CH.

2262: Analyse instrumentale

organique pour pharmacien-nes

2014
Chimie analytique instrumentale
Prof. P. Belser
peter.belser@unifr.ch
 • Vendredi: 8.15 – 10.00 h
• Fin: 28.05.14
Le cours • Sauf: 18.04. (vendredi saint) jusque 27.04.
(vacances de Pâques),
• L’examen écrit: TBA
• Moodle: Aiopp

Littérature

2014
Chimie analytique instrumentale
• Instrumentelle Analytische Chemie
Carl Cammann, Spektrum Akademischer Verlag
• Instrumentelle pharmazeutische Analytik
Gerhard Rücker, Michael Neugebauer, Georg Willems, WVG
• Analytik II - Kurzlehrbuch: Quantitative und instrumentelle pharmazeutische
Analytik
Eberhard Ehlers, Deutscher Apotheker Verlag
• Taschenatlas der Analytik
Georg Schwedt, Thieme 2
Chimie Analytique
• L’analyse des produits  la reconnaissance
 la caractérisation

2014
L’échantillion:
L’échantillion
Comprimé d’aspirine
l’analyte

Chimie analytique instrumentale

la matrice L’analyte:
= ce que l’on L’acide acétylsalicylique/0.5 g
cherche à = tout le reste
La matrice:
déterminer Cellulose, fécule de maїs

• Quelle analyte a-t-on? – l’analyse qualitative

• Combien d’analyte a-t-on? – l’analyse quantitative
• Quelle forme d’analyte a-t-on? – l’analyse structurale
• Où est l’analyte? – l’analyse de distribution ou
l’analyse de surface 3
 L’analyse forensique L’agriculture

Les drogues

2014
L’analyse pharmaceutique
Les domaines

Chimie analytique instrumentale

d’utilisation L’analyse des
productions

L’analyse de L’alimentation
L’alimentation
l’environnement

4
 L’analyse forensique L’agriculture

Les drogues

2014
L’analyse pharmaceutique
Les domaines

Chimie analytique instrumentale

d’utilisation L’analyse des
productions

L’analyse de L’alimentation
L’alimentation
l’environnement

5
Pharmacopées
En Suisse: Pharmacopée européenne + pharmacopée helvétique

Objet: - règlement concernant la définition, la production et le traitement,

l’essai, le stockage, la déclaration, la remise et l’usage des médicaments, des

2014
substances auxiliaires et quelques produits médicaux

Chimie analytique instrumentale

Les monographies traitent les propriétés de/ les demandes à chaque
substance.
 Exigences concernant la propriété, l’identité, la pureté et le taux
 des méthodes analytiques pour les déterminer

6
Pharmacopées
En Suisse: Pharmacopée européenne + pharmacopée helvétique

Objet: - règlement concernant la définition, la production et le traitement,

l’essai, le stockage, la déclaration, la remise et l’usage des médicaments, des

2014
substances auxiliaires et quelques produits médicaux

Chimie analytique instrumentale

Les monographies traitent les propriétés de/ les demandes à chaque
substance.
 Exigences concernant la propriété, l’identité, la pureté et le taux
 des méthodes analytiques pour les déterminer

m e ntales
thode s instru 7
de s m é
uve nt
So
La langue des chimistes analytiques
IR

RMN (NMR) AES

2014
LC

Chimie analytique instrumentale

CCM (DC)
HPLC ESI
MS
UV/vis

8
Ils aiment les abréviations!
Les méthodes spectroscopiques -
introduction
Histoire:
1648 Johannes Marcus Marcis explique l’arc-en-ciel avec la diffraction et la
diffusion de la lumière solaire

2014
1672 Sir Isaac Newton explique la diffraction de la lumière solaire avec le prisme

Chimie analytique instrumentale

1814-1823 Frauenhofer discute les lignes noires dans le spectre solaire –
absorption de la lumière?
9
1859 la loi du rayonnement de Kirchhoff: Liaison d’émission et absorption
Les méthodes spectroscopiques -
introduction
1885 Balmer trouve une formule empirique donnant les longueurs d'onde pour
le spectre de H2

