Introducere: 1. Ce Este Biotehnologia?

INTRODUCERE
-acum 10.000 de ani - creşterea plantelor agricole şi a animalelor pentru a obţine

mâncare şi haine.
-acum 6.000 de ani - în procesele biologice încep să se utilizeze microorganismele,
pentru diversifica gama de produse alimentare (tipuri diferite de pâine, de brânză), şi
pentru a conserva produsele alimentare pe o perioada mai lungă de timp
-perioada ’60 – ’70 – utilizarea constituientilor celulari în procesele biotehnologice
1. Ce este biotehnologia?
Bio –sugerează utilizarea proceselor biologice;
Tehnologie –sugerează realizarea produşilor prin utilizarea de diferite tehnici
definiţie de ansamblu utilizarea controlată sau deliberată a “agenţilor biologici”
(celule vii sau moarte, sau componente ale acestora) în
cadrul unor operaţii tehnice, sau în cadrul unor procese
tehnologice care duc la obţinerea unui produs finit
domeniu larg de la totalitatea tehnicilor biologice utilizate în agricultură până la
cele utilizate la prepararea mâncării
Federaţia Europeană de Biologie (1978)
Utilizarea integrală a biochimiei, microbiologiei şi ingineriei în scopul
obţinerii unei aplicaţii tehnologice (industriale), cu ajutorul microorganismelor,
culturilor de celule şi a părţilor componente ale acestora
Exemple:
-biotehnologia fermentaţiei, cum este cunoscută astăzi, îşi are originea în introducerea
pentru prima oară în secolul al IX-lea a agenţilor microbiologici în anumite procese
de fermentaţie şi nu în descoperirea vinului sau a verzei acre sau în înţelegerea
proceselor biologice care au loc;
-obţinerea de biomasă din noroiuri active, selecţia şi producerea la scară largă a
microorganismului Clostridia pentru obţinerea de acetonă şi butanol
Aplicaţii în industrie
-producerea de biomasă pentru hrana animalelor;
-a unor compuşi chimici utilizaţi în alimentaţie cum ar fi acidul citric, acidul glutamic,
unii aminoacizi, antibiotice şi vitamine;
-în industria petrochimică, poate fi utilizată în obţinerea în cantitate mare a etanolului,
acetonei, butanolului, acidului acetic etc;
-este utilizată în obţinerea de produşi celulari din plante şi animale, obţinerea de celule
microbiene modificate pentru a produce antigene, anticorpi sau agenţi terapeutici
diverşi;
-furnizează agenţi cheie pentru industria alimentară ca de exemplu culturi de celule şi
enzime care duc la o mai bună înţelegere a proceselor şi tehnicilor specifice acestei
industrii;
-are un rol deosebit în tratarea şi purificarea apelor, şi în volatilizarea substanţelor
reziduale.
Definirea termenului din ce în ce mai greu de realizat
1
Principalele direcţii
de dezvoltare a
biotehnologiilor
moderne sunt
determinate:
-de descoperirile
recente din
domeniul
biologiei
moleculare;
-de cerinţele
care societăţii
aceastafaţă de
anumitecumaspecte
confruntă, ar fi:
crizacu energetică,
epuizarea rezervelorse
de hrană de pe
planetă, probleme
ecologice şi de
bioremediere.
Figura 1. Principalele aplicaţii ale
biotehnologiei
Introducere
Clasificarea diferitelor tipuri de biotehnologii
microbiene
1. în funcţie de tipul de celule cu care se lucrează: vegetale

animale
2. în funcţie de domeniul în care-şi găseşte aplicaţie deosebim următoarele
categorii de biotehnologii:
- industriale, includ obţinerea de produşi farmaceutici, de reactivi de laborator, de
produse alimentare;
- agricole, studiază aspecte privind rezistenţa plantelor la anumiţi factori patogeni
şi a toleranţei faţă de factorii de mediu defavorabili, implicarea în sisteme
simbiotice la diferite specii de plante, multiplicarea speciilor horticole şi
obţinerea de noi hibrizi sexuaţi;
- medical veterinare, se referă în special la nutriţia animală, creşterea rezistenţei
animalelor la atacul agenţilor patogeni, reproducere artificială şi predeterminare a
sexului, conservarea resurselor genetice animale;
- ecologice, sunt incluse toate metodele şi tehnicile de epurare biologică a apelor
uzate sau poluate, a aerului sau a solurilor degradate, extracţia de minereuri cu
ajutorul microorganismelor;
- sănătate publică, crearea unor sisteme de diagnosticare.
2
Introducere
Rolul cercetării fundamentale
satistica globală în viitor cea mai mare parte a industriei va utiliza procedeele de
fermentaţie, inginerie genetică, biologie moleculară ceea ce
imprimă un salt tehnologic covârşitor
natura interdisciplinară etape
1. manipularea genetică a organismului gazdă
- o genă din ADN animal este clonată într-o celulă a unui microorganism.
- se realizează în laborator de către cercetători specializaţi în domeniul
biologiei moleculare geneticii şi biochimie;
- tehnicile utilizate sunt tehnici specifice de biologie moleculară, biochimie,
culturi de celule;
- cercetarea se derulează până când se obţin tulpini recombinante stabile iar
nivelul de expresie este cel dorit
2. cultivare- în vederea stabilirii parametrilor optimi - compoziţia mediului, pH, temperatură,
concentraţia oxigenului dizolvat
- se porneşte de la cultivarea microorganismului la scară mică, în flacoane
de 250 – 1.000 ml, sub agitare;
- performanţele organismului sunt apreciate prin calcularea ratei de creştere,
productivitatea specifică, randamentul de obţinere a produsului finit.
Introducere
3. etapa pilot
-un bioreactor de 1, 2 sau 5 litri echipat cu instrumente de măsurare a parametrilor

ce indică performanţele organismului; pot fi încercate diferite tipuri de
bioreactoare;
-În condiţiile creşterii culturii în bioreactor parametri sunt uşor modificaţi, dar
monitorizarea lor este mai eficientă şi în plus se pot monitoriza parametri care nu
fac obiectul creşterii în flacoane de cultură, ca de exemplu caracteristicile de
spumare ale mediului;
- se identifică limitările impuse de tipul bioreactorului (dacă bioreactorul nu este
aerat celulele mor prin înfometare, dacă agitarea nu este la o viteză optimă celulele
se pot sparge şi astfel creşterea se realizează pe alte căi metabolice);
-se calculează diferiţi parametri cum ar fi: coeficientul de transfer de masă, timpul
de agitare, viteza de dizolvare a oxigenului, puterea de agitare, etc;
-se decide modul de cultivare cel mai avantajos – sistemul „batch” (discontinuu sau
submers) sau sistemul continuu;
- se realizează un calcul economic de fezabilitate.
3
4. ridicarea la scară industrială
- ingineriei bioproceselor;
- bioreactoarele sunt mult mai sofisticate, au un volum mult mai mare 100 –
1.000 l;
- rezultatele pot fi mai bune sau mai scăzute faţă de cele obţinute în faza
pilot; se hotărăşte dacă se trece sau nu la producţia industrială;
- se proiectează întreaga instalaţie industrială de fabricare a produsului finit;
- recuperarea produsului finit din mediul de producţie - izolarea şi purificarea
acestuia până la produsul finit;
- etapă dificilă pentru produsele ADN recombinate;
- costurile reprezintă 80-90% din costul total al procesului tehnologic, deoarece
metodele aplicate în laborator nu pot fi extrapolate la scară industrială;
- filtrări, centrifugări, metode mecanice de distrugere a pereţilor celulari, extracţii
cu solvenţi, metode cromatografice cristalizări, uscări;
- sunt mari consumatoare de energie şi timp.
5. Pregătirea pentru introducerea pe piaţă
-ambalat şi vândut;
-produsele farmaceutice noi - testarea pe animale şi apoi pe om;
-produsele alimentare - teste specifice;
-avize oficiale care sunt în conformitate cu standardele existente pentru fiecare tip de
produs.
Operaţii biotehnologice
Cinci aspecte majore care, în aproape toate instalaţiile industriale corespund
stadiilor de procesare
Microbiologie şi biologie celulară Procese (aspecte)
Sistemică Alegerea culturii
Genetică Cultivarea celulelor
Fiziologie Răspunsul dat de celule

Proces tehnologic
Procesul tehnologic
Chimie Recuperarea produsului
1. Alegerea culturii: selecţia, creşterea sau crearea de organisme sau populaţii

celulare
2. Cultivarea celulelor
3. Răspunsul dat de celulă
4. Procesul tehnologic
5. Recuperarea
produsului
4
CARACTERISTICILE MICROORGANISMELOR
DE INTERES BIOTEHNOLOGIC
De ce microorganismele?
- diversitatea acestora este enormă;
- microorganismele care pot fi utilizate - procariote (bacteriile);
- eucariote (drojdiile şi fungi)
Drojdiile
la producerea alcoolului etilic şi a dioxidului de carbon prin fermentaţie se foloseşte specia
Saccharomyces cerevisiae;
pentru obţinerea vinului se folosesc specii de S. cerevisiae, şi ellipsoideus, fie sub formă de
tulpini selecţionate, fie prin fermentaţie spontană realizată cu drojdii epifite;
la fabricarea berii se folosesc cereale germinate ca orzul în Europa, porumbul în America şi
sorgul în Africa. Cele mai utilizate tulpini sunt S. cerevisiae şi S. uvarum care au fost
selecţionate treptat în diferite laboratoare;
la fabricarea pâinii se utilizează S. cerevisiae, care în timpul dospirii pâinii produce o
fermentaţie alcoolică cu degajare de dioxid de carbon ce permite afânarea aluatului;
proteinele furajere se obţin prin cultivarea drojdiei pe subproduse industriale (alcani, metanol)
şi reziduuri agricole (zer de lapte, melasă). Adăugate în furajele animalelor, proteinele aduc
un aport de aminoacizi.
Fungii
Materii prime :
subproduse ale industriei alimentare şi reziduuri agricole (zer, melasa de la fabricarea
zahărului din sfecla de zahăr, drojdia de la distilării, paiele etc.);
multe specii saprofite, care se dezvoltă pe resturile organice animale şi vegetale desăvârşind
astfel marele ciclu biologic natural.
Aplicaţii
în industria brânzeturilor fungii au un rol important în înmuierea şi aromatizarea pastei,
tulpinile cele mai utilizate sunt: Penicillium roquofortii (brânză cu pastă verde),
Penicillium camembertii şi Geotrichium candidum (pastă presată);
în industria salamurilor folosirea unui strat alb de Penicillium nalgiovense pe suprafaţa
salamurilor previne dezvoltarea microorganismelor care degradează produsul;
hidroliza amidonului din orez care precede fermentaţia se realizează cu amilaze biosintetice de
Aspergillus oryzae.
în industria chimică şi farmaceutică prin biosinteză se produc:
Enzime – proteaze, amilaze cu tulpini din genul Aspergillus;
acizi organici - acid citric cu Aspergillus niger;
antibiotice - penicilina cu tulpina Penicillium chrysogenum, cefalosporinele cu tulpini din
genul Cephalosporium;
hormoni;
biomasă în scopul obţinerii unei surse complementare de proteine pentru furaje animale.
5
Bacterii
Bacteriile acetice (Gluconobacter, Acetobacter)
- fabricarea tradiţională a oţetului de vin, cidru, cartofi;
-obţinerea de vitamină C (oxidarea sorbitolului la sorboză)
Bacteriile lactice (Lactobacillus, Lactococus, Treptococcus)
-fermentează produsele lactate (iaurt, brânză dulce). Ele sunt prezente în mod obişnuit
- în lapte şi au rolul de acidifia laptele (transformă lactoza în acid lactic);
- în prepararea brânzeturilor participă la formarea cheagului şi la maturarea lui;
- conferă untului gustul şi aroma specifice, prin producerea de acid diacetic;
-producerea de acid lactic la scară industrială
Bacteriile butirice (Clostridium butyricum)
-intervin în înmuierea inului şi a cânepii deoarece distrug pectina şi astfel eliberează
fibrele textile
Genul Bacillus
- Baccilul thuringiensis – în timpul sporulării produce substanţe toxice care sunt toxice
pentru larve;
- producerea de enzime: proteaze termostabile pentru ind. detergenţilor, -
amilaze, glucozo izomerază
Actinomicetele
Bacteriile din genul Corynebacterium şi Brevibacterium şi mutantele derivate
Bacteriile metilotrofe cultivate pe metan sau metanol
Propionibacterium
Bacteriile termofile metanogene
Căile de biosinteză a constituienţilor celulari ai microorganismelor

creşterea microbiană
Etape:
- faza de creştere logaritmică;

- faza staţionară;
- faza de declin
Figura 2. Diferenţa dintre metabolismul primar şi secundar: a – creşterea celulelor şi biosinteza

constituienţilor are loc aproape simultan; b- după creşterea celulelor şi eliberarea metabolitului primar acesta
se transformă în metabolit secundar; c- substratul de creştere rămas după finalizarea creşterii celulelor este
transformat în metabolit secundar
6
Metaboliţii microbieni primari
Procesul microbian tipic în care în timpul fazei de creştere exponenţială (perioada
de lag) se formează un metabolit primar se numeşte fermentaţie alcoolică
Exemplu:
etanolul este metabolitul primar produs în fermentaţia alcoolică aerobă a drojdiilor
sau a unor bacterii în acelaşi timp reprezentând şi un metabolit energetic
Figura 3. Cinetica procesului de fermentaţie în timpul formării (a) metaboliţilor primari şi

