Leucemii

Conf. dr. Anca Colita

 Definitie
• Leucemiile sunt boli neoplazice caracterizate
prin proliferarea clonală a unor precursori
hematopoietici care prezintă anomalii ale
mecanismelor genetice responsabile de
diferenţiere şi proliferare.
Regenerative Medicine, 2006. 4
bone marrow

peripheral blood +/-

peripheral blood
 Leucemogeneza
• Proces in mai multe etape
• Anomalii la nivelul celulei stem sau a unei
celule progenitoare
• Proliferarea clonei leucemice cu blocarea
celulei in stadii timpurii de diferentiere
 Proposed schema for the role of genetic alterations in the pathogenesis of B-ALL.

Charles G. Mullighan Hematology 2012;2012:389-396

©2012 by American Society of Hematology

 Clasificare leucemii
• Clasificarea leucemiilor se face în funcţie de două elemente
caracteristice ale tipului celular:
– maturitatea celulei
– linia celulară
• Proliferarea de celule tinere, imature se numeşte leucemie acută, iar proliferarea
de celule mature se numeşte leucemie cronică.
• În funcţie de linia celulară care proliferează există 2 categorii principale
- leucemii limfoide şi leucemii nonlimfoide sau mieloblastice.
• Utilizând cele 2 criterii se descriu 4 categorii principale
– leucemii acute limfoblastice (LAL),
– leucemii acute mieloblastice (LAM)
– leucemii cronice granulocitare (LGC)
– leucemii cronice limfocitare (LLC)
 Clasificare leucemii

Acute Chronic

Myeloid Acute Myeloid

Leukemia (AML) Chronic Myeloid Leukemia (CML)
origin

Acute Lymphoblastic Chronic Lymphocytic Leukemia

Leukemia (ALL) (CLL)
 ALL CLL Lymphomas MM
naïve

B-lymphocytes

Plasma
Lymphoid cells
progenitor T-lymphocytes

AML Myeloproliferative disorders

Hematopoietic Myeloid Neutrophils
stem cell progenitor

Eosinophils

Basophils

Monocytes

Platelets

Red cells
 2008 WHO Classification of Tumors of
Haematopoietic and Lymphoid Tissues

Criteriile de clasificare
• Morfologie si caracteristici biologice
• Genetic
• Imunofenotip
• Caractere clinice

13
Clasificarea OMS A LAL (2016)
Teste de diagnostic specifice
pentru leucemii

15
 Examen morfologic
• 1976 - sistem unitar de clasificare, care reprezintă şi în prezent baza de diagnostic a
LA – clasificarea FAB.
– Conform acestei clasificări iniţial erau recunoscute 3 tipuri de LAL – L1, L2, L3 - şi 6 tipuri de
LAM.
• Limfoblaştii - celule mai mici, cu citoplasmă bazofilă, cantitativ redusă, fără
granulaţii, cu un inel perinuclear mai clar; nucleul este rotund-ovalar, uneori incizat,
materialul nuclear fiind omogen, cu nucleoli nedistincţi sau slab vizibili. Raportul
nucleo/citoplasmatic este crescut.
• Mieloblştii - au un raport nucleo/citoplasmatic mai scăzut, cromatina nucleară are
o dispoziţie fin reticulară, şi nucleolii sunt vizibili; citoplasma mai abundentă,
conţine granule azurofile care uneori acoperă întreaga celulă.
• În situaţiile în care diagnosticul morfologic nu permite stabilirea liniei celulare,
studiul citochimic este un criteriu adiţional pentru diferenţierea limfoblastului de
mieloblast.
• În aproximativ 80% din cazurile de LAL, limfoblaştii au reacţia PAS (Periodic Acid
Schiff) pozitivă, datorită conţinutului mare de glicogen citoplasmatic. Mieloblaştii
au reacţia PAS negativă, sau slab pozitivă (niciodată intens pozitivă).
 Immunofenotipare
• Fiecare populaţie de celule hematopoietice are
un repertoriu unic de proteine de suprafaţă.
• Pentru foarte multe din proteinele de suprafaţă
există anticorpi monoclonali. Deşi nu se cunosc
decât parţial funcţiile unora dintre aceste
proteine, putem utiliza o combinaţie de
anticorpi monoclonali pentru a defini acest
repertoriu unic al populaţiei celulare.
 Immunologic Classification