2014
Chimie analytique instrumentale
1900 Plank postule la quantification de l’énergie
1913 Modèle de Bohr

10
 La matière et le rayonnement
électromagnétique
La base de chaque méthode spectroscopique:
L’interaction de la matière à investiguée avec le rayonnement
électromagnétique
Réponse /

2014
système (les atomes, réaction
détecteur
les molécules)

Chimie analytique instrumentale

rayonnement
électromagnétique

La matière et le rayonnement électromagnétique portent l’énergie  À certaines

conditions la matière peut absorber (absorption) ou libérer (émission) le
rayonnement
E2
énergie

émission du
DE=E2-E1=hv excitation rayonnement émission de la
= absorption chaleur 11
du rayonnement
hv E1
Le spectre électromagnétique

2014
Chimie analytique instrumentale
Energie (eV) 10-8 10-6 10-4 10-2 1 102 104 106

trans. trans. fis-

trans. enlé trans.
magn. rot. vib.
magn. électrons vem. noyau sion
noyaux électrons
extérieures e-
Non-
int.
appariés

RMN RPE Micro- IR UV/vis RFA Möß- NAA 12

onde S. AAS/AES/AFS bauer S.
 Le lien entre l’énergie, la  longueur
d'onde et la fréquence

  𝑐   h×𝑐
𝐸=h × 𝑣 𝑣= 𝐸=

2014
 
𝜆 𝜆

Chimie analytique instrumentale

E = énergie mesurée en joule (J)
v = fréquence mesurée en hertz (s-1 = Hz)
c = vitesse de la lumière ( 299 792 458 ms-1);
h = la constante de Planck ( 6,626069×10-34 Js ≈ 4,13567 feVHz-1)
l = longueur d’onde mesurée en mètre (m)

13
 l = 180-800 nm
E = 666-150 kJ mol-1
Spectroscopie UV/vis v = 1.67x1015-3.75x1014 Hz
ṽ = 1/l = 55’226-12’500 cm-1

E2

énergie
DE=E2-E1=hv
M + hv  M* excitation

2014
= absorption
du rayonnement
hv E1

Chimie analytique instrumentale

Base: Excitation des électrons extérieures d’un niveau électronique à un autre

Quels informations?:
- identification d’une substance
- détermination de sa concentration
- détermination de la cinétique d’une transformation

14
 UV/vis - transitions
Diagramme énergétique pour une molécule
diatomique (A-B):
• Excitation des électrons
extérieures d’un niveau

2014
électronique à un autre
État excité

Chimie analytique instrumentale

(électronique)
énergie

Transition visible dans l’UV/vis

État fondamental
(électronique)
Niveaux vibrationnels
Transition visible dans l’IR 15
Niveaux rotationnels

séparation internucléaire
 UV/vis - transitions
Diagramme énergétique pour une molécule
diatomique (A-B):
• Excitation des électrons
extérieures d’un niveau

2014
électronique à un autre
État excité
• MAIS: Également variation des

Chimie analytique instrumentale

(électronique)
énergie

termes Evib et Erot

DV = ±1; DJ = ± 1
Transition visible dans l’UV/vis

État fondamental
(électronique)
Niveaux vibrationnels
Transition visible dans l’IR 16
Niveaux rotationnels

séparation internucléaire
Définition d’absorbance et
transmittance
Transmittance = donne la fraction de la
lumière non absorbée

d
T = I/I0

2014
échantillon

I0 I

Chimie analytique instrumentale

Absorbance = mesure pour la capacité
d’un milieu à absorber la lumière qui le
traverse

d = longueur de la cuve (cm)

I0 = intensité de la lumière incidente A = log10 . I0 /I = log10 . 1/T
I = intensité de la lumière transmise
T = transmittance
A = absorbance A = 0 aucune lumière est absorbée
(I0=I)
17
 La loi de Beer-Lambert
A = e(l) x c x cd = log 1/T
d = longueur de la cuve (cm)
Validité de la loi:
- Solution diluée et de concentration fixe
- e est constante  lumière
monochromatique
- Solution transparente, non fluorescente et

2014
T = transmittance stable
A = absorbance - Pas de réaction avec le solvant
e(l) = coefficient d’extinction molaire

Chimie analytique instrumentale

(L mol-1cm-1)
c = concentration molaire (mol L-1)