(b) a metaboliţilor secundari
Metaboliţii microbieni secundari
Metaboliţii care se formează în timpul fazei staţionare (de creştere sau trofofaza) sau
la finalul acesteia se numesc metaboliţi secundari
Caracteristici:
• sunt sintetizaţi de un număr mic de microorganisme;

• nu sunt importanţi pentru creşterea şi dezvoltarea microorganismului;
• pentru sinteza lor necesită prezenţa unui număr mare de reacţii enzimatice;
• formarea lor este dependentă de condiţiile de creştere şi de compoziţia mediului;
• se prezintă sub forma unui amestec de compuşi cu structură chimică înrudită;
• de obicei se obţin în cantitate mult mai mare decât metaboliţii primari .
Etape de obţinere:
• trofofaza - este faza de creştere (prefixul „trofo” în limba greacă înseamnă
„creştere”);
• idiofaza – este faza în care se sintetizează metabolitul (prefixul „idio” în limba
greacă înseamnă „ceva propriu”);
7
Interrelaţia dintre căile de biosinteză ale metabolitului primar (diferiţi
acizi organici şi aminoacizi) şi a metaboliţilor secundari (o serie de
antibiotice)
Figura 4. Relaţia
dintre calea
metabolică de
obţinere a
aminoacizilor şi a
unor acizi
organici şi
formarea unor
antibiotice cu
nucleu aromatic
Biosinteza şi creşterea
Figura 5. Prezentarea sintetică a principalelor căi anabolice şi catabolice. Sunt prezentate într-o
versiune simplificată numai căile majore de biosinteză şi conexiunile acestora cu căile catabolice
8
Controlul metabolismului
Necesarul de nutrienţi
Majoritatea nutrienţilor, cu excepţia oxigenului şi a câtorva surse de carbon, sunt
preluate din mediul de cultură prin sisteme de transport specifice. Aceste procese pot
fi controlate deoarece o dată ce celula şi-a luat nutrientul în cantitatea necesară restul
de nutrient poate fi îndepărtat sau direcţionat pe o altă cale astfel încât să nu fie în
detrimentul celulei. Aceste sisteme de transport active necesită un aport de energie.
Compartimentarea
reprezintă a doua formă de control metabolic
exemple:
- mitocondria celulelor eucariote care separă reacţiile ciclului acizilor tricarboxilici de
alte reacţii din citoplasmă;
- în peroxizomi se găsesc enzime care degradează acizii graşi şi care sunt separate de
enzimele din citoplasmă care determină sinteza acizilor graşi. Separarea celor două
seturi de enzime previne reciclarea oricărui intermediar comun;
- alte organite (vacuole, nucleu, cloroplaste etc.) controlează în mod similar alte reacţii
care au loc în celulă.
9
Figura 6. β-Oxidarea acizilor graşi
Controlul sintezei enzimatice

Multe dintre enzime sunt prezente în celulă indiferent de condiţiile de creştere ale
acesteia. O parte din enzime „apar” atunci când este necesar cum ar fi de exemplu
izocitrat liaza din şuntul glioxilatului care apare numai atunci când celulele sunt
crescute pe un substrat C2. Acest proces este denumit „inducerea” sintezei enzimei.
Figura 7. Ciclul glioxilatului.
10
Unele enzime pot să „dispară” atunci când nu mai sunt necesare. De
exemplu enzimele din calea de biosinteză a histidinei încetează a mai fi produse
atunci când concentraţia de histidină din celulă este suficientă pentru a satisface
necesităţile celulei. Acest proces este numit represie. Astfel într-o celulă există un
permanent echilibru între procesele de inducţie şi represie a anumitor enzime cheie,
în funcţie de necesităţile celulei.
În sistemul de cultivare în suspensie
(„batch”) celulele se multiplică într-un
sistem închis până când se termină unii din nutrienţi
sau până când unii produşi acumulaţi determină
efecte inhibitorii asupra unor enzime reglatoare sau,
numărul de celule formate au ocupat întreg spaţiul
de cultivare şi astfel noile celule nu mai au spaţiu să
crească. În momentul în care în timpul creşterii
celulare unele din componentele celulare se
modifică sau unii compuşi moleculari se consumă,
celula îşi modifică forma – se alungeşte.
Figura 8. Reprezentarea schematică a schimbărilor

ideale în mărimea celulei (cell weight), numărul de celule,
masa totală uscată şi compoziţia chimică în timpul creşterii
unei bacterii în sistemul de cultivare submers. În stânga este
scală logaritmică
Controlul sintezei enzimatice
Eficienţa globală de creştere microbiană este discutată în

termeni termodinamici. Empiric, este în mod uzual exprimată în termeni de:
producţia de celule formate pornind de la o unitate masică de substrat de carbon
consumat.
producţia molară de creştere (Ys) este producţia de celule per mol de
substrat, coeficientul de conversie a carbonului care permite o mai uşoară
comparare între numărul de moli de substratele diferite, este producţia de celule
per gram de substrat de carbon.
ATENŢIE! valoare scăzută a producţiei de creştere atunci

când organismele sunt transferate din sistemul de cultivare aerob în cel
anaerob, fenomen care evident este direct legat de reducerea fluxului
energetic şi astfel o producţie scăzută de ATP.
11
Substrat Organism Producţia molară de Coeficientul de conversie
Tabelul creştere (g organism al carbonului (g organism
uscat/g-mol substrat) uscat/g carbon din substrat)
metan Methylomonas 17,5 1,46

3. Randamentul methanooxidans
de creştere a unor metanol Methylomonas methanolica 16,6 1,38
microorganisme
crescute
pe diferite
substrate
etanol Candida utilis 31,2 1,30
glicerol Klebsiella pneumoniae 50,4 1,40
(Aerobacter aerogenes)
glucoză Escherichia coli:
aerob 95,0 1,32
anaerob 25,8 0,36
Saccharomyces cerevisiae:
aerob 90,0 1,25
anaerob 21,0 0,29
Penicillium chrysogenum 81 1,13
sucroză Kelbsiella pneumoniae (A. 173 1,20
aerogenes)
xiloză Kelbsiella pneumoniae (A. 52,2 0,87

aerogenes)
acid Pseudomonas sp. 23,5 0,98

acetic Candida utilis 21,6 0,90
hexadec Saccharomycopsis
an (Candida) lipolytica 203 1,06
Acinetobacter sp 251 1,31
Randamentul de creştere a celulelor depinde de următorii factori:
1. natura sursei de carbon;

2. calea catabolică pe care o urmează substratul;
3. proviziile de substrate complexe (îndeosebi unele căi anabolice);
4. necesarul de energie pentru asimilarea nutrienţilor în special al
azotului (se administrează mai puţin azot dacă se administrează aminoacizi şi
mai mult azot dacă sursa este reprezentată de ionii nitrat);
5. variaţia eficienţei reacţiilor generatoare de atp;
6. substanţele inhibitoare, contrabalansarea echilibrului ionic, sau alte
componente ale mediului care interacţionează cu sistemul de transport;
7. statusul fiziologic al organismului – aproape toate microorganismele

îşi modifică mecanismele de creştere în funcţie de condiţiile mediului de
cultură (ca de exemplu formarea sporilor).
8. natura substratelor care limitează creşterea – cea mai eficientă este

sursa de carbon care limitează creşterea , deoarece catabolizarea excesului de
carbon poate urma anumite căi metabolice care sunt din punct de vedere
energetic utile biotehnologului deoarece opresc creşterea;
9. viteză de creştere prestabilită;
10. înclinaţia microbilor de a creşte şi competenţa microbiologului.
12
BIOREACTOARE
Introducere
 Procesul de bază în
biotehnologie este
„procesul
biologic”, şi se
realizează în
bioreactor
 “bioingineria” - se ocupă cu studiul bioproceselor din punctul de vedere al

unui biolog, al unui chimist fizician şi al unui inginer
Bioreactorul - instalaţie tehnologică în interiorul căreia are loc transformarea
materiilor prime cu ajutorul sistemului enzimatic pus la dispoziţie de microorganismele
vii, celulele animale şi vegetale, sau de enzimele izolate din acestea.
CONDIŢIILE CREATE ÎN BIOREACTOR PENTRU CREŞTEREA
ORGANISMELOR
Randamentul cu care procesul biotehnologic are lor
Pe măsură ce celulele cresc ele se adaptează noilor condiţii de creştere şi-şi modulează
activitatea în funcţie de condiţiile de mediu.
Avantaj: monitorizarea permanentă a parametrilor creşterii
Materii prime Etapa de Etapa de Etapa de

prelucrare prelucrare prelucrare
fizică biochimică
fizico-
chimică Produs
• pregătirea mediului • biosinteza • separarea
produsului de cultură, propriu-zisă principal,

• sterilizarea utilajelor, • monitorizarea • concentrarea,
• sterilizarea aerului parametrilor • pregătirea pentru
introducerea pe
piaţă
Figura 9. Reprezentarea schematică a unui proces biotehnologic
Modelul similitudinii
Etapa pilot Etapa industrială
Criterii care permit calcularea mărimilor fizice ale sistemului

la scară mare, pe baza rezultatelor obţinute în etapa pilot
- tipul de organism;
În funcţie de: - sistemul de cultivare;
Alegerea bioreactorului - caracteristicile biochimice ale
întregului proces
13
Sisteme de cultivare a microorganismelor
2 sisteme majore: - sistem submers
- culturi de suprafaţă
În sistem submers
mediul de cultură este lichid, agitat şi
aerat
alimentarea cu energie se realizează continuu în scopul menţinerii
interfaţei gaz – lichid
trei moduri de operare: discontinuu,
semicontinuu şi continuu
Operarea în sistem discontinuu
Cultivarea - în şarje (sistemul batch); începe
la t = 0 şi se termină la t = t’;
la început, creşterea celulelor are loc în condiţii nelimitate; în timp se atinge densitatea
maximă; începe creşterea în condiţii limitate de substrat şi acumularea
produsului final.
se notează DC şi este reprezentată grafic
astfel:
caracteristică - sistem de agitare performant  omogenitatea ; uniformitatea

tuturor parametrilor

Operarea în sistem semicontinuu
reactorul este construit astfel încât concentraţia sustratului limitativ să fie
păstrată constantă prin aprovizionarea continuă („fed batch”)
se notează SC şi se reprezintă grafic
astfel:
Operarea în sistem continuu
reactorul este construit astfel încât să se realizeze o aprovizionarea continuă
cu nutrienţi şi o evacuare permanentă a unei cantităţi echivalente de mediu de
cultură
două tipuri de bioreactoare ideale:
Figura 10. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor tip R (cu recirculare) şi tip D (cu
deplasare)
14
Figura 11. Prezentarea sistemelor de operare continuă. S – substrat, C – celule
Bioreactoarele submerse pot fi:

- cu agitare mecanică,
- cu convecţie forţată (cu pompă de recirculare a lichidului),
- cu aer comprimat.
Culturi de suprafaţă
- au fost primele sisteme de fermentaţie folosite;

- mediul de cultură este solid, semisolid sau este reprezentat de starturi
lichide aflate în repaus;
- în sisteme omogene – compoziţia mediului de fermentaţie este uniformă în
orice colţ al bioreactorului, în orice moment;
- în sisteme heterogene – gradiente de celule sau substrat; microorganismele
sunt expuse la diferite cond. de mediu;
- nu depind de sistemul exterior decât în mică măsură;
- sunt utilizate mai mult în laboratoar pentru întreţinerea culturilor, decât

industrial pentru biosinteză.
15
microorganismele se dezvoltă la atât la suprafaţă cât şi în interiorul

mediului de cultură. În mediul nutritiv la care s-a adăugat un agent
gelifiant şi s-a usucat la 45 – 500C, se inoculează microorganismul
la temperatura ambiantă. Coloniile formate după incubare permit
selecţia microorganismelor dorite. Condiţiile de cultivare pot fi
stabilite prin schimbarea compoziţiei mediului. Aerarea se
realizează prin aprovizionarea cu aer steril. De obicei se lucrează în
incubatoare cu CO2.
tipuri de bioreactoare : cu tăvi,

tip coloană cu umplutură,
în strat fluidizat şi cu strat fix
Configuraţia bioreactoarelor
Aspecte care trebuiesc urmărite la alegerea bioreactorului
 configuraţia biorectorului;
 mărimea bioreactorului;
 condiţiile bioprocesului din interiorul bioreactorului;
 sistem de operare utilizat (sistem submers/de

suprafaţă; continuu/discontinuu);
 cuplare/necuplare în serie cu alte bioreactoare.
În funcţie de natura procesului biotehnologic

 bioreactoare biologice - un proces de fermentaţie (cu biomasă);
- pot fi: pentru fermentaţii anaerobe,
aerobe;
 bioreactoare biochimice - procesele enzimatice.
- Pot fi: cu enzime libere,
cu enzime imobilizate şi
cu fază solidă
16
Configuraţia bioreactoarelor
Au forme constructive şi moduri de operare variate, funcţie de tipul procesului tehnologic
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Clasificare:
după modul de introducere a energiei necesare

amestecării fazei lichide (substrat şi microorganisme) şi
dispersării fazei gazoase (aer):
- cu amestecare mecanică;
- cu pompă de recirculare;
- cu aer comprimat
Figura 12. Bioreactoare cu agitare mecanică.

