Énumération des 1

Microorganismes
Énumération des Microorganismes 2

• Abondance relative
• Mesures de turbidité
• Comptes directs
• Comptes absolus
• Comptes viables
• Nombre absolu des bactéries en croissance
• Nombre le plus probable (NPP)
• Nombre probable de bactéries avec des
caractéristiques données
Mesure de la Turbidité  3

• Mesure la quantité de lumière qui peut

traverser un échantillon
• Le moins de lumière qui traverse
l’échantillon le plus dense est la population
• Mesure la densité optique ou le
pourcentage de transmission
Mesure de la Turbidité 4

• Spectrophotomètre (A600):
• Mesure de la Densité Optique (D.O.)
Lumière

Détecteur…. lecture

600nm

Lecture différente
 D.O.
600nm % Transmission 5
2.0 0

1.0 50

0 100
Densité cellulaire
 6
•Avantages:
• Rapide

• Désavantages:
• Mesure relative
• Ne distingue pas vivant de mort
• Ne distingue pas bactéries de détritus
• Ne distingue pas entre différents types de
microbes
Problème 7

• Deux bouillon de culture possède la même

densité optique. Un bouillon représente un
grand bacille (A) tandis que l’autre est un
petit bacille (B).
• Que pouvez vous conclure?
Comptes Directs 8

• L’échantillon à être énuméré est appliqué à

une lame d’hématimètre qui retient un
volume fixe dans une cellule de comptage
• Le nombre de cellules est compté
• Le nombre de cellules dans le volume donné
est déterminé
Hématimètre 9

• Cette lame possède 2 cellules de

comptages indépendantes
 Déterminer le Compte Direct 10

• Compter le nb de cellules dans 3 carrés

• 8, 8 et 5
• Faire la moyenne
• (8 + 8 + 5)/3 =7
• Donc 7 cellules/carré
 Déterminer le Compte Direct 11

1mm Profondeur: 0.1mm

1mm

• Calculer le volume d’un carré:

= 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml
• Diviser le nb moyen de cellules par le volume
d’un carré
• Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml
 12

• Avantages:
• Rapide
• Culture pas nécessaire
• Aucune info préalable nécessaire

• Désavantages:
• Ne distingue pas vivant de mort
• Difficile de distinguer bactéries de détritus
Problème 13

• Un échantillon est appliqué à une lame

d’hématimètre dont les cellules de comptages
ont les dimensions suivantes: 0.1mm X
0.1mm X 0.02mm et qui possèdent 100
carrés. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont
été faits dans trois carrés indépendants.
• Quel est le volume d’une cellule de comptage?
• Quel est le volume d’un carré?
• Quel est le nombre de cellules par millilitre
dans l’échantillon?
Solution 14

• Volume d’une cellule de comptage?

• 0.01 X 0.01 X 0.002cm = 2 X 10-7cc ou mL
• Volume d’un carré?
• 2 X 10-7mL/100 carrés = 2 X 10-9mL
• Nombre de cellules par millilitre?
• Nb moyen de cellules/carré = 4
• Donc 4 cellules/2 X 10-9mL = 2 X 109
cellules/mL
Problème 15

• Un échantillon qui contient 109 cellules/mL

est appliqué à une lame d’hématimètre
dont les cellules de comptages ont les
dimensions suivantes: 0.1mm X 0.2mm X
0.1mm et qui possèdent 50 carrés.
Combien de cellules en moyennes sont
attendus/carré?
Solution 16

• Volume d’une cellule de comptage?