Absorbance (A)
Le spectre UV/vis: e(l) = l’absorbance
d’une solution avec la
concentration de 1 mol
A e(lmax)
L-1 et une longueur de la
cuve de 1cm pour la
longueur de l’onde l Concentration (c)
18
 lmax et e (lmax) sont
caractéristiques pour
lmax l une substance
 L’origine des absorptions
Fréquence du rayonnement absorbé est en corrélation avec la structure de la
molécule

s-s*: s-orbitals contient les électrons de la liaison

2014
simple, la différence entre les OM est élevée 
beaucoup d’énergie ~150 nm p.ex. méthane

Chimie analytique instrumentale

n-s*: molécules avec en mois un atome (O,N,S,Cl…)
porteur de doublets électroniques libres (lone pair, n)
 ~150-250 nm p.ex. méthanol

n-p*: molécules avec en mois un atome (O,N,S,Cl…)

porteur de doublets électroniques libres appartenant à
un système insaturé (p*) ~270-290 nm p.ex. éthanal

p-p*: molécules avec une double liaison éthylénique 19

Les orbitals moléculaires et
les transitions électroniques
isolée ~170-290 nm p.ex. éthylene
 L’origine des absorptions
Fréquence du rayonnement absorbé est en corrélation avec la structure de la
molécule

2014
Chimie analytique instrumentale
np* Système conjugué
np*

pp* Système conjugué

pp*

ns*
ss* 20
Les orbitals moléculaires et
les transitions électroniques
Les chromophores
chromophore transition lmax (nm)
Chromophore: groupe responsable de
électrons-s la couleur d’une molécule  qui porte
C C C H
s  s* ~ 150 nm des électrons facilement excités (n ou
lone pair p)

2014
n  s* ~ 185 nm
Auxochrome: groupe responsable de

Chimie analytique instrumentale

O

n  s* ~ 195 nm l’augmentation de la couleur  la

N
fréquence d’absorption est diminuée
n  s* ~ 195 nm
S
 déplacement bathochrome
n  p* ~ 300 nm p.ex.: -OH; -OR; -NH2; -Hal; -SR
C O
p  p* ~ 190 nm (n-orbitales)

n  p* ~ 350 nm
N N

électrons-p
21
C C
p  p* ~ 190 nm
 L’influence sur l’absorption
C C C C C C C C
effet hyperchrome
NH3 NH2 NH2

pp* np* pp* np*

190 nm 230 nm 190 nm 230 nm

2014
déplacement déplacement

Chimie analytique instrumentale

hypsochrome bathochrome

effet hypochrome

dénaturation / effet hyperchrome 

 renaturation / effet hypochrome
Absorption rel. à 260 nm

dénaturation renaturation
22

Température [°C]
 Système conjugué
augmentation de la délocalisation
 diminution de DE pour la transition
pp* DE
 déplacement bathochrome

2014
Chimie analytique instrumentale
éthylène 1,3-butadiène 1,3,5-hexatriène
lmax = 165 nm lmax = 217 nm lmax = 258 nm

l max µ n ® lmax =134 n +31 23

Moyen pour estimer le nombre des
liaisons doubles dans un molécule: n = nombre des liaisons doubles
b-carotène:

2013
Chimie analytique instrumentale
- colorant alimentaire
- antioxydant lmax= 452 nm
- crèmes solaires 
(agent filtrant)
- dépôt pour Vit.A

24
 Le spectromètre UV/vis

lampe à
lampe à filament deutérium
(UV)

2014
de tungstène
(vis)

Chimie analytique instrumentale

photomultiplicateur

fente
miroir référence
d’entrée

échantillon fente réseau 25

de sortie concave
miroirs monochromateur
tournants
 Le spectromètre UV/vis
Erreurs possibles:
- Solvant
lampe à - Cuve
lampe à filament deutérium - Mesure de l’absorbance
(UV)

2014
de tungstène - Mesure de la longueur
(vis) de l’onde

Chimie analytique instrumentale

photomultiplicateur - Température
- Diffusion
- Largeur fente
fente
miroir référence - Pouvoir résolvant
d’entrée

échantillon fente réseau 26

de sortie concave
miroirs monochromateur
tournants
Quelques solvants
Solvant Pas utilisable
sans erreur
au-dessous de
Eau (H2O) 200 nm
Cyclohexane (C6H12) 210 nm

