CINETICA ENZIMATICA

CINETICA ENZIMATICA
• estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas
• Proporciona información directa acerca del mecanismo de la
reacción catalítica y de la especificidad del enzima.
• no es necesario purificar o aislar el enzima.
• La velocidad de reacción puede determinarse :
– midiendo la aparición de los productos
– midiendo la desaparición de los reactivos
• Se realiza siempre en las condiciones óptimas :
– pH,
– temperatura,
– presencia de cofactores
– concentraciones saturantes de sustrato → velocidad máxima (V max)
• CINETICA DE REACCION:
– Curva de avance de la reacción
– Siguiendo la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del
sustrato) en función del tiempo
– A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del
producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la
reacción
– Se mide la velocidad inicial de la reacción (v0)
– V0 es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero

pendiente

Vo
EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO

[S] altos
Enzima saturada
de sustrato
V = Vmax

[S] bajos valores

Vo α [S]
 MODELO CINETICO DE MICHAELIS-MENTEN

• 1913: Leonor Michaelis y Maud Menten

• propusieron una ecuación de velocidad que explica el
comportamiento cinético de los enzimas

• k1, k2, k3 = constantes cinéticas individuales

KM, o constante de
Michaelis-Menten
ecuación de Michaelis-Menten
 CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA

• Vmax : valor máximo al que tiende la curva experimental

• KM : concentración de sustrato a la cual la velocidad de la
reacción es la mitad de la Vmax
 Representación de Lineweaver-Burk
• Determinación gráfica de KM y Vmax
• (1/v0 frente a 1/[S]0)
• Es una recta en la cual:
– La pendiente es KM/Vmax
– La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM
– La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax
• UNIDAD INTERNACIONAL DE ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA: (UEA)
– cantidad de enzima que cataliza la transformación de
1 micromol de substrato por minuto, bajo condiciones bien
definidas (condiciones estándar).
– T = 30°C
– pH y S óptimas
• KATAL (símbolo: kat): cantidad de enzima que
cataliza la transformación de 1 mol de substrato por
segundo.

• Unión Internacional de Bioquímica 1 kat = 6

x unidades internacionales.
 ACTIVIDAD ENZIMATICA
• unidad de actividad enzimática (UAE): cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto.
– Ejemplo:
– UAE CAT = cantidad de enzima que descompone 1 umol de H2O2 por
minuto a 25°C

• actividad específica: número de unidades de enzima por miligramo de

proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).
– Ejemplo:
– One enzyme activity unit (EAU) was defined as the amount of enzyme
that inhibited the photoreduction of NBT by 10% under the assay
conditions. The results were expressed as EAU per kilogram of fresh
fruit (EAUkg−1).
 ACTIVIDAD ENZIMATICA
• número de recambio: número de reacciones elementales que realiza el
enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo (Kcat)

• ACTIVIDAD RELATIVA: UAE/g tejido

Actividad relativa Actividad

específica
UAE/g tejido UAE/g proteína
 FACTORES QUE AFECTAN A LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
• Concentración de enzima
• Concentración de sustrato
• pH
• Temperatura
• Inhibidores
 FACTORES QUE AFECTAN A LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Concentración de enzima
(volumen de extracto)

Concentración de sustrato
(diferentes volumenes)
 Influencia del pH
• pH OPTIMO: pH característico al cual su actividad es máxima; por
encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye.

• En muchos casos los perfiles de actividad de las enzimas en función

del pH son acampanados. En otros casos no.

• La relación del pH con la actividad de la enzima depende del

comportamiento ácido-base de la misma, así como de otros factores
difíciles de analizar de forma cuantitativa.

• El pH óptimo de una enzima no es necesariamente idéntico al pH de

su entorno intracelular normal
puede hallarse a su
vez en la pendiente
ascendente o
descendente de la
curva
 Influencia de la temperatura
• las reacciones enzimáticas incrementan su velocidad con la
temperatura.
• La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica,
aproximadamente por cada 10°C de aumento de la temperatura.
• Luego la aparente temperatura "óptima" viene determinada por
estos dos procesos:
– El incremento habitual de la velocidad de la reacción con la temperatura.
– El incremento en la desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar
una temperatura crítica.
• A partir de los 55-60 ºC la mayor parte de las enzimas se inactivan.
Sin embargo, las enzimas de bacterias termofílicas siguen siendo
activas a temperaturas superiores a los 85 ºC.
Actividad enzimática
Tº y pH óptimos
 INHIBIDORES
• La inhibición de algunas enzimas por metabolitos específicos constituye un elemento
importante en la regulación del metabolismo intermediario.

• Los tres tipos principales de inhibición reversible de las enzimas son:

– competitiva
– acompetitiva
– no competitiva

• Se estudian experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor en la

cinética de reacción de la enzima.

• Reversible:
– Competitiva
– No competitiva
• Irreversible: Por modificación de uno o más grupos funcionales del enzima (NH 2,
-COOH, etc).
INHIBICIÓN COMPETITIVA

• El inhibidor tiene una forma

parecida al del sustrato y se
une de forma reversible al
centro activo del enzima en
lugar del sustrato (compiten
por unirse al centro activo)

• Puede revertirse
incrementando la
concentración de sustrato.
 ES
EI

Puede modificarse la conformación del centro activo!

INHIBICIÓN NO COMPETITIVA

• Actúan en un lugar del

enzima distinto al centro
activo, llamado SITIO
ALOSTÉRICO.
• Causa una modificación
estructural que impide que
el sustrato se pueda unir al
centro activo.
EI ES

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 INHIBICION ACOMPETITIVA
• el inhibidor no se combina con la enzima libre.
• Se combina con el complejo enzima-sustrato-inhibidor (E-S-I), el cual no se
transforma en el producto habitual de la reacción: ES + I  ESI

• Disminuye Km aparente en la misma proporción que la vmáx (como el I se une al

complejo ES, su presencia se manifiesta también a elevadas [S], por lo que
disminuye vmáx).

• No es que haya aumentado la afinidad de E por S: en realidad se mantiene igual,

pero como la vmáx ha disminuido, se precisará menor [S] para alcanzar 1/2 vmáx y
por eso la Km disminuye -y la afinidad aumenta- "aparentemente".

• La inhibición acompetitiva es poco frecuente en las reacciones de un solo

sustrato, pero es corriente en las reacciones de dos sustratos.
ESI ES

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