Lymphoid CD3, CD7, CD10, CD19, CD79

Myeloid M6/M7 CD41a, CD61, and CD42b

Lymphoid Vs. M0-M7

Immunohistochemistry

http://www.pathologystudent.com/?tag=acute-m
yeloid-leukemia
 Teste Genetice

Cariotip : aranjarea si clasifiacrea cromozomilor

dupa marime si forma
FISH: fluorecence in situ hybridisation – identifica
anomaliile cromozomiale (structurale sau
numerice) cu ajutorul unor sonde fluorescente
Polymerase chain reaction (PCR): identifica
anomalii moleculare cu ajutorul unor primeri
specifici
 Genetic Testing/Cytogenetics

Appelbaum, MD, Frederick R. Leukemia [Internet]. Version 5. Knol. 2008 Jul 28. Available from:
http://knol.google.com/k/frederick-r-appelbaum-md/leukemia/pOIC0j0O/gRxHJw
Leucemia acuta limfoblastica
 Leucemia acuta limfoblastica
• LAL - 75% din leucemiile acute la copil
• Varsta cu incidenta maxima 2 – 5 ani
 Conditii predispozante
Conditie Risc
Normal 1: 2880
Sdr Down 1:75
Expunere anterioara la ag. 1:20
alchilanti
Sdr Bloom 1:8
Gemeni cu LAL 1:5
Sdr Ataxie-teleangiectazie 1:8
Ataxia-Telangactasia
Sindrom Down
 Factori de risc

• Putine cazuri au cauze aparente identificabile

• Relatii cauzale posibile:
– Radiatii ionizante
– Benzen
– Expunere materna la marijuana
– Iradiere paterna preconceptie
– Pesticide
 Prezentare clinica
Simptome Semne
Febra 71% SMG 86%
Paloare ADM 76%
Purpura/Sangerari 51/27% HMG 74%
Dureri oase/articulatii 79% Durere sternala 69%
Masa / Dureri abdominale 62%
Anorexie/scadere ponderala
66%
Oboseala 92%
 Tablou clinic
• Sindrom infiltrativ medular
– Dureri osoase
– Anemie, trombocitopenie (sdr hemoragic),
neutropenie (sdr infectios)
• Sindrom infiltrativ extramedular
– Adenopatii
– Organomegalie
 Anomalii ale hemogramei in LAL

Leucocite < 10.000 10-50.000 >50.000

(/mmc) 44% 34% 22%

Hg (g/dl) <7,5 7,6-10 >10

46% 30% 24%

Tr. <20.000 20-100.000 >100.000

(/mmc) 20% 51% 29%
 Algoritm diagnostic
• Hemograma cu formula
• Identificare complicatii – sdr liza tumorala
– K, Ca, fosfor, acid uric, LDH
• PT/PTT/fibrinogen
• Rg torace – masa mediastinala
• MO – morfologie, imunofenotipare,
citogenetica, biologie moleculara
• PL
• Grup, RH
LABORATORY EVALUATION
 Clasificarea morfologica a LAL
Caractere morfologice L1 L2 L3

Dimensiunea celulei Mică Mare Mare

Cromatina nucleară Fină sau în grămezi Fină Fină

Forma nucleului Regulată, poate fi clivat Neregulată, poate fi clivat Regulată, ovală sau
rotundă

Nucleoli Nedistincţi sau invizibili Unul sau mai mulţi pe Unul sau mai mulţi pe
celulă; mare, celulă; mare,
proeminent proeminent

Cantitatea de citoplasmă Redusă Moderat abundentă Moderat abundentă

Bazofilia citoplasmei Redusă Redusă Intensă

Vacuolele citoplasmatice Variabile Variabile Proeminente

 LAL B
Marker HLA DR TdT CD19 CD10 cyIgM sIgM
proB: + + + _ _ _
5% copii
11% adulti
common + + + + _ _
65% copii
51% adulti
preB + + + +/- + _
15% copii
10% adulti
B matur + + + +/- - +
3% copii
4% adulti
 LAL T
Marker TdT cyCD3 CD7 CD1a/CD2/CD3 CD5
Pre T + + +
1% copii
7% adulti
T + + + +
11% copii
17% adulti
 Frequency of cytogenetic subtypes of pediatric ALL.