2014
Méthanol (CH3OH) 210 nm

Chimie analytique instrumentale

Ethanol (CH3CH2OH) 210 nm
Hexane (C6H14) 215 nm
Ether diéthylique ((CH3CH2)2O) 215 nm
Dichlorométhane (CH2Cl2) 240 nm
Chloroforme (CHCl3) 250 nm
Tétrachlorométhane (CCl4) 270 nm

lmax peut être dépendant du solvant  sa 27

polarité
Quelques solvants Pour les cas extrêmes, la
molécule change de couleur
Solvant Pas utilisable
sans erreur selon la polarité du solvant 
au-dessous de solvatochromisme
Eau (H2O) 200 nm
Cyclohexane (C6H12) 210 nm

2014
Méthanol (CH3OH) 210 nm

Chimie analytique instrumentale

N
Ethanol (CH3CH2OH) 210 nm
Hexane (C6H14) 215 nm
Ether diéthylique ((CH3CH2)2O) 215 nm O
Dichlorométhane (CH2Cl2) 240 nm
Solvant lmax Polarité
Chloroforme (CHCl3) 250 nm
Tétrachlorométhane (CCl4) 270 nm Anisole 771
Acétone 677
Isopentanole 588 28
lmax peut être dépendant du solvant  sa
polarité Ethanol 550
Méthanol 516
 Spectroscopie dérivée
absorption maximum/minimum point changement
A(l)  

dérivée première passage par zéro maximum/minimum

dA(l)/dl 

Dérivée seconde passage par zéro

2014
d2A(l)/dl2

Chimie analytique instrumentale

Absorption de longueur d'onde de
testostérone et de la dérivée première
de la courbe d'absorption.
29
 Applications pour l’analyse des
médicaments
Avantages: Désavantages:
- Limite de détection basse - Spécificité de substances basse
- Conduite facile

2014
Absorbance spécifique = l’absorbance
A = A1%
1cm x c1% x d1cm et d`une solution avec la concentration de 1

Chimie analytique instrumentale

A1%
1cm = 10 x e/M r
% et une longueur de la cuve de 1cm pour
la longueur de l’onde l (L g-1cm-1)
d = longueur de la cuve (cm)  On la trouve souvent dans les
A = absorbance pharmacopées
A1%1cm = absorbance spécifique (L g-1cm-1)
c = concentration molaire (mol L-1)
Mr = masse moléculaire

30
 Application: Identification
Mesures pour l’identification des principes actifs selon les pharmacopées :
- Maxima d’absorption (lmax)
- Maxima d’absorption (lmax) + absorption (A) dans solutions fixées
- Maxima d’absorption (lmax) + absorption spécifique

2014
- Minima (lmin) et maxima d’absorption (lmax) + absorption spécifique (A1%1cm)
- Ratio entre deux maxima ou maximum et minium dans solutions fixées

Chimie analytique instrumentale

31
 Application: Identification
Mesures pour l’identification des principes actifs selon les pharmacopées :
- Maxima d’absorption (lmax)
- Maxima d’absorption (lmax) + absorption (A) dans solutions fixées
- Maxima d’absorption (lmax) + absorption spécifique

2014
- Minima (lmin) et maxima d’absorption (lmax) + absorption spécifique (A1%1cm)
- Ratio entre deux maxima ou maximum et minium dans solutions fixées

Chimie analytique instrumentale

O

OH
a) Aspirine
lmax = 225 nm
acide O
acétylsalicylique e = 460
O

H
N
b) Paracétamol O
N-(4-hydroxyphényl) HO

éthanamide lmax = 249 nm

e = 880 32
O
c) acide OH lmax = 235 nm
salicylique
OH e = 506
 Application: Pureté
Le spectre d’une substance
contaminée c’est l’addition du
spectre de la substance pure et
du spectre du contaminant

2014
Chimie analytique instrumentale
Mesures pour la pureté des principes actifs selon les pharmacopées :
- absorption spécifique (A1%1cm) à une longueur d’onde spécifique
- Différence de l’absorption de deux longueurs d’onde
- Quotient de l’absorption de deux longueurs d’onde
- Production d’un dérivé pour la détection de la contamination en utilisant le dérivé

