Tehnici de analiză a genelor

• Genele reprezintă substratul molecular al

eredităţii. Structura şi localizarea genelor în
genom controlează proprietăţile organismului.
Ca rezultat al interacţiunii genomului cu
diverşi factori ai mediului, în ADN se pot
produce mutaţii. Mutaţia poate modifica
metabolismul celular şi tisular, ceea ce
conduce la dezvoltarea stărilor patologice (boli
genetice).
 ac
us ela
nger)serişieig el.
e ADN. de Urmă
patru rind ba ndă cu ba ndă,
în Analiza
care ADN- secvulesiunii
enţei
este
determinarea
duale.
nd s pecordinea
succ
ific ă pentru una din baze . Prin
tificată
matriţei
tura
azotate)
roduş ADN
l or î niiAD
deNre. ADNpoate
e studiat,
dintr-un
acţi fianumit
realizată
în aşa
ină
eacuăADN.
nger) elacăi:
specific Urmăîn
şi gînel.Analiza
care ADN-poziţia
rindsecv care
ulenţei
ba ndă este
cu ba ndă,
tificată ordinea
ei baze
matriţei
tura ADN
l or î n AD
anumite.
N . ADNpoate studiat,
fi realizată
în aşa
ină
uă căi:specific în poziţia care
ei baze anumite.
 Tehnica Southern-blot

se bazează pe analiza specifică a unor fragmente de ADN

genic/genomic
obţinute prin secţionarea ADN-ului genomic cu una sau mai multe
enzime de restricţie. Ţinând cont că
enzimele de restricţie nu acţionează la întâmplare asupra ADN-ului,
dar clivează ADN-ul bicatenar
numai în anumite situsuri de restricţie, la utilizarea unei enzime de
restricţie se obţin fragmente de ADN
bicatenar cu o lungime diferită (numărul şi lungimea fragmentelor
de restricţie depind de harta de
restricţie pentru enzima utilizată)
• Luând în calcul polimorfismil ADN / polimorfismul
genic determinat de mutaţii punctiforme, ne
putem da seama că hărţile de restricţie la diferite
persoane se pot deosebi. Diferenţele dintre hărţile
derestricţie obţinute de la doi indivizi este numită
Polimorfismul Lungimii Fragmentelor de Restricţie
(RFLP – Restriction Fragment Lenght Polimorphism).
Acest polimorfism poate fi folosit ca marcher
genetic în evaluarea genotipului.
 Tehnica Southern-blot etape:
(1) extragerea din celule a ADN-ului genomic cu greutate moleculară mare;
(2) digestia enzimatică a ADN-ului cu diferite ER, fiecare producând fragmente de lungime diferită;
(3) separarea fragmentelor de restricţie prin electroforeză în gel de agaroză;
(4) denaturarea fragmentelor bicatenare cu o soluţie alcalină;
(5) transferul capilar al fragmentelor de ADN pe membrane filtre de nailon sau nitroceluloză;
(6) hibridarea cu sondele monocatenare radioactive;
(7) autoradiografia pentru vizualizarea hibrizilor ADN ţintă - ADN sondă şi interpretarea rezultatelor.
 TEHNICA WESTERN-BLOT
•
Această metodă constă în identificarea unei proteine
specifice din amestecul de proteine celulare.
Pentru aceasta, proteinele sunt separate prin electroforeză
în condiţii de denaturare. Proteinele separate după
greutatea moleculară sunt transferate pe filtre de nailon
sau nitroceluloză şi supuse tratării cu anticorpi specifici
marcaţi radioactiv sau fluorescent. Prin această metodă se
poate identifica prezenţa/lipsa proteinei,
dimensiunile ei, rata de expresie a genei.
 Tehnica PCR
•
poate fi utilizată pentru multiplicarea selectivă
a unei secvenţe de ADN genic. Ca rezultat, se
obţin populaţii omogene de fragmente care
pot fi utilizate în studiile de genetică
moleculară sau în diagnostic.
• Pentru a realiza amplificarea unei secvenţe este
necesară cunoaşterea structurii genei normale
sau mutante şi sinteza primerilor specifici
complementari capetelor fragmentului de
interes. Primeriireprezintă secvenţe
oligonucleotidice monocatenare de 20-30 baze
care sunt obţinute prin sinteză
artificială. PCR se bazează pe hibridarea ADN
ţintă - primer şi replicarea semiconservativă a
ADN.
 Hibridarea in situ
•
Hibridarea in situ reprezintă o tehnică moleculară, în care o sondă specifică marcată
poate identifica direct pe preparatele celulare:
(1) o genă pe un anumit cromozom sau fragment de cromozom;
(2) un ARNm într-o celulă particulară sau ţesut;
(3) numărul moleculelor de ARNm în dependenţă de perioada ontogenetică sau tip
tisular;
(4) ADN viral;
(5) deleţiile cromozomiale submicroscopice;
(6) genele responsabile de producerea cancerului, localizarea şi nivelul lor de expresie.
În ultimii ani se utilizează metoda FISH (Fluorescence In Situ Hibridization) care
utilizează
sonde fluorescent marcate. Metoda FISH este simplă, poate fi aplicată pe preparate
celulare arhivate,
este rapidă, nu modifică morfologia celulelor.
Metoda FISH (Fluorescence In Situ Hibridization)
care utilizează
sonde fluorescent marcate. Metoda FISH este
simplă, poate fi aplicată pe preparate celulare
arhivate, este rapidă, nu modifică morfologia
celulelor.