Charles G. Mullighan Hematology 2012;2012:389-396

©2012 by American Society of Hematology

 Anomalii cromozomiale in LAL B precursor
(BCP) ~ 70% din cazuri
Favorabile Nefavorabile
• Hiperdiploidie (51-65 cz) • t(9;22)/BCR-ABL1
• t(12;21)/ ETV6-RUNX1 • T(17;19)/TCF3-HLF
• t(1;19)/TCF3-PBX1 • 11q23/KMT2 rearanjari
• Near haploidy (23-31cz)
• Hipodipodie (32-39 cz)
• iAMP21
 BCP fara anomalii cromozomiale –
(B-other ALL)
• Ph-like sau BCR-ABL1-like ALL
• Rearanjari CRLF2 si mutatii Janus Kinase
• DUX4 si ERG
• Translocatii IGH
• Rearanjari PAX5
 Diagnostic diferential
• LAL/LAM/sdr mielodisplazice
• Anemia aplastica
• LMNH limfoblastic
• ARJ/RAA/LES
• Invadare medulara de tumori solide:
neuroblastom
• PTI
• Mononucleoza infectioasa
• Reactii leucemoide
 Factori de prognostic LAL
Factor risc Favorabil Nefavorabil
Varsta 1-10 ani <1an, > 10 ani
Sex F M
Rasa Alba Neagra
Nr. leucocite <50.000 >50.000
Afectare SNC Nu Da
Imunofenotip preB B matur, T
Nr cromozomi > 50 <45 (hipoploidie)
(hiperploidie)
Citogenetica Trisomie 4 si 10, t(9;22), t(4;11),
t(12;21) 11q23
 Principii de tratament
• Tratament de urgenta
– Corectare anemie
– Antibioterapie cu spectru larg
– Profilaxie sdr liza tumorala
– Tratament sdr hipervascozitate
• Tratament specific adaptat gradului de risc
 Tratament de urgenta
• Corectare anemie: masa Er izo gr, izoRh
• Neutropenie febrila: atb cu spectru larg
• Sdr liza tumorala: hiperuricemie, HK, HPO4, hCa,
IRA
– Hiperhidratare 3000ml/m2 + alcalinizare NaHCO3 8,4%
1-3 ml/kgC
– Inhibitor de xantinoxidaza: allopurinol
– Recombinant urat oxidaza: rasburicase
– In caz de IRA - hemodializa
• Sdr hipervascozitate: Leu >100.000/mmc
– Hiperhidratare, leukafereza terapeutica
 Tratament specific
• Obiectiv = obtinerea si mentinerea RC
• RC: <5% blasti in MO (ex morfologic)
• Boala minima reziduala(BMR)= totalitatea
celulelor restante la un anumit moment al
evolutiei - cel mai important factor prognostic
– Tenhici imunofenotipare multiparametrica
– PCR – identificarea anom cromozomiale
– Rearanjarea genelor pentru Ig
 Definirea răspunsului la tratament
Răspunsul la Prednison în LAL (z8)
– PPR: > 1000 blasti/mmc
Răspunsul la nivelul MO (z 14)
• M1 – sub 5% blaşti în MO
• M2 – blaşti 5- 25% în MO
• M3 – blaşti > 25% în MO
• Flow citometrie (FCM) <10%
Raspunsul in MO z 33, 78
- FCM <0,01%
 Etapele tratamentului
• Inductia RC
• Profilaxia SNC
• Consolidare
• Intretinere
 Tratment specific – risc crescut
• Allotransplant CSP de la donator familial sau
non-familial HLA identic
• Nu este o procedura simpla, fara riscuri si nu
asigura 100% vindecarea!
 BiTE®: technology that engages the body’s own
immune system to target malignant cells1
• T cells bind to antigens on the surface of target cells, inducing the release of Malignant
T cell
cytotoxic components2 cell