(a) cu motorul aşezat la baza vasului; (b) cu
motorul la baza vasului şi cu draft interior; (c)
bioreactor cu agitator cu turaţie mare
17
Figura 13. Bioreactoare

cu agitare mecanică cu
barbotare cu aer (prin
axul agitatorului sau
separat).
(a,b) cu
barbotare prin axul
agitatorului; (c) cu
barbotator separat cu
agitare pe sus; (d) cu tub
de aspiraţie a aerului.
Figura 14.
Bioreactor cu Figura 15. Bioreactor cu pompă de recirculare a fazei lichide.
agitare la (a) cu recirculare externă; (b) cu buclă de recirculare; (c) cu
mai multe recirculare cu jet; (d) cu recirculare internă, inversată
nivele
18
Figura 16.
Bioreactoare cu aer
comprimat. (a)
bioreactor tip
coloană cu bule; (b)
bioreactor tip turn cu
site perforate; (c)
bioreactor tip „air –
lift”; (d) bioreactor
tip “air lift” cu
coloană cu bule
Figura 17. Bioreactoare

biochimice.
(a) în sistem discontinuu,
cu enzime libere;
(b)în sistem continuu, cu
enzime libere;
(c) în pat fluidizat (cu
enzime libere;
(d)cu enzime imobilizate
pe suport
19
Figura 18.
Alte tipuri
constructive de
bioreactoare.
(a) cu film
lichid; (b)
pentru culturi
de suprafaţă
Bioreactoare cu agitare mecanică
Figura 19. Bioreactor cu

agitare tip pentru culturi
aerobe
20
Figura 20. Tipurile de

rotoare utilizate la
realizarea agitatoarelor
pentru amestecarea
mediului de cultură din
bioreactor. (a) ancoră,
(b) elice, (c) turbină cu
palete plane, (d) cu
palete tip zbatură, (e)
ancoră complexă, (f)
şurub elicoidal
Caracteristicile bioreactorului:
 Amestecarea şi dispersia bulelor de aer – agitare mecanică;

 Omogenizarea mediului – şicane;
 Degajarea bulelor de aer – spărgător de spumă;
 Transferul de căldură – prin agitare şi turbulenţă,
o în timpul sterilizării (când se realizează în bioreactor),
o în timpul fermentaţiei (sterilizarea se realizează în alt vas);
 Preluarea căldurii de reacţie degajată în timpul fermentaţiei
-sistem de răcire, cel mai des cu serpentine; dezavantaj – greu
de spălat şi sterilizat, incomodează sistemul de agitare;
- sistem de răcire cu schimbător de căldură exterior
Utilizare
- celule libere sau imobilizate şi

- reacţii enzimatice cu enzime libere sau imobilizate
21
Bioreactoare entru fermentaţii aerobe
pBioreactoare cu agitare mecanică
şi cu draft interior
creşte coeficientul de transfer de masă
circulaţia lichidului este modificată prin

introducerea unui cilindru metalic axial
fără fund şi capac numit „draft”
Figura 23. Circulaţia lichidului într-un

bioreactor cu draft. (a) complet imersat în
lichidul de cultură, (b) cu revărsare
(adaptat după Keitel, 1978)
Bioreactoare cu aer comprimat

Bioreactoare tip „coloană cu bule”.
variantă a bioreactoarelor cu agitare mecanică
agitarea mediului de cultură se realizează

exclusiv prin barbotare de aer
Caracteristicile hidrodinamice şi transferul

de masă depind în totalitate de
comportamentul bulelor eliberate de
barbotor
utilizată în industria drojdii de bere, în

industria berii, a vinului şi în tratarea
apelor reziduale
F
i
g
u
r
a
2
4
. 22
Sistem omogen - bulele urcă cu aceeaşi

viteză şi nu se amestecă între ele, iar
agitarea lichidului este limitată,
Sistem eterogen - viteza de barbotare

este mai mare; circulaţie haotică a
celulelor; bulele şi lichidul tind să se
ridice prin centrul coloanei, curentul de
lichid coboară pe lângă pereţii
bioreactorului, antrenează bulele, 
amestecarea aerului cu mediul de
cultură.
avantaj - cost de construcţie mic,

transfer de masă şi căldură satisfăcător
probleme - de spumare a mediului Figura 25. Circulaţia fluidului într-o coloană
cu bule aflată în regim eterogen
Pentru îmbunătăţirea caracteristicilor de curgere şi amestecare se

construiesc bioreactoare tip coloană cu bule în mai multe trepte.
Astfel întâlnim:
- coloane cu bule divizate în câteva secţiuni prin site perforate şi
- coloane cu bule care sunt prevăzute cu agitatoare locale.
Introducerea sitei perforate sau a agitării locale reduce intensitatea
amestecării axiale a lichidului şi creşte coeficientul de transfer de
masă.
Datorită varietăţii mari de configuraţii de bioreactoare tip
coloană cu bule (diametrul găurilor, secţiunea transversală liberă,
numărul de site perforate, varietatea compoziţiei mediului) nu s-au
elaborat relaţii generale de calcul şi control a parametrilor.
23
Bioreactoare “air lift”
 formă de turnuri cu buclă;

o „air lift” cu circulaţie internă
o „air lift” cu circulaţie externă
 circulaţia lichidului se datorează

diferenţei de densitate a fazei aerate din
turn şi a zonelor nearerate;
utilizate  culturi de celule vegetale,

 culturi de celule animale,
 culturi de celule imobilizate
 biosinteza proteinelor microbiene
 tratamentul biologic al nămolurilor
Figura 26. Configuraţia bioreactoarelor „air lift”
24
Bioreactoare cu membrană de dializă
Motivaţii:  membranele de dializă sunt un mijloc eficient de îndepărtare
continuă a inhibitorilor sau a produşilor toxici rezultaţi în timpul
fermentaţiei
 alimentarea cu substrat a culturii microbiane se realizează prin membrană
 se pot obţine concentraţii mari de microorganisme, deoarece substratul este
separat de microorganism şi nu poate exercita efecte inhibitorii
Utilizare:  cultivarea sistemelor de două sau mai multe tipuri de microorganisme
 cultivarea celulelor umane
Modele:
Primul tip două vase între care schimbul de substrat sau produs se realizează prin
pomparea conţinutului printr-un modul de dializă situat între cele
două vase.
dezavantaje – sterilizarea sistemului (sistem multi-component);
- suspensia fermentată este pompată prin by-pas
Figura 28. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor cu membrană de dializă
25
Al doilea tip
două tuburi flexibile care sunt fixate în interiorul bioreactorului de oţel, de fund şi
de capac. Tubul mare, care formează peretele fermentatorului, este confecţionat din
folie de poliamidă cu o grosime a porilor de 80μm, în timp ce tubul mic formează
un cilindru în interiorul bioreactorului. Tubul mic este o membrană de dializă a
căror pori au dimensiunea de 20μm. Bioreactorul este echipat cu două unităţi de
agitare cu motoare separate ceea ce face ca turaţia motorului să poată fi controlată
separat. Aeraţia se poate realiza în ambele incinte în acelaşi timp. Fermentatorul
poate fi sterilizat in situ ca un fermentator obişnuit, la 1210C, în timpul sterilizării
pereţii din folie de poiamidă putând fi protejaţi de o manta din cilindri de oţel.
Figura 29. Bioreactor cu dializă
26
Bioreactoare cu tăvi
Aplicaţiile sunt limitate la microorganismele care se dezvoltă la suprafaţă şi

formează peliculă
În industrie s-au construit bioreactoare cu mai multe tăvi, aşezate una deasupra
celeilalte, astfel încât sterilizarea şi inocularea să poată fi efectuate automat. În
interior se introduce aer steril. Bioreactorul este exploatat în regim discontinuu.
O variantă a acestui tip de bioreactor a fost descrisă de Kybal şi Vlcek (1976)

care au propus utilizarea unor perne gonflabile de plastic, care pot fi umplute
cu mediu nutritiv, inoculate şi aerate prin tubul de fixare.
Bioreactoare cu tăvi
Figura 30. Bioreactor cu

tăvi, sterilizabil, cu
răcire, cu alimentare prin
partea superioară
27
Bioreactoare tip coloană cu umplutură
O coloană verticală, umplută cu granule de biocatalizator sau cu biocatalizator
imobilizat.
Alimentarea cu mediu se face prin partea de sus - se formează o fază de lichid
continuă printre particule. Datorită frecării particulelor, deteriorarea celulelor, este
minimă comparativ cu bioreactoarele cu agitare.
Transferul de masă dintre faza lichidă şi catalizatorul solid se realizează relativ uşor
dacă viteza de trecere a acestuia prin coloană este mare, iar pentru a fi îmbunătăţit
mediul lichid este recirculat.
Aerarea mediului este bine să fie realizată separat. Dacă aerul este barbotat direct se
produce coalescenţa bulelor, apar canale prin umplutură şi distribuţia nu este
uniformă. Din acelaşi motiv, bioreactoarele cu umplutură nu sunt potrivite pentru
bioprocesele din care rezultă CO2 sau alte gaze. De obicei, aerul circulă în
contracurent cu lichidul pentru a intensifica înlăturarea căldurii degajate în timpul
fermentaţiei sau a reacţiei enzimatice.
Când se lucrează cu microorganisme acestea formează un „film biologic” în jurul

particulelor de umplutură.
Bioreactoarele cu umplutură se utilizează şi în cazul enzimelor sau celulelor

imobilizate.
Figura 31. Bioreactor tip coloană cu umplutură cu recirculare a mediului
28
Bioreactoare în strat fluidizat
Când bioreactorul cu umplutură este operat cu stratul în suspensie, atunci el se

numeşte „strat fluidizat”.
pentru prima oară, a fost descris de Moebus în 1981, şi a fost folosit la

fermentaţia glucozei la etanol folosind un strat fluidizat format din granule de
drojdie.
Gazul de fluidizare păstrează în acelaşi timp granulele în mişcare şi le usucă.

Aerul este introdus pe la partea inferioară a bioreactorului şi menţine în
suspensie cultura de celule sau enzime imobilizate. Uneori se foloseşte nisip
sau un alt material care se amestecă cu celulele microbiene.
Procedeul este uneori folosit cu microorganisme floculate, în fabricarea berii

şi a oţetului.
Bioreactoare în strat fluidizat
Figura 32.
Bioreactor în pat
fluidizat
29
Bioreactoare cu strat fix
Reprezintă o variantă a bioreactoarelor cu umplutură, deosebirea constând în

introducerea şi distribuirea mediului lichid prin partea superioară a bioreactorului
lichidul circulă în jos cu viteză mică, scurgându-se pe particulele de umplutură.

Acest tip de bioreactor este mult mai utilizat în tratamentelor apelor reziduale,
când configuraţia bioreactorului se modifică prin introducerea unor „biofiltre”
(figura ).
Aerul pătrunde prin ferestrele de la partea inferioară a bioreactorului, se
ridică prin convecţie naturală şi alimentează cultura de microorganisme cu
oxigen.
Dezavantaje: utilizarea volumului reactorului în scopul creării unei
interfeţe cât mai mari; repartizarea uniformă a lichidului peste umplutură pentru
ca întreaga suprafaţă de lichid să lucreze uniform.
Figura 33. Bioreactor cu flux fix
30
Figura 34. Biofiltru utilizat la purificarea apelor reziduale
Bioreactoare cu enzime imobilizate

avantaje la transformarea substanţelor în cataliză eterogenă :
• permite utilizarea repetată a enzimei;

• permite lucrul în instalaţii semicontinue şi continue (volumul mic
ocupat de instalaţie permite automatizarea proceselor);
• se elimină faza de inactivare termică deoarece enzima nu se regăseşte
amestecată cu produsul;
• se pot trata soluţii diluate de substrat (ape reziduale, subproduse);
• scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse;
•nu se formează produşi secundari.
31
Avantaje faţă de procesul de transformare a substratului cu ajutorul
microorganismelor:
• se elimină faza de inactivare termică
• se pot trata soluţii diluate de substrat
•Scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse
• nu se formează produţi secundari
• în procesul de transformare se utilizează întreaga cantitate de substrat (în cazul
proceselor fermentative 1% din cantitatea de substrat este utilizată la
dezvoltarea microorganismelor);
• datorită existenţei unei singure enzime există posibilitatea efectuării unei
singure reacţii enzimatice specifice (în cazul proceselor fermentative
microorganismele produc un complex de enzime care pot duce la transformări
secundare);
• costurile sunt reduse deoarece este eliminată faza de cultivare a
microorganismelor.
tehnici de imobilizare a enzimelor:
Procedee fizice: Procedee chimice:
- adsobţia pe suporturi solide; - reticularea intramoleculară;
- includerea în structuri macromoleculare; - legarea covalentă pe suporturi
- microîncapsularea; insolubile reactive
Cantitatea de enzimă care se cuplează la suport variază de la 1mg – 1g

proteină/g preparat imobilizat
Reactivitatea preparatelor imobilizate este influenţată de următorii factori:

