Sunteți pe pagina 1din 54

DIAGNOSTICUL INFECȚIILOR

VIRALE
Particularităţi:

 Particule de dimensiuni foarte mici (18-400nm),


vizibile doar cu microscopul electronic;
 Posedă un singur tip de acid nucleic: ADN, ARN;
 Sunt paraziţi intracelulari obligatorii;
 Înmulţirea virusurilor – replicare;
 Fiecare virus prezintă o structură antigenică specifică
(omul şi animalele infectate cu un virus produc
anticopri specifici);
 Virusurile sunt insensibile la antibioticile uzuale.
DIAGNOSTIC DE LABORATOR

1. DIRECT:
 particula virală în totalitate,
 Antigene,
 Acid nucleic (ADN sau ARN).
2. INDIRECT:
 Anticorpi (IgM, IgG, IgA).
1. DIRECT
I. Recoltarea produselor biologice

 Sdr respiratorii: exsudat nazal, exsudat faringian, lichid de


spălătură nazală, spută (3-7 zile)
 Sdr digestive: materii fecale, tampon rectal
 Rash vezicular: lichid vezicular, produs de raclaj
 Infecţii urinare: urină
 Infecţii oculare: raclat conjunctival sau corneean, exsudat
faringian
 Sdr meningian/ encefalitic: LCR,
 materii fecale,
 salivă,
 Sânge
 biopsii
Transport

 Pe gheata
 Medii speciale cu antibiotice si proteine
(albumina, gelatina)
Particula virală

Vizualizare prin microscopie electronică (ME) sau


imun electrono-microscopie (IEM).
Particulele virale sunt detectate daca sunt in nr
suficient și identificate pe baza morfologiei. Se
utilizează o mărire de 50.000 ori.
ME se poate folosi pt dg:
 Rotavirusuri, adenovirusuri, astrovirusuri,
calicivirusuri sau pt virusul Norwalk.
 Herpesvirusuri, papillomavirus
Pt vizualizare sunt necesare minim 105-106 particule
virale/ml.
Picornavirusuri
IME
 Creste sensibilitatea si specificitatea ME
 Variante ale IME:
 IEM clasică: proba este tratată, anterior examinării la ME cu
un ser specific cu Ac monoclonali, antivirus presupus prezent
în produsul biologic.
 Particulele virale, prezente în probe vor aglutina şi în final, se
vor agrega, datorită specificităţii reacţiei Ag-Ac;
 IEM în fază solidă: grila de microscopie electronica, (sau alt
suport), va fi “coafată” cu Ac monoclonali; particulele virale
prezente în produsul biologic vor fi adsorbite la suprafaţa
grilei prin intermediul Ac.

10
Crio electron microscopy
(A) A representative field of particles with a
1000 Å scale bar. (B) An enlargement of one
particle with arrows indicating regions of
density attributed to DAV‐1 Fab fragments.
 capsids from LV. The capsids are coloured by radius from blue to red
according to the scale bar shown. (d) Ribbon diagram of the LV
protomer. VP1, VP0 and VP3 are shown in blue, green and red,
respectively; (e–g) Ribbon diagrams showing the LV capsid proteins
VP1 (e), VP0 (f) and VP3 (g)
Cultivarea virusurilor

 Pt. stabilirea dg. unei viroze sunt necesare


izolarea şi identificarea ag. patogen în prod.
patologice recoltate de la bolnav, animale,
cadavru.
 Cultivarea lor e posibilă prin inoculare în o
gazdă receptivă:
 Animale de laborator;
 Ouă embrionate;
 Culturi de celule.
Ou embrionat de gaina

04/26/2020 15
Izolarea virusurilor
 Culturi de celule: evidenţierea efectului citopatic (CPE) produs de
către virusuri citopatogene; identificarea virusului izolat prin IF,
reacţia de neutralizare (RN), testul de hemadsorbţie, RIA, etc.
 Izolarea pe ouă embrionate în dezvoltare: evidenţierea de
pocksuri la nivelul membranei chorioalantoidiene (MCA), urmată
de identificarea prin RIH.
 Izolarea pe animale de laborator determină decesul sau
reproducerea bolii la animal, urmată de obţinerea de secţiuni
histologice şi examinarea lor prin MO pentru evidenţierea unor
leziuni caracteristice şi identificarea de antigene prin RN, RIH, etc.
Culturi celulare monostrat sunt inoculate cu
produsele biologice recoltate.
Pentru evidențierea virusurilor în culturile celulare se
folosesc diferite metode:
 Efect citopatic,
 Inhibarea hemadsorbției,
 Identificare de antigene (imunofluorescență).
 Teste de biologie moleculară.
Necesita 1-2 zile (HSV) pana la 1-3 saptamani (CMV)
Culturi celulare