● However, malignant cells can evade destruction by

cytotoxic T cells by:3
• Impairing antigen presentation
• Blockade of T-cell receptor signaling T cell
Malignant
cell
• Activation of negative regulatory pathways
• Secretion of immunosuppressive factors

● Bispecific T-cell Engager (BiTE®) antibody constructs

form a bridge between T cells and target cells with the
Malignant
goal of overcoming malignant cells’ evasion of the T cell cell
immune system1 BiTE®

BiTE® = bispecific T-cell engager.

1. Baeuerle PA, et al. Cancer Res. 2009;69:4941-4944. 2. Leone P, et al. J Natl Cancer Inst. 2013;105:1172-1187.
3. Rabinovich GA, et al. Annu Rev Immunol. 2007;25:267-296.
 BiTE® antibody constructs: engineered by linking two variable
domains of two distinct monoclonal antibodies1

● Two distinct monoclonal Variable

domain
antibodies:1 for CD3

• One specific for a tumour BiTE®

antibody
associated antigen on targeted constructs

malignant cells
• The other specific for CD3,
which is part of the T-cell Variable
receptor complex on all T cells domain for
tumour
associated
antigen

BiTE® = bispecific T-cell engager.

1. Baeuerle PA, Reinhardt C. Cancer Res. 2009;69:4941-4944.

57
 BiTE® technology to treat patients
with ALL BLINCYTO®
CD3
T Cell

CD19

● BLINCYTO® binds to
● CD19, ubiquitously expressed on the surface of cells of B- T-CELL RECEPTOR

lineage origin, B Cell

● and CD3 expressed on the surface of T cells 1-3

T Cell

● BLINCYTO mediates the formation of a cytolytic synapse between the T

®

cell and the malignant B cell, releasing proteolytic enzymes to kill both
proliferating and resting target cells1
PERFORIN PORE

● The anti-tumour activity of BLINCYTO® immunotherapy is not dependent on

GRANZYMES

B Cell
T cells bearing a specific T-cell receptor or on peptide antigens presented by
cancer cells, but is polyclonal in nature and independent of human
leukocyte antigen (HLA) molecules on target cells 1
BLINCYTO®
T CELL

ALL = acute lymphoblastic leukaemia; BiTE® = bispecific T-cell engager.

1. BLINCYTO® (blinatumomab) Summary of Product Characteristics. 2. Nagorsen D, et al. Exp Cell Res. 2011;317:1255-1260.
CANCER CELL
3. Raponi S, et al. Leuk Lymphoma. 2011;52:1098-1107. 58
 BiTE antibody
• BITE are designed to eliminate the need for antigen processing by functionally replacing the MHC
class I/peptide/TCR complex

European training 20th – 22nd September 2016

BLINCYTO® binds to CD19, ubiquitously expressed on the surface of cells
of B-lineage origin1-3

Surface antigen expression throughout the B-cell life cycle4

Lymphoidstemcell Early B cells Intermediate B cells Mature

B cells

CD10

CD19

CD20

CD21

CD22

1. BLINCYTO® (blinatumomab) Summary of Product Characteristics. 2. Nagorsen D, et al. Exp Cell Res. 2011;317:1255-1260.
3. Raponi S, et al. Leuk Lymphoma. 2011;52:1098-1107. 4. Longo DL. Chapter 110. Malignancies of Lymphoid Cells
In: Longo DL, Fauci AS, Kasper DL, et al, eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 18e. New York, NY: McGraw-Hill; 2012.
60
What is a CAR?
CAR = a vehicle moving on wheels