• granulometria –;
• masa moleculară a substratului –
• pH mediului de reacţie –
• stabilitatea preparatelor enzimatice imobilizate -
Bioreactoarele conţinând preparate enzimatice imobilizate se clasifică în:
• Discontinue cu agitare;
• Continue cu agitare;
• Continue de tip coloană;
• Continue în pat fluidizat
Alegerea tipului de bioreactor depinde de caracteristicile fizice ale

preparatului imobilizat, de capacitatea de producţie a instalaţiei şi de natura
substratului ce trebuie transformat.
32
ETAPE PRELIMINARE ÎNTR-UN
PROCES BIOTEHNOLOGIC
reprezintă totalitatea paşilor necesari în vederea recuperării produsului final
în orice tip de industrie
Ex.: procesul de fermentatie clasic
La sfârşitul fermentaţiei
- separarea fazei solide (de obicei celule, dar şi celule împreună cu enzime pe un
anumit tip de suport, sau componente ale mediului de cultură) de cea lichidă care
în 90% din cazuri este apoasă.
Tabelul 4. Proprietăţile celulelor cu referire la procesul de separare

Proprietăţi Bacterii Drojdii Fungi
formă baghete, sfere, sfere, elipsoidice, filamente

catene filamente
mărime 0.5μm – 3 μm 1 – 50 μm 5 –15 μm diametru

50 – 500 μm
lungime
greutate 1,05 –1,1 1,05 – 1,1 1,05 – 1.1

specifică
greutatea 10-12 g 10-11 g -
celulei
Principiul de Metoda de separare Mărimea

Introducere separare particulelor (μm)
mărimea Filtrarea pe fibre >200 – 10

particulelor Microfiltrarea 20 – 0,5
Mărimea Ultrafiltrare 2 – 0,005

moleculei Hiperfiltrare 0,008 – 0,00025
Gel cromatografie 2 – 0,0003
Dializă 0,002 – 0,00025
Tabelul 5.
Clasificarea metodelor Temperatură Cristalizare <0,002
de separare
Solubilitate Adsorbţie <0,002
Extracţie <0,002
Sarcina Electroforeză 2 –0,02

electrică Electrodializă 0,02 – 0,00025
Cromatografie de schimb 0,02 – 0,00025
ionic
Densitate Sedimentare >1000

Decantare 1000 – 5
Centrifugare 1000 – 0,5
ultracentrifugare 2 – 0,02
33
Filtrarea
utilizată pentru separarea filamentelor de fungi şi bacteriilor filamentoase
În acord cu mecanismul de filtrare avem:
 filtrare de suprafaţă,
 filtrare de adâncime şi
 filtrare prin centrifugare;
în toate cazurile se foloseşte vacuum sau suprapresiune.
Rata de filtrare –
Rezistenţa filtrelor –
Tipuri de filtre:
simple, plate,
ansamblu de filtre
Utilizarea
adjuvanţilor:
mod de lucru:
adjuvantul se aplică în strat subţire pe materialul filtrant;
adjuvantul se amestecă cu suspensia de filtrat;
raclarea permanentă a stratului de adjuvant cu ajutorul
unor cuţite
speciale
variantă - filtrarea sterilizantă.

prefiltrare grosieră,
filtrarea sterilizantă propriu-zisă.
se montează în filtru plăci din acetat de celuloză,
azbest sau polimeri sintetici cu diametru redus al porilor,
Avantaj: temp. scăzută, consum mic de energie, integrarea
filtrării cu spălarea, îndepărtarea parţială a apei
Dezavantaj: contaminarea cu aer
Cel mai adesea pentru separarea microorganismelor de bulionul

de fermentaţie se utilizează o baterie de filtre rotative menţinute sub
presiunea exercitată din interiorul reactorului – presiune constantă
Filtrele sub formă de centură - potrivite pentru precipitatele deja

filtrate şi care necesită o spălare mai îndelungată. Dacă acest tip de filtrare
se realizează într-o presă îndepărtarea apei se va realiza mai rapid.
34
Filtrarea
Figura 34. Reprezentarea schematică a filtru rotativ menţinut sub vacuum
Filtrarea pe membrane
metodă versatilă - utilizată pentru separarea şi concentrarea diferitelor molecule sau
particule.
În ultrafiltrare membranele pot fi considerate ca o „sită” (membrane microporoase) a
căror mărime a porilor guvernează separarea.
Tabelul 7. Aplicaţiile filtrării pe membrane
Tipul de Aplicaţia Masa moleculară
filtrare relativă a particulelor ce
pot fi separate
microfiltrare concentrarea bacteriilor >1 000 000
şi virusurilor (sau particule)
ultrafiltrarea fracţionare;
dializă; >10 000
producerea de enzime; (macromolecule)
producerea de proteine;
producerea zerului
osmoza inversă concentrarea >200

produselor farmaceutice; (compuşi organici)
producerea lactozei; desalinizarea
parţială a soluţiilor;
electrodializa purificarea şi >100
fracţionarea substanţelor ionice; (compuşi organici)
desalinizarea
microfiltrarea – sistem închis
- avantaj: se lucrează în condiţii sterile
-se separă celule şi metaboliţi specifici
ultrafiltrarea - apare fenomenul de “polarizare a concentrării”
35
Figura 39. Secţiune transversală printr-un modul de ultrafiltrare „plate and frame”
(The Danish Sugar Co). 1 – grătar central; 2 – fereastră; 3 – membrană; 4 – hârtie
de filtru; 5 – suport plat pentru membrană
Figura 40. Reprezentarea schematică

a unui modul de ultrafiltrare „hollow-
fibre” (romicon). 1 – hollow fibre; 2 –
lagăr; 3 - suport pentru fibre.
36
Centrifugarea
Performanţa unei centrifugări poate fi caracterizată de expresia:

Q = d2ΔgZF/18
şi
Z = R2/g 
Rn2/900
unde:
Q – rata de încărcare volumetrică;
d – diametrul
particulei;
Δ - diferenţa de
densitate;
g – acceleraţia
gravitaţională;
F – volumul păstrat
în centrifugă;
 - vâscozitatea;
R – radius;
 - viteza
unghiulară;
N – numărul de
revoluţii/minut
Funcţia  = FZ, este utilizată în compararea diferitelor centrifugări. Deoarece F creşte

cu lungimea axială a rotorului şi Z cu diametrul şi viteza rotorului,
performanţele utilizării unor rotoare mai lungi (F), mai rapide sau mai largi
(Z) sunt superioare. Valorile lui Z sunt limitate de natura materialului din care este
construit rotorul.
Centrifugarea
Figura 35. Exemple de centrifugi solide: (1) scobitură tubulară, (2)

scobitură solidă multicamerală, (3) centrifugă cu scobitură în formă de disc
37
Tipul de centrifugă Avantaje Dezavantaje Detalii tehnice
Centrifugarea
coş perforat bună îndepărtare a apei; capacitate limitată pentru n – 500 – 2500 min-1
Tabelul 6. uşor de curăţat;
posibila spălare a
solide;
recuperare laborioasă a
Z – 300 - 1500
 - 900 – 1800
Proprietăţile filtrelor solidelor;
forţă centrifugă mică;
diferitelor tipuri de funcţionare discontinuă
centrifugi centrifugă cu utilizată la separarea forţă centrifugă mică n – 500 – 1000 min-1
solidelor; Z - 300 – 1500
sită rotativă posibilă spălare a filtrelor;
funcţionare continuă
coş tubular bună îndepărtare a apei; capacitate limitată pentru n - 13000 – 18000 min-1
forţă centrifugă mare; solide; d – 75 – 150 mm
uşor de curăţat; recuperare laborioasă a Z – 13000 - 17000
uşor de îndepărtat coşul solidelor;  - 1500 - 4000
funcţionare discontinuă
coş capacitate mare pentru recuperare laborioasă a n – 5000 – 10000 min-1

solide; solidelor; d – 125 – 530 mm
multicameral nu pierde eficienţă până la funcţionare discontinuă Z - 6000 - 11400
solid completa încărcare a
camerelor
centrifugă cu trecere rapidă simultan cu forţă centrifugă mică n – 700 – 2500 min-1
o concentrare mare; Z – 350 – 1400
descărcare funcţionare continuă  - 900 - 2300
rotativă
centrifugă cu funcţionare discontinuă; îndepărtare slabă a apei; n – 3000 – 10000 min-1
forţă centrifugă mare; funcţionează numai cu Z – 4000 - 7500
scobitură în eliminarea lichidului sub solide mici în suspensie  > 270000
formă de disc presiune;
curăţare ieftină
centrifugă cu funcţionare continuă; îndepărtare slabă a apei; n - > 10000 min-1

forţă centrifugă Z > 14000
tub de elimin. mare  > 80000
a sol. apoase
Aducerea în suspensie
În cazul celulelor bacteriene cu dimensiuni mici
Metode: - formarea de floculi
- metoda de plutire
Dezintegrarea
celulelor
Microorganisme:
F
i
g
u
r
a
3
6
.
M
e
t 38
Metode de extracţie
termenul de extracţie se referă atât la separare cât şi la concentrare
Distribuţia substanţei între cele două faze este guvernată de un coeficient de
partiţie caracteristic, K:
Concentratia substantei in faza A
K=
Concentratia substantei in faza B
Figura 37. Procesul tehnologic de recuperare a antibioticelor
Metode de concentrare
- trebuie să nu afecteze structura şi activitatea produsului

- printr-o etapă de separare sau extracţie
-ca o ultimă etapă înainte de purificarea economică;
-- tipuri:extracţia, evaporarea,
- procesarea pe membrane,
- cromatografia de schimb ionic,
- cromatografia de adsorbţie
39
Evaporarea
Se aplică la soluţiile obţinute în urma extracţiei cu solvenţi, caz în care evaporarea
solventului este obligatorie.
Evaporarea directă a mediului de cultură - în cazul produşilor secundari, de obicei
prin folosirea unui spray de uscare;
Evaporarea în timp scurt (min.) – este continuă; permite concentrarea produselor
instabile cu ajutorul unor filme de evaporare;
Evaporarea cu filme subţiri sub formă de peliculă – concentrarea amestecurilor
vâscoase, sau în faza finală de uscare a produsului.
Răşini schimbătoare de ioni şi de adsorbţie

Răşini schimbătoare de ioni: - concentrarea puternică într-o singură etapă.
Tabelul 8. Natura chimică a schimbătorilor de ioni solizi şi lichizi
Schimbător de Matrix Grupări funcţionale
ioni
Răşini Stiren-divinil.benzen; Carboxil;

schimbătoare de Acrilat; Acid sulfonic;
ioni solide Metacrilat; Amine primare, secundare şi
Poliamina; terţiare;
Celuloză; Amine cuaternare
Dextran
Schimbători de ioni Solventul este folosit pentru Amine primare, secundare şi
lichizi transportul grupelor terţiare;
funcţionale Monoesterul acidului fosforic;
Diesterul acidului fosforic
Răşini de adsorbţie: - sunt utilizate în locul procedeelor de extracţie

Tabelul 9. Proprietăţile răşinilor de adsorbţie
Suprafaţă 20 – 800 m2g-1
Volumul porilor 0,5 – 1,2 ml g-1
Proprietăţi fizice Mărimea medie a porilor 5 –
130 nm
Nepolar: stiren-divinil benzen;

Semipolar: ester acrilic;
Proprietăţi chimice
Polar: sulfoxid, amide,
grupările N-O
40
Purificarea şi stabilizarea amestecului
În fiecare din etape se realizează o purificare a produsului finit. În final se
ajunge cu un produs al cărui grad de puritate nu este întotdeauna satisfăcător
motiv pentru care este necesară introducerea unei etape finale de purificare şi
stabilizare. În prezent se utilizează două metode de purificare: cristalizarea şi
cromatografia.
Cristalizarea
Este folosită la purificare compuşilor cu masă moleculară mică, cum sunt de
exemplu antibioticele.
La o scară mai mare cristalizarea este etapa finală de purificare a unor produşi
ca actinomiceina A, penicilina G, acidul citric, glutamatului de sodiu etc.
Cromatografia
purificarea compuşilor cu masă moleculară mică care într-adevăr necesită
parcurgerea unei astfel de etape (de exemplu antibioticele), a macromoleculelor, a
enzimelor atunci când sunt însoţite de compuşi de aceiaşi natură.
Purificarea şi stabilizarea
amestecului
Figura 41. Izolarea şi

purificare actinomicinei
41
Purificarea şi stabilizarea
amestecului
Echipamentul constă într-o

baterie de coloane cu
diferite matrixuri,
rezervoare, sisteme de
pompare a eluentului şi
o serie de colectoare de
fracţii.
Figura 42. C=PHARMACIA

