GEMicro – Grupo de Estudos

Microbiológicos

LIMPEZA,
DESINFECÇÃO,
ESTERILIZAÇÃO
E MEIOS DE
CULTURA
• Acadêmicos: Lucas K. Risson e Rayssa E. Moraes;

• Mestranda: Adriana Souto;

• Orientadores: Laura Beatriz Rodrigues, Fernando Pilotto
e Luciana Ruschel. ALPINE SKI HOUSE
GEMICRO – GRUPO DE ESTUDOS
MICROBIOLÓGICOS

Características bioquímicas e método de

isolamento de Salmonella sp.

• Acadêmica: Lara Spagnol;

• Mestranda: Adriana Souto;
• Pós-doutoranda: Viviane Girardi;
• Orientadores: Laura Beatriz Rodrigues e Luciana Ruschel.

ALPINE SKI HOUSE

CONCEITOS DE HIGIENIZAÇÃO
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 CONCEITOS DE HIGIENIZAÇÃO

LIMPEZA

DESINFECÇÃO

ESTERILIZAÇÃO

cevs.rs.gov.br
MANEJO COMALPINE
A AUTOCLAVE
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 LIMPEZA

Lavagem: Água + detergente

• Caso tenha incrustações ou resíduos gordurosos nos materiais, realizar
imersão em solução de hipoclorito de sódio a 2% e detergente neutro.
• Como o desinfetante age por contato, os materiais devem ser colocados
em recipiente (plástico) contendo solução suficiente para que
permaneçam totalmente imersos. Deixar agir por no mínimo 15 minutos.
• Enxágue com água corrente; Utilizar no último enxágue, água destilada
ou deionizada.
• Deixar drenar a água das vidrarias e secar em estufa a 100 °C.
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 DESINFECÇÃO Agentes Físicos Agentes Químicos

3 categorias de desinfetantes conforme a ação germicida:

• Alto nível: destrói todos os microrganismos, exceto alto nº de esporos
=> Glutaraldeído 2% ; ácido peracético; ác. peracético+peróxido de .
• Médio nível: elimina bactérias vegetativas, a maioria dos vírus, fungos
e micobactérias =>Álcool 70%; Hipoclorito de sódio 1% .
• Baixo nível: elimina a maioria das bactérias, alguns vírus e fungos,
mas não elimina micobactérias e esporos bacterianos =>Hipoclorito de
sódio 0,025%.
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 ESTERILIZAÇÃO Calor Úmido

Temperatura Elevada + Umidade

Maior efetividade p/ destruir microrganismos

• Temperaturas 90ºC ocorre a desnaturação irreversível de proteínas.

• Combinação 3 variáveis críticas: TEMPO
TEMPERATURA
PRESENÇA DE VAPOR SATURADO

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AUTOCLAVE

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A autoclave é um dos principais
equipamentos do laboratório, que
são utilizados para esterilização,
envolvendo calor úmido.

A esterilização através da
autoclave é o método mais
recomendado pela ANVISA
(Agência Nacional de Vigilância
Sanitária)

A esterilização nada mais é do

que exterminar toda vida
microbiana existente (bactérias,
esporos, fungos, helmintos,
protozoários e vírus).
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A autoclave é como se fosse uma
‘’panela de pressão’’ gigante,
então deve-se ter muito cuidado
no manuseio desse
equipamento.

Todo cuidado é pouco!!!

Se tiver dúvidas e/ou inseguro

em como manusear a autoclave,
SEMPRE pergunte ao responsável
do laboratório!
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 QUAIS SÃO AS ETAPAS
NECESSÁRIAS ANTES DA
ESTERILIZAÇÃO POR
AUTOCLAVE?