33
Application: Pureté
Ex. 1: huile d’olive
native: A(270 nm) < 0.16
Raffiné: A(270 nm) 0.2-1.2 (plus des liaisons doublées)

2014
Chimie analytique instrumentale
34
Application: Pureté
Ex. 1: huile d’olive
native: A(270 nm) < 0.16
Raffiné: A(270 nm) 0.2-1.2 (plus des liaisons doublées)

N N

2014
Ex. 2: Apo-composé atropine
Déshydratation des b-cétol
OH

Chimie analytique instrumentale

(la famille d’atropine) -H2O

O
 déplacement bathochrome à cause de O

l’élongation du chromophore O O

"Apo-composé"

35
 Application: Pureté
Ex. 1: huile d’olive
native: A(270 nm) < 0.16
Raffiné: A(270 nm) 0.2-1.2 (plus des liaisons doublées)

N N

2014
Ex. 2: Apo-composé atropine
Déshydratation des b-cétol
OH

Chimie analytique instrumentale

(la famille d’atropine) -H2O

O
 déplacement bathochrome à cause de O

l’élongation du chromophore O O

"Apo-composé"

OH O
Ex. 3: Phenon-formation
H H
N Oxydation N Oxydation des épinephrines ou des autres
phényle éthanol amine composés
HO adrénaline HO
"Phenon"  déplacement bathochrome à cause de
OH OH
l’élongation du chromophore
36
 Application: Pureté
Ex. 4: Diazotation
Formation des composés azo aromatique comme preuve pour les amines
aromatiques
 déplacement bathochrome à cause de l’élongation du chromophore

2014
NaO2S

Chimie analytique instrumentale

O
N
NH NH2 N
I I hydrolyse I I I I
O diazotation

NaO NaO NaO N

N NH2 N
H
O I O I O I
SO2Na

Sodium amidotrizoate
composés azo aromatique

37
 Application: détermination de la
concentration
1. Mesure de l’absorption Ax de l’analyte (ou de son dérivé) avec la concentration cx
(inconnu)
2. Détermination de la concentration cx:

2014
a) en utilisant la loi de Beer-Lambert
b) en utilisant une solution comparative

Chimie analytique instrumentale

c) en utilisant une courbe d’étalonnage

a) en utilisant la loi de Beer-Lambert si on connait e ou A1%1cm

A = e(l) x c x d
cx = Ax / e x d
A = A1%
1 cm x c x d c%x = A x / A1%
1cm x d 38
 Application: détermination de la
concentration
b) en utilisant une solution comparative si on ne connait pas e ou A1%1cm

Ax = e x cx x d

2014
Ax /Ac = cx /cc cx = cc x Ax / Ac
Ac = e x cc x d

Chimie analytique instrumentale

c) en utilisant une courbe d’étalonnage (le plus exact)

- Pour faire la courbe d’étalonnage on

mesure plusieurs solutions avec une
concentration connue
- Régression linéaire pour déterminer cx
- On voit aussi si la loi de Beer-Lambert est
validée dans la région cherchée 39
Application: détermination de la
concentration d’un mélange (A+B)
A = e (l) x c x d Atot = AA + AB

A(l1) = eA (l1) x cA + eB (l1) x cB

A(l2) = eA (l2) x cA + eB (l2) x cB

2014
- Il faut connaître (ou déterminer):

Chimie analytique instrumentale

eA (l1) , eA (l2) , eB (l1) et eB (l2)

- On mesure A (l1) et A(l2)

- Équations avec 2 variables

Mélange A+B

Substance A 40
Substance B
Application: détermination de la
concentration d’un mélange (A+B)
A (l 2)
cA =
eB(l2) ( A (l1) - eA(l1) )
eA(l2 ) +
eB(l1)

2014
Chimie analytique instrumentale
A (l1)
cB =
eA(l1) ( A (l2) - eB(l2) )
eB(l1) +
eA(l2)

Mélange A+B

Substance A 41
Substance B
Application: Analyse des réactions
Salicylamide
Condition préalable: changement du
system chromophorique pendant
une réaction

