ensayos clínicos
-) 1999: Resultados satisfactorios
100% RH y 41% RCC en fase crónica
70% RH y 17% RCC en fase acelerada
Savage & Antman. NEJM 2002;346:683
 os
iv OBJETIVO GENERAL
et
bj
O

1.- Evaluación de la RT-PCR en tiempo real usando

tecnología Light Cycler, en la cuantificación de los niveles
de BCR-ABL en pacientes con LMC en fase crónica, en fase
acelerada ó crisis blástica al momento del diagnóstico ó en
diferentes momentos durante el tratamiento y
correlacionarlos con los hallazgos clínicos y citogenéticos.

2.- Evaluación de la respuesta al tratamiento de la LMC con

imatinib de acuerdo a la fase de la enfermedad a través de
las diferentes modalidades de pruebas de laboratorio que
traducen respuesta hematológica, citogenética y molecular.
 os
iv
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
et
bj
O

1.- Estratificación de acuerdo a los índices pronósticos y

a la fase de la enfermedad de los pacientes con LMC
que se controlan regularmente en la consulta.
2.- Realización del estudio molecular cuantitativo (RT-
PCR) en tiempo real que defina los valores
relacionados a cada fase de la enfermedad y el
comportamiento de los mismos durante el curso del
tratamiento.
3.- Establecimiento de la asociación entre los hallazgos
por biología molecular al momento del diagnóstico y
durante el seguimiento con los hallazgos
hematológicos y citogenéticos.
4.- Comparación de la supervivencia libre de progresión
en los pacientes en tratamiento con imatinib de
acuerdo a la fase de inicio del mismo.
 o s
tod
M é
 DELIMITACION

59 pacientes BMS, 6 pacientes referidos para estudio

TOTAL: 65 pacientes
Período: Ene/2001 – Dic/2004

Criterios de Inclusión:
Pacientes con LMC en tto con Imatinib
Con o sin tratamiento previo

Criterios de Exclusión
Ausencia de datos de seguimiento
Toma de Muestra
 Evaluación de la Respuesta a
tratamiento

• Respuesta Hematológica

En sangre periférica
GB > 4.000 y < 10.000 x mm3,
< 5% de mielocitos y metamielocitos ; < del 20% de
basófilos, ausencia de blastos y promielocitos en sangre
periférica,
Hb > 10 gr/dL,
Plaquetas >100.000 y < 450.000 x mm3,
Ausencia de compromiso extramedular.
Evaluación de la Respuesta a
tratamiento

• Respuesta Citogenética

Completa: 0% de Ph + (RCC)
Parcial: Mayor: 1-35% de Ph +(RCP)
Menor: 36-95% de Ph + (RCm)
No respuesta: >95% de Ph + (NR)
 Evaluación de la Respuesta a
tratamiento

• Respuesta Molecular

Buena respuesta si existe un descenso de

al menos tres unidades logarítmicas de
BCR-ABL/G6PD en relación al valor
diagnóstico en un período de doce meses.
Estratificación de los pacientes

• Según fase de enfermedad

Fase Crónica
Fase Acelerada
Fase Blástica

• Según índices pronósticos

Indice de Sokal
Indice Hasford
 os
od

Aislamiento del RNA

ét
M

Invitrogen – TRIZOL ®
Solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina
Homogeneización  Pellet (MO y SP)
Fase Separación  Cloroformo 1:1 Trizol / Fase Acuosa
Precipitación RNA  Alcohol isopropílico 0,5:1 Trizol
Lavado  Etanol 75% 1:1 Trizol
Resuspensión  Agua Libre de RNAasa

Chomczynski & Sacchi. Anal Biochem 1987;162:156

 os
od
ADN Complementario
ét
M

Cada ARN de muestra en estudio

3 muestras estándar (I-III) (103, 101 y 10-2) de plásmidos de G6PD
el control positivo ARN LMC K562 específicas para BCR-ABL
control negativo agua libre de ARNasa.
Protocolo
10µL de las muestras de ARN.
I Etapa: desnaturalización a 65°C por 10 min y enfriamiento rápido a 4°C,
II Etapa: mezcla de Buffer de RetroTranscripción (RT) 5x, dNTPs 0,4mL
Random Hexamers 0,2 mL, enzima RT AMV y 0,6 mL de Inhibidor de
ARNasa y agua libre de ARNasa para un volumen final de 20 uL.
37°C por 60 min
65°C por 10 min.
4°C en el último paso.
 os
od
ét
M