1. Materiais devem ser

corretamente higienizados e
embalados;

2. Verificar como se encontram os

indicadores de pressão e de
temperatura;

3. Verificar que o nível da água

dentro da autoclave esteja até o
“x”.
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 MANEJO COM A AUTOCLAVE

1. Colocar os materiais dentro da

autoclave;

2. Ligar o registro;

3. Fechar bem a autoclave e cuidar para

não fechar a válvula;

4 1
3

2 2

3 1 4
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 MANEJO COM A AUTOCLAVE

4. Ligar a autoclave até o nível 3;

5. Observar que na mangueira só sai vapor,

fazendo ‘‘o teste que chia’’ , então ai sim pode
fechar a válvula;

6. Observar o ↑ de temperatura da autoclave

(cada material tem uma temperatura ideal,
verificar na folha de
registros de temperatura)

MANEJO COMALPINE
A AUTOCLAVE
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MANEJO COM A AUTOCLAVE

7. Chegou na temperatura esperada,

então contar os minutos indicados
para cada tipo de material;

8. Diminuir a temperatura de 3 para 2;

9. Depois dos minutos finalizados,

colocar a temperatura no ZERO e
desligar o registro;
11. Abrir a autoclave.
10. Observou que a temperatura no
manômetro chegou a ZERO, abrir a
válvula e fazer “teste que chia”;
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 CONTROLES DA ESTERILIZAÇÃO

Indicador químico do processo

de esterilização pelo calor úmido:

bvsms.saude.gov.br
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 CONTROLES DA ESTERILIZAÇÃO

•Termômetro;

•Controle Biológico;

•Controle Químico;

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FILTROS
BACTERIOLÓGICOS

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 FILTROS HEPA (High Efficiency Particulate Arrestance)

Filtros de alta eficiência p/ retenção de partículas do ar, encontrado no fluxo laminar.

Sistemas de filtro HEPA

incorporam luz UV
de alta energia p/
eliminar bactérias e vírus
vivos aprisionados pelo
elemento filtrante.

Algumas unidades mais bem classificadas

são capazes de reter até 99,995% de impurezas,
o que assegura um alto nível de proteção.
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 FILTROS HEPA (High Efficiency Particulate Arrestance)

Câmaras de Fluxo Laminar Filtros de ar de alta eficiência (90%)

Membranas de acetato de celulose

• Recuperação aprimorada
de organismos delicados
• Filtração de soluções
enzimáticas

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 FILTROS HEPA (High Efficiency Particulate Arrestance)

Câmaras de Fluxo Laminar

• Antes de iniciar os trabalhos, fazer a desinfecção

c/ álcool 70% de toda a parte interna do fluxo;
• Ligar o aparelho;
• Ligar a lâmpada UV e esperar 15 minutos p/ desligá-la;
• Colocar todo o material necessário para o procedimento,
evitando o afastamento do fluxo laminar;

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MEIOS DE
CULTURA

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 TIPOS

• Solido;
• Semissólido;
• Caldo;

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 TIPOS

• Meio de cultura enriquecido;

• Meio de cultura seletivo;

• Meio de cultura diferencial.

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Vamos fazer um meio?

1° Ver instruções do rotulo.

2° Pesa-lo e coloca-lo no Schott juntamente com o volume adequado de água
destilada;
3° Para meios sólidos e semissólidos é necessário diluir levando ao micro-ondas;
4° Phmetro;
5° Autoclavar;
6° Phmetro;
7°Verter nas placas.
8° Colocar na UV e posteriormente embalar para evitar contaminações.
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• Os meios preparados são pesados separadamente, papel manteiga ou papel
alumínio, e adicionados em um único frasco.
1º - Hidratar pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido.
2ª - Acrescentar o restante da água.
• Os meios devem ser autoclavados com as tampas semiabertas (tampas fechadas
não permitem a entrada do vapor).
• Se necessário, fundir o meio aquecendo no micro-ondas. Usar luvas térmicas!
• Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome,
data de fabricação e data de validade.
• Todos os meios de placa devem ser embalados em filme plástico PVC transparente
para evitar o ressecamento.

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• O termo “esterilizar em autoclave” = tempo x temperatura devem ser compatíveis
com o meio a ser produzido, conforme orientação do fabricante.
• O termo “esterilizar por filtração” = usar o filtro com porosidade de 0,22 e 0,45µm,
recomendado para partículas bacterianas.
Esterilizar materiais
sensíveis ao calor
(alguns meios de cultura,
enzimas, vacinas e
soluções antibióticas)

Existem filtros c/ poros tão pequenos

quanto 0,01µm, tamanho que retém vírus
e algumas moléculas grandes de proteína.
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• Álcool etílico a 70% - Desinfetante de nível intermediário
Utilizado para artigos e superfícies por meio de fricção.