1. Downregulation of MHC I
2. Escape mechanisms: production of
cytokine inducing apoptosis of
activated T cells

6 Business Use Only

 What is a CAR?
A hybrid!

part antibody and part T-cell receptor

• Extracellular antigen • Intracellular signaling

recognition domain domain
– Derived from – TCR
monoclonal antibody

62
 Adoptive T cell therapy: CAR-T cells
CAR-T cells (Chimeric antigen receptor-T
cells) Antigen specific
domain
T cells transduced with tumor-specific CAR
CAR: Single fusion molecule with antigen specificity
plus signaling domain
Three types of CAR: First/second/generations
Based on co-stimulatory receptors
Cancer: Solid tumor & hematological malignancies

Advantages of CAR T cells

Tumor recognition Multiple anti- Target variety of

independent of HLA tumor immuno- antigens (protein,
“Live drug”
(no HLA typing modulators can carbohydrate,
needed) be engineered glycolipid)

Maus M V et al. Blood 2014;123:2625-2635

 First CARs

64
Business Use Only
 From CARs to TRUCKs
T cells redirected to universal cytokine killing

Miliotou A, Papadopoulou L, Current Pharmaceutical Biotechnology 2018, 19, 5-18

Leucemia acuta mieloblastica
 Leucemia acuta mieloblastica
• 15-20% din leucemiile copilului
• Varf de incidenta la adolescenti
 ALL vs AML

ALL AML
• copii • adult[i
• M>F • M>F
• EFS > 80% copii • EFS 40% copii
• EFS f mic la adulti
 Factori de risc – predispozitie genetica
Gemeni identici Concordanta 100%
Sdr Down x 14
Anemie Fanconi 50% dupa varsta de 40
ani
Neurofibromatoza tip I
Sdr Kostmann Risc crescut cu varsta
Sdr Schwachmann-
Diamond
Anemia Blackfan-
Diamond
 Factori de risc - mediu
• Radiatii ionizante – x 10-20
• Expunere la substante chimice
– Consum matern de alcool
– Produse petrolifere, benzen
– Ierbicide, pesticide
• Expunere anterioara la citostatice
– Substante alchilante
– epipodophilotoxine
 Clasificarea FAB a LAM
Leucemie acută mieloblastică cu diferenţiere minima M0

Leucemie acută mieloblastică fără maturaţie M1

Leucemie acută mieloblastică cu maturaţie M2
Leucemie acută promielocitară M3
Varianta microgranulară
Leucemie acută mielomonocitară M4
Varianta cu eozinofile M4Eo
Leucemie acută monocitară M5
Leucemie acută monoblastică (slab diferenţiată)
Leucemie acută monocitară (diferenţiată)
Eritroleucemia M6
Leucemie acută megakarioblastică M7
 AML subtypes
M6

M1

M4 and M4eo

M3

M7
 Clasificarea OMS a FAB (2008)
Categorie

LAM cu anomalii citogenetice 1. LAM cu t(8;21)

recurente 2. LAM cu eozinofile anormale inv (16) sau
t(16;16)
3. LA promielocitara t (15;17)
4. LAM cu anomalii 11q23

LAM cu displazie multilineala 1. LAM secundar post SMD

2. LAM fara antecedente de SMD

LAM secundare 1. dupa agenti alchilanti

2. dupa inhibitori de topoizomeraza

LAM neincluse in celelalte LAM M0 – LAM 7 (clasificarea FAB)

categorii
Clasificarea OMS a LAM (2016)
 Prezentare clinica
• Febra
• Paloare
• Dureri osoase
• Hepatosplenomegalie
• Sdr hemoragic
• Adenopatii
• Determinari cutanate
• Hipertrofie gingivala
Sign/Symptom ALL AML
Fever 34% 61%
Bleeding 18% 48%
Adenopathy 50% 14%
Bony pain 50% 5%
Hipertrofie gingivala
 cloroame
• Sarcom granulocitic
– Localizare primitiva extramedulara a
celulelor mieloblastice
– Orice tesut sau organ poate fi afectat
 Tratament LAM
• Suportiv
• Chimioterapie – supravietuire fara evenimente
la 5 ani
– ~ 40%
• Transplant de celule stem hematopoietice –
rata de supravietuire fara evenimente 5 ani:
– ~ 50-60%
Leucemia cronica mieloida
 LMC
9 9q+
Ph  Afectiune a celulei stem
22 22q-
Translocation  Mieloproliferare