Quantitative PCR Lightcycler

(Roche Diagnostics)
 os
od
ét
M

Técnica de Polimerasa en
Tiempo Real

A una mezcla buffer, dATP, dCTP, dGTP, dUTP, y

Taq polymerasa con 4 µm MgCl2
0.25 µm de cada sonda fluorescente de
hibridación, 0,5 µm de cada primer de
oligonuleotidos, 1 U de uracil DNA glicosilasa,
se añadió 5 µL de ADNc y agua hasta obtener un
volumen final de 20 µl.
Localización de los primers de amplificación y las sondas de hibridación.
M
ét
od
os
M
ét
od
os
 os
od
ét
M

ANÁLISIS ESTADíSTICO

Cálculos de medias y porcentajes para variables de

tipo continuo.
Coeficiente de correlación de Spearman.
Prueba T de Student no pareada para comparación de
medias y T de Student pareada para el análisis de
reducciones logarítmicas de BCR-ABL/G6PD.
Curva de Kaplan-Meier y prueba Log rank.

Se estableció una p < 0,05 como nivel de significación

y un intervalo de confianza del 95%.
 o s
lt ad
e su
R
 s
do
lta
su
Re

LMC
65 pacientes

Fase Crónica Fase Acelerada Crisis Blástica

36 pacientes 20 pacientes 9 pacientes
Imatinib 400 mg/día Imatinib 600 mg/día Imatinib 600 mg/día

CONTROL c/4 semanas

HC, AMO, BMO, BCR-ABL
 s
do
lta
su
Re

Fase Crónica Fase Acelerada Fase Blástica

n 36 20 9
Sexo F 19 (52,8%) 13 (65%) 3 (33,3%)
Edad 40,44 (36-44) 49,5 (35-45) 34,5 (21-47)
Hb 12,39 (11,6-13,1) 11,61 (10,6-12,5) 11,4 (10,2-12,5)
GB 135.420 163.170 196.130
Plaquetas 464.400 571.600 601.440
SOKAL
Bajo 17 (47,22%) 9 (45%) 1 (11,11%)
Medio 10 (27,77%) 6 (30%) 3 (33,33%)
Alto 9 (25%) 5 (25%) 5 (55,55%)
HASFORD
Bajo 20 (55,55%) 14 (70%) 2 (22,22%)
Medio 13 (36,11%) 5 (25%) 5 (55,55%)
Alto 3 (8,34%) 1 (5%) 1 (11,11%)
 s
do
lta
su
Re

Fase Crónica Fase Acelerada Fase Blástica

n 36 20 9

N° Tratamientos 2,1 (1-3) 2,81 (2-4) 2,88 (2-5)

Tiempo pre-Tto 15,8 (9-22) 47,25 (36-58) 64,44 (22-106)

Hidroxiurea 34 (94%) 20 (100%) 8 (89%)

IFN-alfa 13 (36%) 13 (65%) 5 (56%)
IFN-alfa + Ara-C 9 (25%) 10 (50%) 2 (22%)
Otros 2 (11%) 12 (65%) 7 (78%)
 s
do
lta
su
Re

n 18
Citogenética al Dx
Normal 2/18 (11%)
Ph(+) 14/18 (77%)
Ph(+) y otros 2/18 (11%)
TOTAL 100% (n=18)

Citogenética en seguimiento 36
Normal 15/36 (42%)
Ph (+) 21/36 (58%)
Alteraciones adiconales 10/21 (47%)

Hallazgos Citogenéticos
 Correlación entre los niveles del BCR-
ABL/G6PD obtenidos en SP y MO.

BCR-ABL/G6PD SP
25 muestras de SP y MO 4

r Pearson = 0,8019 2

p < 0,0001 0

-2
-10 0 10 20 30 40 50
BCR-ABL/G6PD MO
 Comparación de los valores promedios
de BCR-ABL/G6PD según fase de LMC

350

300

250

200
%BCR-ABL/G6PD

150

100

50

DXFC FA CB

Fase de LMC

BCR-ABL/G6PD 7,17% 24,79% 83,19% p = 0,002

Medias de reducción logarítmica de BCR-ABL en
pacientes en fase crónica de LMC tradados con
imatinib