Transformar álcool 92,8% em 70%

92,8% ----------------- 1000
70%--------------------- x
x= 754,31 álcool 1000 - 754,31 = 245,69 água destilada

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DELINEAMENTO
EXPERIMENTAL

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• Qual o objetivo do trabalho?
Exemplo: Isolar e identificar a presença de Salmonella spp. em carcaças bovinas de 3
abatedouros (SIF, CISPOA, SIM) da região centro-oeste do Rio Grande do Sul.

• Qual a metodologia? Qual a legislação que devo seguir?

Qual a técnica de isolamento?
Exemplo: 1 coleta a cada 15 dias, 40 amostras por coleta (10 amostras em cada
ponto de coleta), totalizando 720 amostras no período de 3 meses.

Amostragem TOTAL
Frigorífico 1 – 40 + 40 = 80 amostras em 1 mês 3 meses = 240 720 amostras
Frigorífico 2 – 40 + 40 = 80 amostras em 1 mês 3 meses = 240
Frigorífico 3 – 40 + 40 = 80 amostras em 1 mês 3 meses = 240
240 amostras por mês
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4 Pontos de Coleta:

I ) depois da sangria (do couro)

II) após a esfola
III) após a evisceração 40
amostras
IV) após a lavagem final por
coleta

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ISO 7218:2019- Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal –
Requisitos gerais e orientações para análises microbiológicas.
ISO 6579:2014- Microbiologia de alimentos para consumo humano e animal —
Método horizontal para a detecção de Salmonella spp.
ISO 6887:2011- Microbiologia de alimentos e de produtos de alimentação animal –
Preparação de amostras-teste, suspensão inicial e diluições decimais para análises
microbiológicas.
ISO/TS 11133-1:2009- Microbiologia de alimentos e de produtos de alimentação
animal – Orientações gerais na preparação e produção de meios de cultura.
ISO 8261:2001- Leite e produtos derivados – Guia geral para preparação de
amostras-teste, suspensão inicial e diluições decimais para análises microbiológicas.
IN nº 20 DE 21/10/2016 MAPA - Estabelece o controle e o monitoramento de
Salmonella spp. nos estabelecimentos avícolas comerciais de frangos e perus de
corte e nos estabelecimentos de abate de frangos, galinhas, perus de corte e
reprodução, registrados no Serviço de Inspeção Federal (SIF).

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Técnica de Isolamento

ISO 6579:2014
Pré-enriquecimento

Enriquecimento seletivo

Plaqueamento seletivo-diferencial

Confirmação

Provas bioquímicas Teste sorológico

Presença/Ausência em 25g ou mL
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Cronograma

Enriquecimento seletivo
APT TT / RV XLD / Leitura Bioqui- Leitura
MacCo- das mismo Bioqui-
nkey Placas mismo

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 4 esponjas estéreis por carcaça, cada uma umedecida 40 esponjas estéreis
c/ 10mL de Solução Salina Peptonada
400 mL SS Pept.
(1% peptona e 0,85% NaCl)
40 frascos de 225mL
25mL amostra

225 mL APT
40 Pré-enriquecimento OU 10 frascos de 1L
com 900mL APT
1 mL 0,1 mL 37°C/24h
Iodo 0,2mL
0,1 mL Verde
80 tubos
brilhante Enriquecimento seletivo 8mL Iodo
Novobiocina
9 mL TT 10 mL RV
4mL Verde brilhante
360mL TT + 400mL RV
37°C/24h 42°C/24h
3 a 5 colônias típicas
37°C/24h AN SIM LIA TSI Uréia 5 tubos por placa = 400 tubos
Provas bioquímicas +/- 200 tubos
XLD MacConkey XLD MacConkey
37°C/24h
Teste sorológico
Plaqueamento seletivo-diferencial 40 placas XLD 1mL S.S. 0,85%
40 placas MacConkey Anti-soro O SKI HOUSE
ALPINE 37
Resumo da técnica de isolamento de Salmonella spp.