 Culturi primare (rinichi de maimuță). Pentru


una sau două repicări (resp, enterov).
 Culturi semicontinue (fibroblaste sau celule
embrionare). Pot fi mentinute până la 50 de
treceri (CMV, VZV, rhinov).
 Culturi continue (HeLa, Vero, HEp-2, LLC-
MK2, BGM). Celule tumorale cu dezvoltare
continuă (RSV).
Continuous Cell lines Viruses cultivated

Respiratory syncytial virus, 


HeLa (Human epithelial cell line of
cervical carcinoma) Adenovirus, HSV, Poliovirus and
some Coxsackie viruses

HEp-2 (Human epithelial type 2 cells) Adenovirus, HSV, Poliovirus and


some Coxsackie viruses

Lymphocytic choriomeningitis (LCM)


BHK 21( Baby Hamster Kidney cells) virus, Lassa virus, Rubella virus

MDCK (Dog kidney cell line) Influenza virus, Oral and killed polio
vaccine production
PBC (peripheral blood cells) HIV

AGMK ( African green monkey Kidney) Rubella

HSV, Lassa, LCM, Dengue, yellow


fever virus, bunya virus, Rift valley fever
Vero (monkey kidney cell line) virus, Colorado Tick Fever virus and other
hemorrhagic fever viruses and
arboviruses

HEK (human embyonic Kidney)  VZV, Measles, Adenovirus,

PMK(Primary monkey Kidney) Mumps, Enterovirus, Influenza virus

HFF (human foreskin fibroblasts) semi CMV


continuous cell line culture

RD (Rhamdomyosarcoma cell line) CoxsackieA virus

LLC-MK2 (Rhesus monkey kidney) Parainfluenza virus


 Celulele sunt disociate cu tripsina sau
colagenaza
 Sunt cultivate intr-un singur strat sau in
suspensie in mediu artificial, suplimentat cu
ser si factori de crestere
Efectul citopatic

 Cultura celulară își schimbă caracteristicile


macroscopice sau microscopice (morfologie,
liza, vacuole);
 Sincitii (celule gigante multinucleate aparute
prin fuziune)
 Incluzii celulare, intracitoplasmatice sau
intranucleare (corpusculi Babeș-Negri sau
incluzii citomegalice) .
Microscopia optică:

Evidentiaza modificări histopatolgice şi


evidenţierea de incluzii

 Incluziile cu diferite localizări:


 intranucleare şi/sau intracitoplasmatice,
 eozinofile sau bazofile,
 cu variate forme – rotunde, alungite, piriforme,
etc.
 reprezintă doar un reper orientativ şi nu unul
patognomonic.
Infectii cu VHS (incluzii
IN)
Leziuni determinate de VHS. Sageata verde indica incluzii IN,
cea albastra , celule keratinizate, iar cea rosie, celule
binucleate, cu incluzii iN.
Sageata rosie - incluzii IN, albastra, degenerarea celulelor
cu balonizare (aspect generat de VHS, keratinocite,
multinucleate).
VVZ – incluzii IN
V. rabic – incluzii IC (bazofile) Coloratie HE
Incluzii Babes-Negri
granule albastru-inchis la nivelul incluziilor
(coloratie Sellers)
VRS – sincitii si incluzii eozinofile i.c.
Infectie HIV – celule nervoase
Incluzii Cowdry A, IN si IC – eozinofile
(coloratie HE)
CULTIVAREA VIRUSURILOR – EFECT CITOPATIC - sincitii
Virus urlian : CC- sincitii (se confunda cu cele
ale VRS – diferentiere prin testul de
hemadsobtie)
CULTIVAREA VIRUSURILOR – INCLUZII VIRALE
Metoda rapida de cultura (shell vial):
 Centrifugarea probei pe cultura monostrat
 Incubare 1-2 zile
 Evidentiere prin imunofluorescenta
 CMV, HSV, VZV, resp, enterov.
Formarea plajelor de liza
 Imunofluorescenta
 Interferenta
 Hemadsorbtie,
 Hemaglutinare, IHA
 ELVIS (enzyme-linked virus inducible system)
 TCD50
 LD50
 ID50
Interferenta