2014
Point isosbestique: A et B ont le
même e à cette longueur d’onde

Chimie analytique instrumentale

Point
isosbes.
(hasard)  absorbance est invariante 305 nm
pendant la transformation A B
 Preuve qu’il s’agit d’une
transformation direct sans
intermédiaire(s) et que A et B sont en
équilibre l’un avec l’autre

42
Application: Analyse des réactions
 couplage avec le HPLC
Absorbance à
l1 vs t

2014
Chimie analytique instrumentale
Détecteur
UV

43
 Application: Analyse des réactions
 couplage avec le HPLC

Absorbance à

2014
270 nm
glycosylation

Chimie analytique instrumentale

Vancomycin
 Antibiotique
 une inhibitrice de la
synthèse
du peptidoglycane 
44
de la paroi
bactérienne
 Application: Analyse des réactions
Synthèse de peptides via SPPS:

Agent de

2014
couplage

Chimie analytique instrumentale

Efficacité ???

Détection
via UV

45
Applications: Analyse clinique-
chimique
Examen médical: - le sang / sérum du sang
- la fonctionnalité du foie / du rein

2014
- l’urine
- ….

Chimie analytique instrumentale

 Photométrie  méthode simple

 Détection à cause: - de l’absorption d’epreuve

Bromsulfophatleine
(fonctionnalité du foie détection dans le sérum de
46
sang)
Applications: Analyse clinique-
chimique
Examen médical: - le sang / sérum du sang
- la fonctionnalité du foie / du rein

2014
- l’urine
- ….

Chimie analytique instrumentale

 Photométrie  méthode simple

 Détection à cause: - de l’absorption d’epreuve

- d’une dérivatisation
- d’une réaction enzymatique  méthode de NADH

Bromsulfophatleine
(fonctionnalité du foie détection dans le sérum de
47
sang)
 Applications: Analyse clinique-
chimique
méthode de NADH: utilisée pour - détermination des substances dans le sang,
le sérum ou l’urine

2014
- détermination de l’activité des enzymes

Chimie analytique instrumentale

réduction

oxydation Mesure à 340 nm

48
Applications: Analyse clinique-
chimique

2014
Chimie analytique instrumentale
49
 Applications: Analyse clinique-
chimique
Exemple: détermination d’alcool dans le sang
 l’enzyme alcool déshydrogénase (ADH)

2014
ADH
L’absorption à 340 nm

Chimie analytique instrumentale

CH3CH2OH  CH3CHO + [2 H] est corrélée avec le
NAD+ + [2 H]  NADH + H+ taux d’alcool

Mesure à 340 nm

50
 Applications: Analyse clinique-
chimique
Exemple: détermination de glucose
dans le sérum
 indirecte

2014
hexokinase
Glucose + ATP  glucose-6-phosphate + ADP

Chimie analytique instrumentale

NAD+ + glucose-6-phosphate  NADH + gluconate-6-phosphateH+
déshydrogenase

L’absorption à 340 nm Mesure à 340 nm

est corrélée indirecte
avec le taux de
glucose
51
Applications: Détection de
biomolecules
ADN absorbe dans le UV à lmax = 260 nm

2014
O.D.260 (densité optique) mesure 
Détection d’ADN: ng/µL

Chimie analytique instrumentale

c = 50 µg/mL  A(260nm,1cm) = 1

protéines absorbent dans le UV à lmax = 280

nm
(tryptophane, tyrosine)

O.D.280 (densité optique) mesure 

52
Détection de protéines: µg/µL

c = 1 mg/mlL A(280nm,1cm) = 1
Applications: Détection de
biomolecules

2014
Chimie analytique instrumentale
- En élevant T le nombre de simples brins augmente
-  absorbance à 260 nm augment jusqu’à les brins complémentaires sont
complètement sépares 53
- La température de fusion (ou dénaturation) Tm (melting temperature) est la
température pour laquelle 50 % des molécules d'ADN sont désappariées ou
dénaturées (i.e. sous forme simple brin).
 Applications: Détection de
biomolecules
Acide aminé l maximum ε280 nm(M-1 cm-1)
Tryptophan (W) 280 nm 5690
Tyrosine (Y) 274 nm 1280
disulfide (SS) ~ 280 nm 120

2014
Chimie analytique instrumentale
54

ε280 nm (théorétique) = (nW x 5690 + nY x1280 + nSS x120) M-1 cm-1