Centro de invetigación y estudios

avanzados del IPN

Biomedicina molecular
CURSO DE BIOLOGÍA MOLECULAR DE EUCARIOTES

Reacción en cadena de la polimerasa

(PCR) PCR en tiempo real
PCR retro transcriptasa

Médico Martínez Frías Sandra Paola

ENERO 2020
 Rección en cadena de la polimerasa (PCR)
Reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de
DNA durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente.
Desarrollada por Mullisen 1985 y automatizada a partir de 1988 gracias al empleo de la Taq DNA
Polimerasa.

Enzima DNA polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las
 

células. Taq DNA Polimerasa; enzima termoestable (Thermus aquaticus).

DNA genomico - PCR

DNA complementario, proveniente del RNAm -  RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)

Tres etapas principales: desnaturalización, hibridación y extensión.

Los termocicladores establecen un sistema homogéneo (temperatura y tiempo) en cada uno de los ciclos.

Para corroborar si se amplificó “amplicones” son analizados en geles de agarosa.

 PCR punto final

Elementos quimicos de la técnica:

DNA: se separan y funcionan como molde templado para que la DNA polimerasa
sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de interés.
Taq DNA polimerasa: más usada, otras enzimas ¨Vent¨ (bac.Thermococcus
litoralis).
Iniciadores o primers: secuencias de oligonucleótidos (prom.18 a 22,  G-C = o
<55%) que flanquean y delimitan la secuencia blanco.
Forward (sentido) y reward (antisentido)
Desoxirribonucleótidos trifosfatados, dNTP’s:  bases nitrogenadas con los
que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de DNA. Concentración
adecuada contribuye a la especificidad de la reacción.
Buffer: solución amortiguadora que se usa en la reacción y generalmente está
compuesta de Tris-HCL (pH = 8) cuya concentración final de trabajo debe ser 1X.
Magnesio: Cofactor enzimático que influye en la especificidad de la reacción.
Agua: disolvente en la reacción y se usa en su forma destilada.
Etapas de la tecnica PCR:

Desnaturalización:  el tiempo

depende de la secuencia del
templado y de la velocidad del
termociclador.
Hibridación: los primers se
alinean al extremo 3´ del
templado e hibridan
“Temperatura melting” (Tm)
Elongación: Tac Polimerasa
actua complejo “templado-
primer”

Resultado:
Amplicones
Análisis del producto de amplificaciónn
Importancia: investigación médica y biológica como
clonación de ADN para la secuenciación, análisis
funcional de genes, diagnóstico de trastornos
hereditarios, identificación de huellas genéticas y
detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.
 PCR Tiempo real

 Higuchi 1992; videograba en tiempo real la incorporación de bromuro de

etidio al ADN durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV.
Fundamentos de la tecnica:
Detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante el
uso de reporteros fluorescentes en la reacción sin necesidad de gel de agarosa.
Se basa en la PCR punto final, sólo que la forma en cómo se detectan y analizan
los productos de la amplificación es diferente.
Métodos de detección: Especificos ( transferencia de energía de resonancia
fluorescente, FRED) y no especificos ( moleculas intercalantes DNA doble cadena)
Reporteros Fluorescentes: Bromuro de Etidio, SYBR Green I.

Aplicación: cuantificar cambios muy pequeños en la expresión génica mediante

la detección de los niveles del ARNm procedente de células o tejidos.
PCR Tiempo real

Método no especifico:
Reportero SYBR Green I - Ex 480 nm y la
Em 520 nm.
La fluorescencia emitida es capturada en la
etapa de extensión de cada ciclo y es
proporcional al número de copias de ADN de
doble cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR.

Análisis termocicladores
PCR Tiempo real

Método específico: Sondas TaqMan
Actividad exonucleasa 5’-3’ de la
Taq polimerasa rompe esta unión

Análisis termocicladores
 PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

ARN como molde inicial,

emplea una transcriptasa
inversa (como Tth) para
realizar la sintesis de un ADN
complementario al ARN
(ADNc).

1er paso: retrotranscripción a

partir del ARN.
2do paso: aplificación a partir de
la primera hebra de ADNc.
3er paso: PCR estandar.