100000
10000
Unidades log BCR-ABL

1000
100
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
0
0
DX 6M 12M 18M 24M 30M
meses de tratamiento
 Niveles de BCR-ABL de pacientes en FC: primera
línea de tratamiento con imatinib y segunda línea de
tratamiento con imatinib

10

0,1

0,01
BCR-ABL/G6PD

Imatinib
0,001 1
2
0,0001

0
DX 6M 12M 18M 24M 30M
meses de tratamiento
 Medias de Reducción logarítmica de BCR-ABL
en pacientes con fase acelerada
tratados con imatinib

1000

100 Medias de Reducción logarítmica de BCR-ABL en pacientes en fase acelerada

de LMC tradados con imatinib
10
BCR-ABL/G6PD

1
Log BCR-ABL/G6PD

0,1

0,01

0,001

0,0001

0
DX 6M 12M 18M 24M 30M

Meses de tratamiento
BCR-ABL/G6PD y la remisión hematológica

Niveles de BCR-ABL/G6PD: 2,48% en pacientes con

remisión hematológica (n=103)

Niveles de BCR-ABL/G6PD: 14,11% en pacientes que

no había alcanzado la remisión hematológica (n=60)

p = 0,002
 s
do
lta
su

Relación entre remisión citogenética

Re

y niveles de BCR-ABL/G6PD

RC RP Rm NR

BCR-ABL/G6PD 0,24% 2,85% 23,27% 28,1%

IC 95% 0-0,63% 0-10,14% 1,06-45,47% 0-74,40%

p = 0,001
 Supervivencia libre de progresión en pacientes en
tratamiento con imatinib según fases de la LMC
Probabilidad de sobrevida

Logrank p = 0,001

Meses de tratamiento
IMATINIB – EFECTOS ADVERSOS

Se registraron 8/56 (14,2%) casos que requirieron suspensión

temporal del tratamiento por la presencia de un evento adverso:
-) 75% por toxicidad hematológica grado II ó III
-) 25% restante por eventos adversos no hematológicos.

Los efectos adversos más frecuentemente reportados fueron

36% edema de miembros inferiores ó palpebral.
30% toxicidad hematológica.
10% calambres.
10% cefalea.
otros reportados: aumento de peso, mialgias, epigastralgia y
artralgias.

2 casos con hipopigmentación cutánea y 4 casos durante el

tratamiento se apreció anemia con déficit de Vitamina B12 .
 ión
c u s
D is
 Monitorizacion del Tratamiento

 Evaluación post Imatinib – Evaluación más exhaustiva

 Valores óptimos: relativos vs. absolutos
 Dosis adecuadas a la fase de enfermedad
 ¿ Cuál es el lugar de la Citogenética ?

Estandarización de la técnica

 Validación de aspectos técnicos

 Correlación entre muestras de SP y MO
 Combinaciones con otros tratamientos
 Asociación con IFN-alfa o citarabina
 Utilización pre-trasplante de MO

Significado Pronóstico de la Respuesta Molecular

 ¿ En qué momento se alcanza la mejor respuesta ?
 Relación entre SLE – mejor respuesta –
¿ Se extiende a todas las fases de la enfermedad ?
 Limitaciones

Disponibilidad de Citogenética
Disponibilidad del tratamiento
Heterogeneidad de la muestra
 Conclusiones
 La qRT-PCR es una técnica efectiva, viable y sensible para el
seguimiento de pacientes con LMC tratados con imatinib.

 La reducción de la carga de BCR-ABL en pacientes tratados

con imatinib alcanza el orden de 3 unidades logarítmicas en los
pacientes en fase crónica y 2,7 en los pacientes con fase
acelerada.

 La reducción de BCR-ABL más significativa se alcanza en

los seis primeros meses de tratamiento con imatinib y en 36
meses posterior tiende a mantenerse mas baja.
 Conclusiones
 Valores bajos de BCR-ABL/G6PD se asocian a Remisión
citogenética completa y el mantenimiento de la remisión
hematológica (0,24% y 2,4% respectivamente) durante el
tratamiento con imatinib.

 Los pacientes que inician tratamiento con imatinib en fase

acelerada tienen mayor probabilidad de progresar que los
pacientes que inician imatinib en fase crónica.

 La toxicidad reportada bajo tratamiento con imatinib fue de

predominio no hematológica sin embargo la suspensión
del tratamiento obedeció fundamentalmente a toxicidad
hematológica.