PESAGEM DOS MEIOS

Capela de fluxo laminar; Balança analítica; Álcool 70%; Algodão; Colher estéril ou
pinça (espátula) estéril; Papel Alumínio (autoclavado ou não); Frasco com água
destilada estéril (ex: XLD).

• Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar

esterilizados.
• Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e
vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis (ex: TT e XLD).

PRÉ - ENRIQUECIMENTO
Água peptonada tamponada; Homogeneizador de amostras (stomacher);
Verter a água peptonada tamponada na porção de 1/10 (amostra/diluente), dentro
da saqueta contendo a amostra. Homogeneizar no stomacher e incubar a 37ºC, por
24 horas.
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Resumo da técnica de isolamento de Salmonella spp.

ENRIQUECIMENTO SELETIVO
Tubos com Caldo Rappaport Vassiliadis Soja (RV) autoclavado; tubos com Caldo
Tetrationato (TT); reagentes (iodo e verde brilhante); estantes para tubos; pipeta 10
mL estéril, micropipeta de 200µl e 1000µl estéreis; ponteiras de 200µl e 1000µl
estéreis;

Homogeneizador de amostras (stomacher); agitador de tubos (vortex); bico de

Bunsen ou capela de fluxo laminar; estufa bacteriológica a 37ºC e a 42ºC; banho-
maria a 37ºC.

• Caldo TT não deve ser armazenado. Preparar no momento do uso ou deixar o

meio preparado sem a solução de iodo e de VB, e no momento do uso acrescentar
as soluções.

ALPINE SKI HOUSE 39

Resumo da técnica de isolamento de Salmonella spp.

PLAQUEAMENTO SELETIVO-DIFERENCIAL
Ágar XLD; Ágar MacConkey; Álcool 70%; algodão; placas de petri; alças de
inoculação.
Estriar (esgotamento) uma alçada da amostra enriquecida no meio TT e outra alçada
no meio RV em cada placa de Ágar XLD e Ágar MacConkey, incubar as placas
invertidas a 37 ºC, por 24 horas.

• Conservação e validade dos meios: conservar as placas embaladas de 2 a 8°C por

até 2 meses.

PROVAS BIOQUÍMICAS
Tubos de Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI); tubos de Ágar Lisina Ferro (LIA); tubos de
Caldo Ureia; tubos de Ágar Nutriente (AN); tubos de Meio SIM; reagente de Kovacs;
alças de inoculação;
Deixar os tubos de TSI, LIA e Uréia inclinados após a autoclave.
ALPINE SKI HOUSE 40
Resumo da técnica de isolamento de Salmonella spp.

SOROTIPIFICAÇÃO
Repicar as colônias suspeitas em ágar nutriente (AN) e incubar a 37 ºC por 24
horas. Adicionar 0,5 a 1,0 mL de solução salina 0,85% estéril ao crescimento
bacteriano e homogeneizar (vortex).
Depositar, separadamente, sobre a superfície da lâmina de vidro, uma gota da
solução salina 2% e uma de antissoro “O” ou antissoro “H”. Acrescentar uma gota de
suspensão bacteriana sobre cada uma das duas gotas e homogeneizar.
Realizar a leitura em até 2 minutos, com iluminação sobre fundo escuro.

CONGELAR AMOSTRAS POSITIVAS

Estoque no Freezer (-20º C) ou -70 ºC.
Eppendorf estéreis; BHI; 20% de glicerol.
3 mL BHI (37ºC/24h), centrifugar em 4.000 rpm por 10 minutos, descartar o
sobrenadante, adicionar 0,8 mL BHI e 0,2 mL Glicerol, homogeneizar no vortex e
congelar.
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 REFERÊNCIAS
• Manual de Métodos de Análises Microbiológicas em Alimentos – ITAL BIER, Otto.

• Bacteriologia e imunologia em suas aplicações a medicina e a higiene. São

Paulo: Melhoramentos, 1975. LACAZ-RUIZ, Rogério.

• Manual Prático de Microbiologia Básica. São Paulo: Editora Edusp, 2000, 129 p.

• Laboratório de Microbiologia: normas gerais, instruções de trabalho e

procedimentos operacionais padrões - Lajeado: Ed. da Univates, 2013.

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OBRIGADO

ALPINE SKI HOUSE