 Interferenţa heterologa intrinsecă reprezintă


inducerea de către un virus heterolog a unei stări
antivirale care previne suprainfecţia cu virusul prototip
sau cu alte virusuri înrudite
1. competiţia pentru receptori celulari sau
distrugerea acestora, astfel încât cel de al doilea
virus să nu se poată adsorbi;
2. inhibarea penetrării unui virus deja adsorbit;
3. datorita acţiunii mecanismelor de sinteză
intracelulară;
4. prin modificări apărute în faza multiplicării
virionului.
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA

39
Rabie - imunohistochimie

40
Detectarea de antigene:

 In produse biologice sau in cultura


(reactie Ag-Ac)
 imunofluorescenţă (IF),
 teste imunenozimatice (ELISA – enzime
linked immunosorbent assay);
 latex aglutinarea (LA);
Detectarea genomului

 PCR si RT-PCR
 Metoda cea mai sensibilă și cea mai specifică
 Permite detecția a nanograme de ADN sau
ARN viral din faza incipientă a infecției
Linii modificate genetic

 Care exprima promotori de replicare ai


virusurilor (raspund la o proteina virala
specifica din proba inoculata)
 Activarea unui promoter declanseaza sinteza
de β-galactozidaza ce actioneaza pe substrat
specific
 HSV, HIV
Reactii Ag-Ac
Reacţia de precipitare
 a) Reacţia de precipitare în mediul solid
 - Difuzia în gel
 - Imunodifuzia radială simplă
 - Dubla difuzie în gel
 - Difuzia combinată cu migrarea electroforetică
 - Imunoelectroforeza
 - Contraimunelectroforeza
 - Electroimunodifuzia
 - Imunofixarea
 b) Reacţia de precipitare în mediul lichid
 - Reacţia de precipitare în inel
 - Imunonefelometria
Reactii Ag-AC (Dg dir, indir)

 2. Reacţia de aglutinare
 a) Reacţia de aglutinare directă
 b) Reacţia de aglutinare indirectă
 c) Reacţia de inhibare a aglutinării
 d) Reacţia de aglutinare mediată de anticorpi
anti-imunoglobuline
 3. Reacţia de neutralizare
Reacții de aglutinare

46
 4. Reacţii ce utilizează complement - Reacţia de
fixare a complementului
 5. Reacţii cu reactivi marcaţi
 a) Reacţia de imunofluorescenţă
 - Reacţia de imunofluorescenţă directă
 - Reacţia de imunofluorescenţă indirectă
 b) Analiza radioimunologică
 c) Analiza imunoenzimatică
 -Tehnica ELISA
 6. Tehnica Western Blot
48
Plăcuța de ELISA

49
Western Blot

Image courtesy of Bio-Rad Laboratories

(b) (c)
Figure 5.21c: The typical results of a Western blot
Figure 5.21b: The structure of HIV-1. testing patient serum for HIV-1 antibodies. 50
 Caracteristica generală a reacţiei Ag-Ac este
specificitatea, adică capacitatea ac de a
discrimina Ag omolog de alt Ag.
 Reacţia Ag-Ac se desfăşoară în unul sau mai multe
stadii:
 - interacţiunea primară se datoreşte legării
efective a Ac cu Ag şi depinde de cantitatea şi
afinitatea Ac. Tehnicile care evidenţiază interacţiunea
primară Ag-Ac sunt tehnici curente de diagnostic (ex.
nefelometria).
 In vivo, interacţiunile primare participă la protecţia
gazdei (neutralizarea toxinelor, inhibarea acţiunii
unor virusuri sau bacterii) sau la declanşarea unor
reacţii anafilactice
 interacţiunea secundară urmează celei primare (după
aprox. 30 min.). Produsul final este complexul Ag-Ac
insolubil. Interacţiunea secundară stă la baza
tehnicilor imune (reacţiile de precipitare, aglutinare,
fixare de complement, neutralizare).
 interacţiunea terţiară prezintă o complexitate mai
mare decât cea secundară. Depinde de variabilele
gatdei (receptori pentru Ag, complement, mastocite).
Pot determina protecţia gazdei (neutralizarea
virusurilor, imobilzarea bacteriilor) sau degranularea
celulelor (fenomenul Arthus, şocul anafilactic)
Detecția ac în serul pacienților

 Răspuns primar și secundar


 IgM la prima expunere,
 Ig G la a doua expunere, rămân o perioadă
îndelungată

54