• 0.01 X 0.02 X 0.01cm = 2 X 10-6cc ou mL
• Volume d’un carré?
• 2 X 10-6mL/50 carrés = 4 X 10-8mL
• Nombre de cellules pour un carré?
• 109 cellules/mL X 4 X 10-8mL = 40 cellules
Comptes Viables 17

• Cellule viable: cellule capable de se diviser et de

générer une population (ou colonie)
• Un compte viable est fait en diluant l’échantillon
original
• Étaler des échantillons des dilutions sur un milieu
de culture approprié
• Incuber sous les conditions appropriées pour
permettre la croissance
• Des colonies sont formées
• Les colonies sont comptées et le nombre original de
cellules viables est déterminé en fonction de la
dilution
Dilutions d’un Échantillon de Bactéries 18
Dilutions d’un Échantillon de Bactéries 19
Dilutions d’un Échantillon de Bactéries 20
Dilutions d’un Échantillon de Bactéries 21
Dilutions d’un Échantillon de Bactéries 22

5672 57 4
Comptes Viables  23

• Le nombre total de cellules viables est

indiqué en tant qu’Unité Formatrice de
Colonie (UFC) plutôt que nombre de cellule
• Chaque colonie est originaire d’une unité
formatrice de colonie (UFC)
• Une plaque avec 30-300 colonies est choisie
• (Nombre de colonies sur la plaque ) ÷ le
volume étalé ÷ la dilution = Nombre d’UFC/mL
• Ex. 57 UFC ÷ 0.1 ÷ 10-5 = 5.7 X 107 UFC/mL
 24
• Avantages:
• Dénombre les microorganismes viables
• Peut distinguer différents microorganismes

• Désavantages:
• Pas de milieu universel
• Nécessite la croissance du microorganisme
• Seulement les cellules vivantes génèrent des
colonies
• Des amas ou des chaînes de cellules génèrent
une seule colonie
Problème 25

• Des bouillons d’E.coli et de Micrococcus

luteus qui contiennent 109 cellules/mL ont
été dilué par 10-6. 0.2mL ont ensuite été
étalé. Combien d’UFC sont attendus dans
chaque cas?
• E.coli: 109 X 10-6 X 0.2mL = 200 UFC
• M. luteus: (tétrad; donc 1 UFC = 4 cellules)
• (109 X 10-6 X 0.2mL)/4 = 50 UFC
Nombre le Plus Probable: NPP 26

• Fondé sur les statistiques de probabilités

• Test présomptif fondé sur des caractéristiques
données
• Technique en bouillon
 Nombre le Plus Probable (NPP) 27

• Commencer avec un bouillon qui permet

de déceler les caractéristiques désirées
• Inoculer differentes dilutions de
l’échantillon à être testé, chacune dans 3
tubes Dilution
-1 -2 -3 -4 -5 -6

3 Tubes/Dilution

1 ml de chaque dilution dans chaque tube

Après une période d’incubation appropriée, enregistrer les TUBES
POSITIFS (qui ont de la CROISSANCE et les caractéristiques désirées)
NPP (Suite) 28

• L’objectif est de DILUER l’organisme à

zero
• Après incubation, le nombre de tubes qui
démontre les caractéristiques désirées
est enregistré
• Exemple de résultats pour une suspension de
1g de terre /10 ml
• Dilutions: -3 -4 -5 -6
• Tubes positifs: 3 2 1 0
• Choisir la bonne suite: 321 et la retrouver dans le
tableau
NPP (Suite) 29

• Combinaison choisie: 321

Tubes Pos.
NPP/g (mL)
0.1 0.01 0.001
3 2 1 150

• Multiplier NPP par le facteur de dilution central

• 150 X 104 = 1.5 X 106 bactéries/mL
• Ou 1.5 X 106 bactéries/0.1g de terre
• Donc 1.5 X 107 bactéries/g
Question 30

• Quelle méthode serait la plus rapide et la

plus précise pour déterminer le nombre de
bactéries dans chacun des cas suivants?
• Nombre de bactéries dans un lac
• Nombre d’E. coli dans 100g de bœuf
• Comparer la densité cellulaire entre deux
cultures de B. subtilis
• Déterminer le nombre d’Escherichia et de
Lactobacillus dans 100mL de lait