1501
segment de coloană din oţel: P – filtru,
S1, S2 - filtre sterile, Fl – flow-
metru, UV – spectrofotometru UV
Purificarea şi
stabilizarea amestecului
Figura 43. Procesul

tehnologic de purificare a
proteinelor plasmatice umane
(Curling, 1980)
42
Purificarea şi stabilizarea amestecului
Prin cromatografie de afinitate se purifică în special enzimele dintr-un
amestec de proteine. Folosindu-se o soluţie tampon cu pH diferit de cel al
enzimei, enzima poate fi eluată selectiv de pe coloană. Astfel de efectori
specific sau molecule complementare care pot fi separate prin acest procedeu
sunt:   enzime/inhibitori enzimatice (sau vice-versa);
  anticorpi/antigene sau haptene (şi vice-versa);
  lectine/glicoproteine sau polizaharide;
  acizi nucleici/secvenţe de baze complementare;
  hormoni/receptori;
  vitamine/proteine transportoare etc.
exemplu:
  principiul de separare a dehidrogenazele se bazează pe
interacţiile specifice cu coenzima sa (NAD+). Ca matrix se foloseşte sepharoză la
care este legat NAD+.
  Interferonul din leucocitele umane este recuperat
prin cromatografie de afinitate, de pe o coloană de dextran la care a fost legat
anticorpul monoclonal
împotriva interferonului.
Dezavantaj: cost mare al efectorilor imobilizaţi
Cromatografia de afinitate de grup specific: în separarea
glicoproteinelor şi nucleotidelor
Cromatografia covalentă: separarea proteineor care contin grupări
-SH
Uscarea
Este modalitatea prin care bioprodusul este adus în formă stabilă pentru a putea fi
manipulat, ambalat, transportat. Deoarece majoritatea produşilor biologici sunt
sensibili se descompun uşor sau îşi pierd activitatea atunci când se găsesc la
temperaturi înalte, singura metodă de uscare este îndepărtarea apei cu o creştere
minimă a temperaturii. În cazul enzimelor şi a produselor farmaceutice
termostabilitatea este asigurată prin adăugarea de zaharuri sau alţi stabilizatori inerţi.
Pentru a elimina apa sub formă de vapori, energia rezultată în urma încălzirii trebuie
transferată prin convecţie, radiaţie, sau ambele procedee combinate şi controlată
strict pentru a nu permite depăşirea pragului de temperatură. Cele mai utilizate
tehnici sunt:
• uscare la vacuum
• uscare cu jet de gaz
• uscare prin îngheţare rapidă
43
BIOMASA MICROBIANĂ CA SURSĂ
DE OBŢINERE A PROTEINELOR
Introducere
„single cell protein” (SCP) - o singură proteină celulară - termen utilizat şi
acceptat pentru materialul celular microbian folosit ca hrană şi furaj. Termenul
nu este în totalitate corect - proteina obţinută ca produs al unui proces
biotehnologic nu este 100% pur. Termenul a fost atribuit ţinând cont de faptul că
o proteină se poate obţine dintr-o varietate de microorganisme mono – şi
multicelulare, bacterii, drojdii, fungi filamentoase sau alge
Tabelul 10. Exemple de microorganisme care pot fi utilizate ca

sursă de obţinere a SCP
Caracteristica Paecilomyces Fusarium Candida
varioti graminearum utilis
Material uscat (%) 96 94,2 91
Proteină crudă (% N x 6,25) 55 54,1 48
Grăsimi (%) 1,0 1,0 1,35

Cenuşă (%) 5 6,1 11,2
Lizină (g/16g N) 6,5 3,5 7,2
Metionină (g/16g N) 1,9 1,23 1,0
Cistină şi cisteină (g/16g N) 1,0 0,75 1,0
Introducere
 producerea microorganismelor la scară industrială în vederea obţinerii unor
produse alimentare - în Germania, în timpul Primului Război Mondial -
producerea de drojdie „Torula”.
 SUA şi Marea Britanie -
 Prima Conferinţă - 1967 la Institutul de Tehnologie din Massachusetts; majoritatea
proiectelor prezentate au fost la nivel de cercetare. O singură prezentare, cea a
cercetătorilor de la „British Petroleum” (BP) a scos în evidenţă, aplicaţiile
fermentaţiei SCP la scară industrială.
De ce să producem SCP?
 creşterea cerinţelor pieţei pentru hrană mai sănătoasă
 furaje în compoziţia cărora intră proteine înalt purificate printr-o tehnologie avansată
 avantajele producerii la scară largă a biomasei microbiene:
 rată mai mare de multiplicare,
 conţinut proteic ridicat (30 – 80% proteine în masă uscată),
 utilizarea unui număr mai mare de surse de carbon,
 sitele de cernere se pot construi din materiale mai bune şi relativ uşor,
 instalaţiile de producţie ocupă suprafeţe mici şi duc la creşterea randamentului
de producţie,
 producţia microbiană este independentă de anotimp, variaţii climaterice.
44
Procesul de obţinere a SCP
Etapele procesului de obţinere a SCP se stabilesc în funcţie de substratul şi
organismul utilizat
Figura 44. Reprezentarea schematică a unui proces general de producere a SCP
Procesul de obţinere a SCP

Etape de bază:
 combinarea fizică şi tratamentul chimic al materiilor prime de bază;
 prepararea mediului corespunzător care conţine surse de carbon, azot, fosfor, şi
alţi nutrienţi esenţiali;
 prevenirea şi contaminarea mediului sau a plantelor;
 cultivarea microorganismului necesar;
 separarea biomasei microbiene de mediul consumat;
 recuperarea biomasei –
 spargerea celulelor –
 tratamentul final al biomasei cu sau fără etape de purificare finală,
 îndepărtarea excesului de substrat sau a componentelor acestuia –,
 reducerea concentraţiei ARN –
 tratarea reziduurilor –
 se recuperează între 18 şi 45 x 106 litri funcţie de substrat şi microorganism la o
producţie de 100.000 t SCP/an
45
Selectarea microorganismelor
Caracteristici de bază ale microorganismul utilizat pentru obţinerea unei
anumite proteine:
 să nu fie patogenic pentru instalaţie, animal sau om;
 să aibă o valoare nutriţională bună;
 să fie acceptat pentru hrană şi furaje;
 să nu conţină compuşi toxici;
 producerea la scară largă să necesite costuri minime.
De reţinut: costul de producţie depinde de:

 viteza şi randamentul de creştere,
 conţinutul în proteina ţintă,
 necesarul de nutrienţi suplimentari,
 utilizarea unui mediu avantajos,
 proprietăţile de uscare şi separare
Tabelul 11. Compoziţia în aminoacizi a drojdiilor şi a unor alimente selectate
Conţinutul de aminoacizi (g/16g N) în:
Proteine tradiţionale
Aminoacid SCP din componente
alimentare
furajere
Toprina Pekilo Sacharomic Făină Extract din Ou Referinţe
es cerevisiae de fasole de soia FAO
peşte
5,1 4,8 4,6 5,4 6,7

izoleucină 4,6 4,2
leucină 7,4 7,4 7,0 7,3 7,7 8,9 4,8
fenilalanină 4,3 4,0 4,1 4,0 5,1 5,8 2,8
tirozină 3,6 3,5 - 2,9 2,7 4,2 2,8
treonină 4,9 4,1 4,8 4,2 4,0 5,1 2,8
triptofan 1,4 1,1 1,0 1,2 1,5 1,6 1,4
valină 5,9 5,1 5,3 5,2 5,0 7,3 4,2
arginină 5,1 5,3 - 5,0 7,7 - -
histidină 2,1 1,9 - 2,3 2,4 - -
lizină 7,4 6,5 7,7 7,0 6,5 6,5 4,2
cisteină 1,1 1,0 - 1,0 1,4 2,4 2,0
metionină 1,8 1,9 1,7 2,6 1,4 5,1 2,8
aminoacizi cu 2,9 2,9 - 3,6 2,8 7,5 4,8
sulf
46
Algele –genurile Chlorella, Scenedesmua, sau Spirulina.
 cresc prin procedee fotosintetice şi autotrofice sau heterotrofic
 cultivare la scară largă - în eleştee deschise, la lumina soarelui.
 Probleme:
 Risc crescut de contaminare,
 densitate celulară mică,
 alge unicelulare → costuri ridicate pentru procedeele de recoltare
 compoziţia în proteine
 conţinutul total de proteine native (ntotal x 6,25) ≥60% → profilul în aminoacizi al
SCP este în general bun.
algele cu un conţinut bogat de pigmenţi fotosensibili → la producerea de SCP
pentru furaje, dar nu şi pentru alimente.
microalgele- utilizate pentru obţinerea de proteine aditive, dar nu în concentraţie
mare şi în anumite condiţii de calitate.
incorporarea algelor Chlorella şi Scenedesmus în dieta umană → numeroase
probleme; Spirulina este foarte des utilizată
Bacteriile –
 rată mare de creştere,
 numărul de bacterii utilizate în producerea de SCP este în continuă creştere
 standard ridicat de sterilitate în întreg procesul tehnologic
recuperarea bacteriilor prin centrifugare este o problemă - noi metode care să
permită omorârea acestora şi nu deversarea în mediu
 conţinut proteic de aproximativ 80%,
 conţinut ridicat de ARN care trebuie îndepărtat
profilul în aminoacizi al SCP este în general bun; câteodată prezintă un conţinut
mic de aminoacizi cu sulf
47
Drojdiile –genurile Saccharomyces, Torulopis şi Candida

 viteza mare de creştere a culturilor
 risc redus de contaminare cu agenţi patogeni
 recuperare – din reziduuri, uşor, prin centrifugare continuă.
 conţinutul în proteine este de aproximativ 55-60%,
conţinutul în acizi nucleici este >15% din greutatea de bază (este necesară o
etapă de reducere a concentraţiei acestora)
 profilul aminoacizilor din structura SCp - în general bun
Fungii filamentoşi –
 sistem de cultivare - culturi în suspensie sub formă de filamente sau de pelete,
viteză de creştere mai mică decât a bacteriilor şi drojdiilor; microfungii pot atinge
o viteză de creştere apropiată de cea a drojdiilor
risc redus de contaminare cu agenţi patogeni (cresc la un domeniu de ph mai
larg, între 3 şi 8 ceea ce permite cultivarea lor la ph 5)
 risc de contaminare cu drojdii
 recuperarea fungilor - filtrare.
 conţinutul în proteine variabil; 50 – 55% din total substanţă uscată.
 conţinut în ARN - până la aproximativ 15% din masa uscată,
 conţinut în chitină - până la aproximativ 15% din masa uscată
 profilul aminoacizilor din structura SCP – bună (săracă în aminoacizi cu sulf)
Alegerea substratului
Sursele de compuşi cu conc. mici de carbon
două grupuri: - “fosile”
- “reînnoite”
48
Hidrocarburi lichide –n-alcanii (saturaţi, cu catenă liniară) C9 - C18

 0 -30 % în uleiurile naturale şi în kerosen
benzina - numai 10% fermentează, restul trebuie recuperat, separat de SCP, şi
returnat la rafinărie pentru o procesare ulterioară
- posibilă contaminare cu policicluri aromatice
 transferul n-alcanilor C10 – C18 în celulă –
 macro – emulsia care este transformată într-o micro – emulsie → obţinerea
agenţilor de emulsionare - surfactanţi
 sursă de energie şi carbon -
 Compania „Britisch Petroleum” (BP) - două procese de producţie:
 benzina
 n-alcanii puri.
„Toprina” - produs omologat de BP şi comercializat
 Instalaţie de cultivare a Candida utilizând ca substrat benzina
Hidrocarburile gazoase –cel mai des utilizat este metanul

 avantaje:
• disponibil la puritate mare;
• uşor îndepărtat în urma procesului de fermentaţie
• nu lasă reziduuri;
• cultivare continuă → randament bun, productivitate ridicată
 probleme de producţie
 transferarea a două gaze – metan şi oxigen
 formarea în mediu a unor produşi de inhibiţie
 explozie dacă concentraţia de oxigen depăşeşte 12% (v/v)
 foarte costisitor
 microorganisme capabile să utilizeze metanul ca substrat - bacteriile Pseudomonas
methanica, Methanomonas methanica, bacteriile termofile Methylococus
capsulatus şi Pseudomonas methanitrificans.
49
Metanol - alternativă a producerii de biomasă din metan

 se fabrică din metan prin conversie salvându-se astfel surplusul de gaz natural,
dar şi din alte surse cum ar fi cărbunele, motorina, lemnul şi naftalina
 este utilizat de bacteriile metanifere şi de Methylomonas methanolica,
Pseudemonas utilis, Pseudomonas extorquens, hydromicrobium sp;
actinomicite: Streptomyces sp, drojdii Hansenula polymorpha, Candida
boidinii, Torulopsis glabatra.
 avantaje:
 perfect solubil în apă,
puţine posibilităţi de explozie,
numărul de microorganisme care poate fi cultivat este mare
 produs de Imperial Chemical Industries Ltd (ICI) (UK) → bacteria
Methylophilus methylotrophus
Polizaharide hidrolizate – celuloza şi amidonul
 hidoliza se poate realiza enzimatic sau prin tratament acid
 celuloza - hidroliza se realizează sub acţiunea celulazei din fungi, ca de exemplu
Trichoderma viride
- proces scump
 amidonul - procesul tehnologic este prea scump
-Rank Hovis McDougall (RHM) → proces bazat pe hidroliza amidonului;
ca microorganism a fost selectat mucegaiul Fusarium graminearum
- pus în fabricaţie sub denumirea de „Mycoprotein”
- dezavantaj - se transformă în gelatină
-se preferă creşterea microorganismului pe materiale solide, în absenţa
lichidelor - „fermentaţie semi-solidă”
50
DIGESTIA ANAEROBĂ
1. Introducere
Definiţie: procesul anaerob de producere a metanului şi a dioxidului de carbon

din materiale organice prin utilizarea unui amestec de microorganisme.
Fermentaţia - proces catabolic anaerob în care energia se obţine în urma

degradării compuşilor organici care pot fi atât donori cât şi acceptori de
electroni.
- microorganisme anaerobe şi facultativ anaerobe,
-substraturi: polizaharidele (celuloză, amidon, chitină),
dizaharidele (zaharoză, lactoză, manoză), hexozele (glucoză, fructoză,
galactoză), pentozele, polialcoolii (glicerol, manitol), aminoacizi, acizi
organici, purine şi pirimidine.
-produşi: alcooli, acizi, esteri şi diferiţi compuşi în stare
gazoasă (H2, CH4, CO2).
-beneficii comerciale: producerea de energie, reducerea
poluării şi controlul diferitelor mirosuri
2. Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobe

1. Interacţii specifice
 realizarea unui complex omogen interdependent de culturi bacteriene;
 formarea metanului, acetatului, H2 şi CO2:
• bacterii utilizează un număr limitat de substraturi
• acţiunea bacteriile fermentative şi hidrolitice asupra deşeurilor organice →
substratele metanogene;
• producerea H2:
- bacterii fermentative
- bacterii acetogenice → acetat + H2
- bacterii metanogene → CH4 + CO2
• avantajele metodei:
- organismul introdus în bioreactor poate utiliza protonii sau acceptorii de
electroni generând H2
- H2 poate fi utilizat de bacteriile metanogene
• presiunea parţială scăzută a H2 permite creşterea bacteriilor pe substrate
reduse
-Bryant (anii ’60) → cultură pură de methanobacillus omelianskii
• probleme: dificil de identificat speciile de microorganisme din bioreactor
51
2.Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobe
Concept: în toate procesele de digestie care utilizează ca substrat deşeuri complexe
întâlnim toate grupurile de microorganisme trofice
anii ’60: o cultură pură de metanogene

poate utiliza ca sursă de energie un
număr limitat de compuşi;
anii ’80: McInerney şi col. -clasificarea
taxonomică a metanogenelor - toate
speciile pot obţine energie în urma
reacţiei:
4H2 + CO2→CH4 + 2H2O G0’ = -
139
kJmol-1
Figura 47. Populaţia microbiană

prezentă în bioreactorul de
digestie
3. Tipuri de bioreactoare de digestie

 deşeurile produse într-o fermă obişnuită;
instalaţii robuste, construite din materiale locale, care pot funcţiona
Bioreactoare în sistem batch sau continuu, prin alimentare cu deşeuri o dată pe zi;
clasice: nu sunt încălzite, sunt amestecate manual şi sunt izolate cu
materiale
locale
Bioreactoare batch:
bioreactor ce funcţionează în sistem continuu, cu agitare (CSTR –

„continuously stirred tank reactor”)
este un sistem continuu  în bioreactor va exista în permanenţă un amestec

format din deşeuri noi care se adaugă, material nedigerat şi câteva populaţii
microbiene active;
există:
 bioreactoare tubulare numite „plug flow”
 bioreactoare în care are loc reţinerea microorganismelor
este necesar un vas de stocare a gazului;
întâlnit în tratamentul noroiurilor
52
4.Tipuri de deşeuri utilizate ca substrat
 în funcţie de consistenţă: deşeuri de consistenţă joasă,

Clasificare medie şi
crescută şi
deşeuri solide.
 în funcţie de conţinutul în masă uscată de substanţe solide (TS):
0,2 –1%,
1-5%, 5-12%
20-40% substanţă solidă.
Metode
determinare volatilităţii solidului (VS) care implică încălzirea materialului uscat la

500 0C pentru a îndepărta materialul organic ca CO2 şi
determinarea necesarului de oxigen (COD „chemical oxigen demand”) care în
mod uzual se aplică deşeurilor cu o consistenţă mare şi implică o oxidare chimică
cantitativă a materialului organic.
BOD5 „biochemical oxygen demand measused over a 5-day period”,
TOC „total organic carbon” – utilizată pentru materialele solubile.
4.Tipuri de deşeuri utilizate ca substrat
Caracteristici:  un mediu de creştere bun pentru populaţie şi nutrienţi - de obicei

se utilizează un raport între atomii de C şi N de 40:1;
 un pH care să varieze în jurul lui 7;
 trebuie notată concentraţia potenţialilor inhibitori
 industriale şi alimentare –
Surse de  bălegarul animal –
deşeuri:  biomasa agricolă –
 deşeurile din apele reziduale orăşeneşti
53
5. Parametri digestiei
 bacteriile mezofile : 20 – 250C şi 40 – 450C
 bacterii termofile 50 – 550C şi 60 – 650C pentru,
 trecerea de la temperatura mezofilă la cea termofilă care poate fi
Temperatura: accidentală şi pentru o scurtă perioadă de timp poate duce la prelungirea
timpului de producere a gazului cu câteva săptămâni.
similar în cazul adaptării populaţiilor mezofile la condiţiile de temperatură termofile.
 digestia termofilă este mai puţin stabilă;
 avantaj - distrugerea patogenilor şi a animalelor parazite
Timpul de reţinere a apei

Timpul de reţinere hidraulică (HRT) = perioada de timp cât lichidul rămâne în
bioreactor;
Volumul bioreactorului
HRT =
Volumul de deşeuri adăugate
zilnic
Indicele de încărcare a bioreactorului -
Acizii graşi volatili -
Digestia în două etape -
6. Obţinerea acizilor organici şi a aminoacizilor

2 Introducere
Acizi organici: acidul citric, gluconic, itaconic, 2-cetogluconic,

eritorbic, tartaric, lactic şi acetic şi acizii graşi volatili;
Aminoacizi: acidul L-glutamic, L-lizina, acidul L-aspartic, L-
triptofanul şi D-arilglicina (care este folosită în producerea
semisintetică a penicilinei);
cei mai importanţi sunt acidul citric, acidul glutamic şi lizina.
Tabelul 12. Producţia mondială a principalilor acizi de fermentaţie

Produs Unităţi Producţia totală
($/kg) (t/an)
Acid glutamic 3,5 – 4,0 300 000
Acid citric 1,5 300 000
Lizină
5,0 – 5,5 40 000
Acid lactic
1,0 – 1,5 40 000
54
Introducere
Aspecte de urmărit:
1. Procesele chimice de obţinere a unor astfel de compuşi competiţionează

cu căile metabolice, ultimele fiind mai eficiente şi mai economice;
2. pentru o fermentaţie eficientă este necesară alegerea cu atenţie a
organismului, a speciei sau a mutaţiei şi a căii de creştere în condiţii
nutriţionale corecte, deoarece preţul de cost al procesului biotehnologic
depinde de costurile utilizării substratelor;
3. în cazul majorităţii proceselor fermentative de obţinere a produşilor
chimici este necesar un control real al tuturor condiţiilor de fermentare şi
de recuperare a produsului finit;
4. în toate cazurile un proces biotehnologic de succes este acela în care
produsul este obţinut în concentraţia dorită, la puritatea maximă şi după
un proces de recuperare mai puţin laborios.
Aplicaţii
Acidul citric
e
s
t
e
o
b
ţ
i
n
u
t
p
r
i
m
o
r
d
i
a
l
d
i
n
s 55
Aplicaţii
Figura 48. Formarea acidului citric. Linia punctată indică punctele de control ale procesului
Aplicaţii
Figura 49. Reprezentarea schematică a unui proces tehnologic, submers de obţinere a

acidului citric din melasă.
56
Aplicaţii
Acidul gluconic  Aplicaţii:
 agent de complexare,
 medicina veterinară,
 eliberarea de lungă durată a acidului în procesul de coacere
 Obţinere:
 oxidarea electrolitică a glucozei
 oxidare cu aer sau oxigen pe catalizator de platină
 procese fermentative - ca substrat A. Niger
 oxidare catalitică a glucozei - glucozoxidază imobilizată
 Etape:
 Obt. substratului:
glucozoxidaza
Glc glucono –δ-lactonei gluconolactonaza ac.gluconic
 Fermentaţia:
mediul: sol. de Glc monohidratată (amidon hidrolizat), nutrienţi (sursă de N,
PO43-, Mn2+, elem.min), lichior moale de cereale (extract de drojdii)
inocul: spori de A.niger (inocul vegetal)
tancuri de fermentaţie
Recuperarea
acidul gluconic; gluconatul de calciu, glucono-δ-lactona
Aplicaţii
Acidul tartric
 Aplicaţii:
 acidifiant în industria alimentară
Obţinere: acid tungstic
 sinteză chimică: acidul maleic + apa oxigenată amestec
racemic
intermediar: formarea acid. cis-eposuccinic,  stoparea reacţiei prin
controlul temperaturii.
 din reziduurile acumulate în vanele de producere a vinului
 metoda fermentativă
 specii de Acetobacter capabile să producă alături de 5 –cetoglutarat şi
cantităţi mici de acid tartric, dar numai în anumite condiţii.
 în anii ’80, Yamada şi colab. - mutanţi de Gluconobacter suboxydans
 hidroliza enzimatică - rezultatele nu au depăşit nivelul de staţie pilot
- hidroliza stereospecifică a cis-eposuccinatului (bacterii)
- trecerea celulelor spălate sau a extractului apos de celule peste un substrat
de cis-eposuccinat
 produs în soluţie: îndepărtarea celulelor sau a enzimei imobilizate.
 Recuperare
 sub formă de tartrat de calciu; fosfatul de calciu; săruri insolubile de calciu
57
Acidul lactic
Aplicaţii
 Aplicaţii:
 ind. alimentară – acidifiant
 medicină
alte industrii
 Obţinere:
proces de fermentare anaerobă;
 Procese fermentative heterolactice: produşi finali – lactat, etanol, dioxid de
carbon şi eventual acetat;
Figura 50. Calea fosfoketolazei
Aplicaţii
Fosfoketolaza – Ba. heterofermentative Lactobacillus şi Acetobacter
-acţionează asupra glucidelor fosforilate C5 şi C6  acetil fosfat şi
gliceraldehid 3 fosfat sau eritrozo 4 fosfat.
- se formează acetil fosfat  etanol cu regenerarea NAD+;
 acetat printr-o reacţie care produce
ATP;
-gliceraldehid 3 fosfat  piruvat  lactat
- este prezentă şi la drojdii: xiloza  x i l i t o l  xiluloză  xilulozo
5P
- la Ba. care cresc pe xiluloză: xiloză izomerază
xiluloză
-calea C5-fosfoketolazei nu înlocuieşte glicoliza dar oferă
organismului o cale eficientă de convertire a pentozelor la unităţi C2 şi C3 pentru
metabolizarea lor ulterioară
Procese fermentative homolactice - Lactobacillus bulgaricus şi L. delbrückii.

- substrat: - lactoză (zer), glucoză (sirop), sucroză în stare pură sau din melasă de
sfeclă;
- proces clasic anaerob: dizaharidele  hexoze  piruvat  acidul L(-)
lactic
-nutrienţi: carbohidraţi, nutrienţi anorganici, surse de azot (organic; anorganic –
lichior din tulpină de cereale, malţ de muguri, extract de drojdii), vitamine
58
Aplicaţii
Etape:
- prima etapă: formarea suspensiei active de Lactobacillus care creşte până ajunge
la faza de inoculum vegetativ
- parametri fermentaţiei: proces continuu; vase mari din inox sau lemn; fără agitare;
6 – 7 zile; temp. diferite (Ba. L. Delbrückii – > 500C, Ba. L. bulgaricus
temp < 440C)  fără etapă preliminară de sterilizare a mediului; pH = [5,8 –
6,0];
 = 80 – 90g acid lactic/100g carbohidraţi.
 Produs final;
prin încălzirea şi concentrarea produsului final de fermentaţie se obţin doi produşi
secundari de condensare, acidul lactoillactic care este un produs liniar şi dilactida
care este un produs ciclic. Cei doi produşi împiedică formarea acidului lactic
cristalin în formă pură;
Recuperarea acidului lactic -lactatul este tratat cu acid sulfuric; se precipită sulfatul
de calciu împreună cu organismul microbian utilizat care sunt îndepărtate prin
filtrare. Soluţia de acid lactic este tratată la temperatură înaltă cu cărbune activ,
filtrată şi evaporată în vederea concentrării până la aproximativ 50%, sau este trecută
pe o coloană cu schimbători de ioni, sau extrasă cu solvenţi organici şi apoi
evaporată.
Aplicaţii
Acidul acetic şi alţi acizi volatili
 se produce în principal din petrol; nu prin proces de vinificare ( oxidare
microbiană a etanolului la acid acetic).
 anii ‘80 - noi procese de fabricare a acidului acetic şi a altor acizi alifatici
volatili (VFAs), prin fermentarea anaerobă a materialelor celulozice şi a altor
deşeuri.
 Mecanismul de acumulare a VFA
Substrat - deşeurile celulozice sunt hidrolizate la glucoză de către celulaze care
sunt produse de bacteriile anaerobe. Din glucoză se obţine acid acetic şi acid
butiric
un mol de glucoză  trei moli de acid acetic
Cultura - amestec de bacterii anaerobe (Clostridium thermocellum, C.
Thermoaceticum)
- amestec de organisme obţinute printr-un procedeu de selecţie din ape
uzate (de ex. două tipuri de organisme unul care converteşte materialul organic
la VFA şi altul care converteşte VFA la metan şi dioxid de carbon)
 Mecanism – prezentat în figura 51
 Instalaţia industrială - tancuri cu deschidere mare, închise din care aerul se
exclude în permanenţă. Amestecarea se realizează cu ajutorul unui agitator
mecanic. Procesul are loc continuu, recircularea parţială a organismelor fiind în
avantajul creşterii vitezei de conversie şi a cantităţii de biomasă.
59
Aplicaţii
Figura 51. Calea de

formare a VFA din
glucoză (reprodusă
după Zeikus, J. G.,
1980, Ann. Rev.
Microbiol., 34, 423-
464)
Aplicaţii
L-lizina
 diferite procedee chimice sau enzimatice;

 cel mai eficient d.p.d.v. economic – procesul de fermentaţie (Toray Industries -
Patent englezesc 1334970 şi 1352860).
 substrat - n-parafină, acizi alifatici şi alcooli;
 Mecanismul de acumulare a L-lizinei.
Figura 52. Mecanismul de

acumulare a L-lizine. Linia
punctată reprezintă căile de
inhibiţie.
60
Aplicaţii
Fermentare aerobă,
- reactor cu agitare aerat
- pH sistemului este menţinut neutru,
- temperatura -280C.
- inocul – cantit. mică; creştere pe agar turnat în pantă, timp de 6
ore, într-un proces discontinuu,  40 – 45 g L-lizină/litru
atunci când se pleacă de la o concentraţie de melasă de 200 g/l
(100 g zahăr);
Recuperea produsului final:

- acidifiere cu HCl
- trecere pe o coloană schimbătoare de ioni în care au fost
grefate grupări amonium
- eluare cu HCl,
- cristalizarea L-lizinei hidroclorice
Aplicaţii
Figura 53. Schema operaţiilor

principale din procesul de izolare şi
purificare a L-lizinei din mediile de
biosinteză
61
Aplicaţii
Figura 54. Schema tehnologică de

obţinere a L-lizinei de uz farmaceutic.
1- vas preparare mediu, 2- pompă
încărcare, 3- vas de fermentaţie, 4,12-
rezervor HCl, 5- debimetru HCl,
6,9,15,17,19- pompă centrifugă, 7-
filtru rotativ cu raclare, 8- vas tampon,
10- rezervor lichid de fermentaţie, 11-
rezervor NH3, 13- debitmetre, 14-
coloană schimbători de ioni, 16-
concentrator, 18- vas dizolvare şi
purificare, 20- cristalizor, 21- filtru
Nutsche, 22- uscător
PRODUCEREA DE ANTIBIOTICE
Introducere
 cele mai importante produse comerciale obţinute prin biosinteză;
substanţe chimice care sunt produse de microorganisme şi omoară sau inhibă creşterea altor
microorganisme.
produşi secundari de metabolism, în majoritatea cazurilor, fiind produse prin fermentaţii
microbiene din tulpini bacteriene al căror potenţial de biosinteză este relativ scăzut.
 La început, erau produse din fungi filamentoşi sau bacterii din grupa actinomicetelor
Tabelul 13. Cele mai importante antibiotice comerciale şi

tulpinile microbiene din care se produc
Antibioticul Microorganismul producător Tipul de microorganism
Bacitracină Bacillus licheniformis Bacterii sporulate

Cefalosporină Cephalosporium sp. Fungi
Cloramfenicol Streptomyces venezuelae (nu se mai foloseşte) -
Sinteză chimică
Cicloheximidă Streptomyces griseus actinomicete
Cicloserină Streptomyces orchidaceum actinomicete
Eritromicină Streptomices erythreus actinomicete
Kanamicină S. lincolnensis actinomicete
Neomicină S. fradiae actinomicete
Nistatină S. noursei actinomicete
Penicilină Penicillium chrysogenum fungi
Streptomicină S. griseus actinomicete
Tetraciclină S. rimosus actinomicete
62
Introducere
Clasificare - în funcţie de structura lor
chimică şi de proprietăţile
antibacteriene
Tabelul 14. Clasificarea antibioticelor

în funcţie de structura lor chimică
Realizarea unui proces

de producţie Tipul operaţiei Etapele procesului Accesorii
Liofilizare
Uscare pe silicagel în Improvizarea instalaţiei
pantă Stocarea culturii
Dezvoltarea metodelor
Stocare în N2 lichid
< 10L
Flaskuri Teste de contaminare
Prepararea inoculului
Vase de inox pentru Preparea mediului
inocul
Tabelul 16. Reprezentarea
schematică a etapelor cheie Fermentatoare din inox Prepararea mediului
< 20m3 Derularea procesului
dintr-un proces de Teste de contaminare
Etapa de fermentare
producţie de antibiotice Monitorizarea
parametrilor biochimici şi
icrobiologic
Fermentatoare de inox de Prepararea mediului

10 – 100 m3 Derularea procesului
Etapa finală de Teste de contaminare
fermentare Monitorizarea
parametrilor biochimici şi
icrobiologic
Filtrare Teste de contaminare

Centrifugare Monitorizarea
hrănirea
Extracţia din bulion parametrilor biochimici şi
icrobiologic
Extracţia şi purificarea
63
Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou
 pre-necesitate esenţială
• instalaţie performantă
• creşterea eficienţei
procesului de
producţie
• modificarea continuă
a condiţiilor de lucru
• introducerea de noi
tehnologii şi instalaţii
de producţie
creşterea culturii
•creşterea pe mediu de
cultură solid sau lichid
•formarea inoculului
•transferarea inoculului
în mediul de
fermentaţie
•limitarea creşterii
•modificarea căilor metabolice  obţinerea unei cantităţi mari de produs
secundar
•adăugarea unui nutrient cheie care modifică calea metabolică
 păstrarea culturilor:
•pentru o eventuală inoculare
•se vor lua una sau mai multe probe pentru inoculare.
Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou
 fermentaţia –
• alimentare continuă
•controlul permanent al condiţiile de cultură şi de fermentaţie
•la sfârşitul fermentaţiei bulionul conţine antibioticul, microorganismul
utilizat şi un număr mare de alte componente chimice ale mediului de
cultură
•antibioticul - o componentă minoră din compoziţia bulionului ( între 3 şi
35%)
 recuperarea şi purificarea:
•separarea de faza lichidă prin filtrare şi centrifugare
• extragerea antibioticul direct din bulionul de fermentaţie
• extracţia în solvenţi,
•cromatografie de schimb ionic,
• ultrafiltrare,
-osmoză inversă
-precipitare
-cristalizare
- uscare
64
Realizarea unui proces
de producţie
Figura 55. Profilul tipic al producţiei de antibiotice prin fermentaţie cu

indicarea concentraţie limită a unui nutrient
Prepararea inoculului
• monitorizarea creşterii pentru realizarea unei transferări eficiente a inoculului
•transfer în timpul creşterii logaritmice
• metode de apreciere a creşterii şi a activităţii metabolice
• analizarea prezenţei altor organisme
• în cazul de contaminare inoculul este transferat în fermentator
• când condiţiile de creştere sunt optime se realizează transferul unui volum
cuprins între 0,1 şi 20% din volumul final de fermentare.
Fermentaţia
formarea inoculului
• aclimatizarea microorganismelor producătoare de antibiotice la noile condiţii de
dezvoltare
• cantităţi mici din linia celulară sunt amplificate prin creştere pe medii solide sau
lichide.
• cultivare pe medii solide
• în funcţie de proces, suspensia de spori trebuie să fie utilizată în câteva zile, în caz
contrar este posibil să se formeze conglomeratele
65
Fermentaţia
• transferarea suspensiei din bioreactor în

container se realizează la o presiune
mare  containerul trebuie să fie
metalic
Figura 56. Sistem de transfer al suspensiei

de spori din containerul de păstrare în
bioreactorul de fermentare
Instalaţia de fermentaţie
 suspensia de spori este trecută în bioreactorul de fermentare:
• prin tubulatură unde sterilizarea are loc cu aburi sub presiune
• suflare în vasul de fermentaţie utilizând aer steril;
• dacă tubul de transfer este suficient de larg iar vasul de fermentare depresurizat
suspensia de spori poate fi lăsată să intre în vasul de fermentaţie sub propria
forţă gravitaţională;
• tubul trebuie un timp suficient pentru răcire
• risc mic de contaminare a suspensiei de spori
 Deşi vasele de realizare a mediului şi de sterilizare nu sunt esenţiale în procesul

tehnologic, atâta timp cât mediul poate fi în condiţii submerse (batched) iar
sterilizarea se realizează direct în vasul de fermentare aceste vase sunt incluse
pentru a obţine un preţ de cost mai mic prin asigurarea condiţiile optime de
fermentaţie. Un singur vas „batcheing” şi un sterilizator pot servi unui număr mai
mare de fermentatoare, permiţând astfel fiecărui fermentator să fie utilizat la
maximum pentru producerea antibioticului dorit. Scurtarea timpului între procese
fermentative succesive permite realizarea unui număr mai mare de procese
fermentative pe an, crescând astfel cantitatea de antibiotic care se obţine din fiecare
fermentator.
66
Criterii pentru alegerea fermentatoarelor:
• trebuie să asigure transferul de gaz şi
lichid;
• un transfer al nutrientului între faze;
• fermentatorul este prevăzut cu un sistem
de agitare performant;
• fermentatorul trebuie să asigure un
transfer bun de energie;
• este esenţial să ne asigurăm că organisme
nedorite nu pătrund în vasul de
fermentare, mai ales acum când
organismele sunt modificate genetic şi
prin natura lor pot deveni poluante sau
pot afecta sănătatea lucrătorilor;
• pentru a asigura condiţiile aseptice
fermentatorul trebuie să fie presurizat;
Figura 57. Reprezentarea schematică a unei

instalaţii tipice de fermentare a antibioticelor
Fermentatoarele:
• volum - 30 - 200 m3.
• fabricate din oţel foarte bine finisat
pe interior
• înălţimea - de 2 - 4 ori mai mare
decât diametrul
• 4 – 6 sisteme de întârziere a
fermentaţiei, fixate de pereţi.
• sistem de cuţite (BLANDERE)
orizontale (Rushton) sau sistemul
de agitare cu aer sub presiune.
Figura 58. Fermentatorul tradiţional

utilizat la producerea de antibiotice
67
Etapa de creştere
• acumularea de biomasă miceliană

• utilizarea intensivă a componentelor mediului de cultură;
• necesarul de oxigen este maxim;
• activitatea respiratorie (eliberarea de dioxid de carbon) este ridicată;
• pH optim de 4,5 – 5,0
Etapa de producere a antibioticului
 Caracteristici:
• încetinirea creşterii miceliului,
• scăderea consumului de oxigen,
•menţinerea pH la valoarea optimă,
•acumularea de penicilină
miceliul foloseşte nutrientul şi produce energia necesară bioprocesului.
•asigurarea necesarului de substanţe minerale
•menţinerea temperaturii optime
Etapa de producere a antibioticului
 Factori de care depinde gradul de acumulare al antibioticului:
• potenţialul productiv al tulpinii

• folosirea unor constituenţi adecvaţi şi a unui echilibru corect în proporţiile
acestora
• menţinerea pH în condiţii optime
• raport corect între diferitele surse de carbon
• adăugarea de precursori care vor determina tipul de antibiotic ce urmează
a se forma
• asigurarea necesarului de substanţe minerale
• menţinerea temperaturii optime
68
Etapa autolitică
În practica industrială nu este permisă prelungirea fermentaţiei
până la faza de autoliză!
•când microorganismul se epuizează ca urmare a activităţii metabolice prelungite,

sursele de carbon din mediu sunt consumate, şi conţinutul de azot scade. pH
creşte peste valoarea optimă. În acest punct încetează producerea de antibiotic
şi se induce procesul de hidroliză alcalină a antibioticului deja format.
•Controlul fermentaţiei se realizează prin determinarea sterilităţii mediului, gradului
de dezvoltare morfologică a microorganismului, pH mediului, concentraţiei
deantibioticului din mediul de cultură şi a consumului de glucide. Probele se
iau la intervale regulate de timp iar procesul se consideră terminat atunci când
conţinutul în sursă de carbon al mediului ajunge la 0,2 – 0,6% iar concentraţia
soluţiei rămâne practic nemodificată.
•Concentraţia antibioticului în soluţia nativă depinde de potenţialul productiv al
tulpinii şi de respectarea condiţiilor optime de fermentaţie.
ENZIMELE ŞI PRODUCEREA LA
SCARĂ LARGĂ A ACESTORA
Introducere
•fabricarea preparatelor enzimatice interes practic deosebit îl au microorganismele
heterotrofe;
•microorganism poate ataca un substrat natural şi-l metaboliza, dacă posedă enzimele
capabile care să realizeze aceste căi metabolice, în condiţii de mediu proprii pentru
dezvoltare;
•sunt enzime intracelulare care nu sunt secretate în mediul de cultură, în care
microorganismele se dezvoltă;
• drojdiile, bacteriile lactice, nu conţin decât enzime intracelulare 
eliberarea
enzimelor are loc în urma proceselor de autoliză  metabolizează doar substraturi
nutritive solubile;
• bacteriile din genul Bacillus sau fungii din genul Aspergillus  enzime intracelulare
şi extracelulare; ex: hidrolaze şi au rolul de a degrada substratele insolubile sau
solubile cu molecule mari la compuşi solubili uşor asimilabili
• rol important: substratul (sursăd e carbon - aminoacizi, vitamine, diferiţi cationi) 
induce formarea enzimei specifice degradării respectivului substrat  inductor
69
Introducere
Tipuri de enzime: enzime constitutive
enzime adaptative
Enzimele constitutive
se sintetizează în celule în mod permanent;
Concentraţia lor este însă influenţată de:
-prezenţa sau absenţa în mediul de cultură a substratelor pe care ele le
metabolizează;
-sursa de azot, sursa de carbon, factorii de creştere, sărurile minerale,
temperatura, pH-ul etc
Biosinteza are loc atunci când:
- este prezent substratul; biosinteza porneşte de la substanţe cu
structură
simplă;
- decurge cu consum de energie  se introduce şi o sursă de carbon
(glucid);
-are loc în timpul fazei logaritmice de creştere celulară, dar şi în faza
staţionară, în prezenţa inductorului şi a substraturile de biosinteză;
-este inhibat de inhibitori specifici (cloramfenicolul) şi de metaboliţii
rezultaţi (represie)  procesul de biosinteză a unei enzime induse este rezultatul
acţiunii antagoniste a inductorului şi a metaboliţilor
Tabelul 13. Cele mai importante enzime comerci
Introducere
70
Selecţia tulpinilor şi ameliorarea lor
Alegerea tulpinii producătoare
Trebuiesc avute în vedere următoarele aspecte:
-este enzimă intra- sau extracelulară – de preferat acel tip de enzime care
sunt stabile, care nu necesită un mediu de cultivare complex şi care se eliberează uşor
din celule în vederea purificării;
-dacă produşii de sinteză reprezintă o ameninţare pentru tulpina
producătoare;
- dacă există tulpini patogene sau cu toxine provenite de la
microorganismul
producător de enzime  se preferă microorganismele care prin tradiţie sunt folosite
în alimentaţia umană (tulpini din genurile Bacillus şi Aspergillus);
-microorganismul să fie capabil să crească în medii de cultură cu compoziţie
simplă; ieftine; să nu necesite adăugarea de promotori de creştere scumpi; să fie stabil
din punct de vedere genetic; să producă cantităţi mari din enzima dorită în cel mai
scurt timp posibil; să fie uşor de separat din bulionul de ferementaţie.
• Surse de microorganisme:
-din natură – ex: microorganismele care hidrolizează lactoza pot fi
izolate din produse lactate, iar microorganismele celulolitice din produse
lemnoase putrezite natural  dezavantaj: culturi pure în cantităţi mici;
-colecţiile de microorganisme  avantaj: tulpinile sunt cataloage
sunt trecute tulpinile şi se prezintă caracteristicile lor. Ex: ATCC, WFCC, IFO
Ameliorarea tulpinii producătoare