ABL
BCR BCR
ABL
 t(9;22), BCR-ABL

Transcription and translation

BCR-ABL fusion
Inhibition by protein
TKI
Constitutive tyrosine kinase

Phosphorylation of multiple substrates

Mitogenic signaling and genomic instability increased
Apoptosis and stromal regulation decreased

CML
 Leucemogeneza in LMC

• Consecință moleculară a t (9; 22),

proteina de fuziune BCR-ABL, are
activitate tirozin kinazina crescuta
• Proteina BCR-ABL transforma celulele
hematopoietice, astfel încât creșterea
și supraviețuirea lor să devină
independentă de citokine
• Acesta protejeaza celulele
hematopoietice de la moarte celulara
programata (apoptoza)
 Evolutia naturala a LMC

Acumulare de celule mieloide imature

Modificari citogenetice aditionale

Faza cronica Faza accelerata Faza blastica

Durata Netratata, 3-5 ani variabila ~ luni

Prognostic Rraspuns la tratament +++ Scadere raspuns la tratament Rezistenta la tratament

Simptome Asimptomatic Splenomegalie progresiva Sdr hemoragic

SAU Mielofobroza
oboseala Sdr infectios
scadere in greutate
durere abdominala
transpiratii nocturne

Radich JP, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:2794-2799. Sawyers CL. N Engl J Med. 1999;340:1330-1340.
Druker B, et al. Chronic leukemias. In: Cancer, principles, and practice of oncology. 17th ed. 2005.
 Diagnosis of CML

Sensitivity

Hematologic Cytogenetic Molecular

Karyotype FISH PCR

(Ph chromosome) (BCR-ABL fusion)

Peripheral blood Bone marrow Chromosomal translocation Abnormal BCR-ABL Abnormal BCR-ABL
(with myeloid t(9;22)(q34;q11) Red: BCR Lane 1: BCR-ABL+
(with myeloid hyperplasia) Green: ABL Lane 2: BCR-ABL-
cells) Yellow: fusion
 Clinic
• 40% asimptomatic
• Faza cronica
• Splenomegalie masiva
• Simptome legate de
hipermetabolism
– Scadere ponderala
– Anorexie
– oboseala
– Transpiratii nocturne
 Clinic

• Sdr anemic: Paloare, dispnee, tahicardie

• Funcție plachetara anormala: Echimoze, epistaxis,
menoragie
• Hiperleucocitoză
• Tromboză
• Guta, tulburări de vedere, priapism
 Aspecte hematologice
• Frotiu de sange periferic
– Anemia
– Leucocitoza (de obicei >25 x 109/L, frecvent> 100 x
109/L
– Formula leucocitara deviata la stanga, pâna la
mieloblast
– Bazofilia
– trombocitoza
 Maturatia mieloida

Mieloblast Promielocit Mielocit Metamielocit Nesegmentat Neutrofil

MATURATIE
Adapted and modified from U Va website
 Aspecte hematologice
• Maduva osoasa
– Hipercelular (reducerea
saptiilor grasoase)
– Myeloid:erythroid ratio
• – 10:1 - 30:1 (N: 2:1)
– Predominenta myelocitelor,
blasti ≤10%
– Megakaryocite crescute
numeric si displazice
– Fibroza reticulinica in 30-40%
 Tratament
• Suportiv, de urgenta • Specific, tinta biologica
– Citoreductiv - hydree – Inhibitori de tirozin
– Leucostazie kinaza:
• Hidratare – generatia 1 (imatinib),
• Allopurinol – generatia 2 (dasatinib,
• Leukafereza nilotinib)
– generatia 3