• Pentru tulpinile izolate din natură  ameliorare genetică în etapa de laborator 
se stabilesc principalele caracteristici ale procesului de biosinteză a enzimei:
creşterea producţiei în enzima dorită;
reducerea sau eliminarea enzimelor obţinute ca produşi secundari;
produsul dorit să fie biosintetizat în cantităţi mai mari fără a se utiliza
inductori scumpi;
producerea enzimei să se realizeze în condiţii normale de inhibiţie
enzimatică.
• trei metode de ameliorare:
ameliorarea prin mutaţie şi selecţie –
- ag. mutageni: radiaţii electromagnetice, mutageni chimici
- supravieţuitorii sunt izolaţi şi separaţi pentru ameliorarea
caracterului dorit
-ex: β-galactozidază, D-serindeaminază, ribitoldehidrogenază,
penicilinamidază, proteaze alcaline.
Hibridizarea – modificarea structurii ADN a tulpinii producătoare prin
transferarea unui fragment de ADN dintr-o altă tulpină. Tipuri:
- conjugarea –
- transformarea –
- transducţia –
- fuziunea protoplaştilor -
71
 Tehnologia ADN-recombinant: manipulare directă a ADN-ului prin
clonare moleculară -
Tabelul 14.
Prezentarea unor gene
manipulate genetic în vederea
obţinerii unor enzime de
interes comercial
Creşterea producţiei de enzime prin ameliorarea tulpinilor

Publicaţii rare - secrete de fabricaţie;
Fermentaţia
• Sistem de cultivare “batch”
• Păstrarea culturii – în azot lichid, cu efectuare periodică de teste de viabilitate;
• Inoculul – se transferă din flaskuri în fermentatorul din etapa pilor şi
de aici în cel din etapa de de fermentare ppropriuzisă periodic;
- în proporţie de 1 – 5% în volume
• În etapa de propagare celulară – se utilizează un mediu îmbogăţit pentru a
determina o creştere bună;
• În etapa de creştere logaritmică - compoziţia mediului este ajustată în funcţie de
producţia dorită
Figura 56. Obţinerea computerizată a datelor din procesul tehnologic în urma controlului
întregului sistem în vederea optimizării procesului de fermentaţie
72
Aplicaţii
Enzimele amilolitice
Generalităţi
• Utilizare: în procese
fermentative sau în alte
procese biochimice
• hidroliza amidonul solubil
şi granulele de amidon
aflate în suspensie apoasă
• hidroliza poate fi parţială sau totală – funcţie de gradul de hidroliză dorit se aleg
diferite amestecuri de enzime amilolitice;
• produşii finali rezultaţi exercită un efect de inhibiţie competitivă sau necompetitivă,
sau inhibiţie exponenţială simplă;
• Enzime:
α-Amilaza [E.C.3.2.1.1] sau glicogenaza sau α(1,4)-D-glucan
glucanohidrolază;
- acţionează asupra glicogenului, oligo- şi
polizaharidelor înrudite;
- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice interioare
β-Amilaza [E.C.3.2.1.2] sau glicogenaza sau α(l,4)-D-glucan
maltohidrolază
- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice marginale
surse de amilaze: - cartofi, cereale, fasole, soia, boabe de
orez, boabele de fasole germinate, pancreas şi la unele specii în salivă
- microorganismele: Bacillus subtilis,
bacterii,
drojdii, fungi
Modul de acţiune al enzimelor amilolitice
-amilaza
α(1,4)-glicozidică
β-amilaza
amiloglucozidaza
(glucoamilază)
glucozidaz
a
73
hidroliza enzimatică a amidonului se efectuează practic în două etape:
prima etapă – dextrinzarea - fragmentare rapidă a macromoleculelor
de amiloză şi amilopectină până la fracţiuni cu greutăţi moleculare mai mici –
dextrinele; amidonul se lichefiază
a doua etapă - zaharificare - dextrinele sunt hidrolizate complet la
oligozaharide şi apoi la maltoză şi glucoză în funcţie de compoziţia preparatului
utilizat; dextrina se dizolvă în apă
 Determinarea conţinutului în glucide reducătoare: după acţiunea α-amilazelor,

concentraţia în glucide reducătoare este de aproximativ 1/3 din concentraţia
iniţială a amidonului; după etapa a doua de hidroliză efectuată cu β-amilaze, dacă
hidroliza este completă, concentraţia în glucide reducătoare este egală cu cea a
amidonului
Biosinteza -amilazelor bacteriene:
• α-amilazele bacteriene sunt enzime termostabile;
• speciile din genul Bacillus şi anume Bacillus subtilis şi B. amyloliquefaciens, B.
lichenifonnis şi B. stearothennophilus;
• gradul de hidroliză calculat prin determinarea cantităţii de glucide reducătoare
obţinute în urma hidrolizei enzimatice raportate la cantitatea totală de substrat
(amidon) utilizat, este aproximativ acelaşi (20-25%)
• cultivată în sistem discontinuu, submers

• enzima este produsă în mod normal după ce a atins faza maxima de creştere şi
începe faza staţionară;
• nivelul de producere a enzimei este limitat de concentraţia sursei de carbon datorită
procesului de inhibiţie prin catabolit ) - demonstrat pe B. licheniformis.
• Bacillus subtilis – producerea este influenţată de particularităţile morfo-fiziologice
corelate cu potenţialul productiv al tulpinii
Figura 59. Dinamica acumulării -amilazei în culturi submerse de Bacillus subtilis. a) –

dinamica acumulării de biomasă; b) – dinamica activităţii enzimatice; c) – evoluţia pH-ului
74
Parametrii digstiei:
• starea fiziologică a microorganismului utilizat;
• potenţialul productiv al tulpinii folosite;
• compoziţia mediului de biosinteză;
• parametrii de biosinteză (temperatură, pH, viteză de agitare, viteza de aerare, durata
cultivării).
Biosinteza α-amilazelor cu tulpini modificate genetic
• studiile de inginerie genetică efectuate până în prezent au demonstrat posibilitatea
transferării genelor de la o specie la alta;
• cele mai des utilizate sunt bacteriile din genul B. subtilis ; se mai utilizează B.
sterothermophilus în B. subtilis
• atunci când genele -amilazei sunt donate în E. coli, ele se exprimă, enzima
acumulându-se în spaţiul periplasmatic;
• biosinteza α-amilazelor este influenţată de compoziţia mediului nutritiv şi de
condiţiile de cultivare a microorganismului
sursă de carbon - varietăţi de amidon, glicogenului, maltotetraozelor,
maltotriozele, maltoza (de cinci ori mai slabe decât la glicogen)
sursele de azot - săruri de amoniu, aminoacizi, cazeină
3 vitamine;
7 aminoacizi
• mediul de reacţie
făină de peşte, şprot de soia – mai multă protează decât α-amilază
mediu pe bază de amidon - α-amilaza
mediu se adaugă glucoză - biosinteza α-amilazei este inhibată parţial sau
total
• ionii de calciu şi amoniu
• temperatura de cultivare:
variază de la o specie la alta:
între 30 şi 370C pentru B. subtilis
între 50 şi 650C pentru B. coagulans şi B. stearothennophilus
• pH-ul optim:
 6,0 şi 7,5
controlat şi menţinut constant pe toată durata biosintezei
proteinele îmbunătăţesc capacitatea de tamponare a mediului
• proces intens aerob:
oxigenul insuflat o data cu aerul sterilizat este utilizat numai ca oxigen
dizolvat
cantitatea de oxigen este cu atât mai mare cu cât perioada
de creştere a unei generaţii este mai mică
• Proprietăţile fizico-chimice ale mediului de cultură:
vâscozitatea
tendinţa de spumare
Figura 60. Variaţia concentraţiei de

O2 dizolvat pe parcursul Figura 61. Influenţa logaritmică şi a debitului de
biosintezei aer asupra biosintezei -amilazei cu B. subtilis
75

Limbă

Introducere: 1. Ce Este Biotehnologia?

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Introducere: 1. Ce Este Biotehnologia?

Încărcat de

Drepturi de autor:

INTRODUCERE

-acum 10.000 de ani - creşterea plantelor agricole şi a animalelor pentru a obţine

1. în funcţie de tipul de celule cu care se lucrează: vegetale

-un bioreactor de 1, 2 sau 5 litri echipat cu instrumente de măsurare a parametrilor

Sistemică Alegerea culturii

Genetică Cultivarea celulelor

Fiziologie Răspunsul dat de celule

Chimie Recuperarea produsului

1. Alegerea culturii: selecţia, creşterea sau crearea de organisme sau populaţii

3. Răspunsul dat de celulă

Căile de biosinteză a constituienţilor celulari ai microorganismelor

- faza de creştere logaritmică;

Figura 2. Diferenţa dintre metabolismul primar şi secundar: a – creşterea celulelor şi biosinteza

Figura 3. Cinetica procesului de fermentaţie în timpul formării (a) metaboliţilor primari şi

Metaboliţii microbieni secundari

• sunt sintetizaţi de un număr mic de microorganisme;

Controlul sintezei enzimatice

Figura 7. Ciclul glioxilatului.

Figura 8. Reprezentarea schematică a schimbărilor

Controlul sintezei enzimatice

Eficienţa globală de creştere microbiană este discutată în

ATENŢIE! valoare scăzută a producţiei de creştere atunci

metan Methylomonas 17,5 1,46

xiloză Kelbsiella pneumoniae (A. 52,2 0,87

acid Pseudomonas sp. 23,5 0,98

Randamentul de creştere a celulelor depinde de următorii factori:

1. natura sursei de carbon;

7. statusul fiziologic al organismului – aproape toate microorganismele

8. natura substratelor care limitează creşterea – cea mai eficientă este

 “bioingineria” - se ocupă cu studiul bioproceselor din punctul de vedere al

Avantaj: monitorizarea permanentă a parametrilor creşterii

Materii prime Etapa de Etapa de Etapa de

• pregătirea mediului • biosinteza • separarea

produsului de cultură, propriu-zisă principal,

Figura 9. Reprezentarea schematică a unui proces biotehnologic

Criterii care permit calcularea mărimilor fizice ale sistemului

caracteristică - sistem de agitare performant  omogenitatea ; uniformitatea

Sisteme de cultivare a microorganismelor

Figura 11. Prezentarea sistemelor de operare continuă. S – substrat, C – celule

Bioreactoarele submerse pot fi:

Sisteme de cultivare a microorganismelor

- au fost primele sisteme de fermentaţie folosite;

- sunt utilizate mai mult în laboratoar pentru întreţinerea culturilor, decât

microorganismele se dezvoltă la atât la suprafaţă cât şi în interiorul

tipuri de bioreactoare : cu tăvi,

 sistem de operare utilizat (sistem submers/de

În funcţie de natura procesului biotehnologic

Au forme constructive şi moduri de operare variate, funcţie de tipul procesului tehnologic

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

după modul de introducere a energiei necesare

Figura 12. Bioreactoare cu agitare mecanică.

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Figura 13. Bioreactoare

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Figura 17. Bioreactoare

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

Bioreactoare cu agitare mecanică

Figura 19. Bioreactor cu

Figura 20. Tipurile de

Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe

 Amestecarea şi dispersia bulelor de aer – agitare mecanică;

- celule libere sau imobilizate şi

creşte coeficientul de transfer de masă

circulaţia lichidului este modificată prin