UNIVERSITATEA DE VEST “ VASILE GOLDIŞ”

ARAD
FACULTATEA DE MEDICINĂ
Analiza Western Blot

Prof coordonator : Asist. Univ. Dr. Covaci Aurelia

Studenti: Asma Daoudi
Ghiga Mirel- Ionel
Groza Rares-Marius
Jusca Loredana Ioana
Khadiri Zaid
Mot Luis Alejandro
Piros Andreea-Diana
 CUPRINS
1. INTRODUCERE
2. CONSIDERENTE GENERALE
2.1 Prepararea mostrei
2.2 Fracţionarea mostrei şi transferul pe o membrană
imobilizatoare
3. DETECTAREA
4. PREPARAREA ESANTIONULUI
5. SDS-PAGE
6. Trasnferul
1. Introducere
• Neurobiologia a evoluat rapid pentru a include modurile de
abordare neurochimice cât şi pe cele moleculare studiului
proteinelor.

• Analiza Western blot este cunoscută de asemenea drept

electroblotting (Towbin et al., 1979) sau imunoblotting
(Burnette, 1981) si este o determinare rapidă şi sensibilă care
combină rezoluţia electroforezei în gel şi principiile
recunoaşterii imunologice a unui antigen (de exemplu,
proteina) printr-un anticorp corespunzător.
2. Considerente generale
2.1 Prepararea mostrei

Pentru analiza Western blot trebuie să evitaţi degradarea

proteolitică şi copurificarea contaminanţilor, în timpul
optimizării extragerii proteinei ţintă. Proteoliza rămâne
principala preocupare în timpul fracţionării extractelor de celule,
deoarece multe metode de solubilizare eliberează protează
intracelulară care poate degrada polipeptidele ţintă
• Paşii pentru evitarea degradării includ păstrarea mostrei la 00C
sau mai rece dacă este posibil şi/sau adăugarea de inhibitori ai
proteazei soluţie liză tampon.

• Prepararea extractelor celulare se realizează de cele mai multe

ori prin liză enzimatică sau ruptură mecanică. Soluţiile tampon
pentru liză trebuie alese astfel încât extracţiile să rezulte într-o
cantitate suficientă de antigen, care a păstrat capacităţile sale
de legătură pentru anticorp, minimalizând în acelaşi timp
solubilizarea proteinelor de fundal.
• Majoritatea soluţiilor tampon conţin Tris, care permeabilizează
membrana celulară eliberând lipopolizaharidele stratului dublu
lipid, şi EDTA şi /sau reagenţi sulfhidrici, cum ar fi ditiotreitolul
sau ß-mercaptoetanolul, care intensifică mult acest efect.
• Pentru a concentra proteina relativă de interes, sunt luate în
considerare două metode:
- (1) fracţionarea celulelor sau (2) imunoprecipitarea.
• Fracţionarea celulelor realizată prin centrifugarea standard şi
tehnicile gradiente, este folositoare dacă proteina ţintă se ştie
că se asociază cu o anumită fracţiune celulară.
Imunoprecipitarea se bazează pe recunoaşterea stafilococului
auriu (Staph A) moleculele proteinei A pentru regiunea
constantă a anumitor clase de imunoglobuline
2.2. Fracţionarea mostrei şi transferul pe o
membrană imobilizatoare
Electoforeza în gel
- Separarea prin electroforeză în gel este o funcţie a trei parametri, şi
anume, mărimea, forma şi încărcătura netă totală a diferitelor
proteine.
- Acest sistem constă în două geluri apropiate, un gel de
descompunere mai mică şi un gel superior de stivuire într-o bucată
verticală de gel. Gelurile diferă în porozităţi, pH-uri şi forţe ionice,
care lucrează pentru a concentra mostra în gelul de stivuit.
- Mostra/eşantionul poate fi acum fracţionat şi greutăţile moleculare
individuale pot fi determinate (de exemplu prin pătarea gelului şi
compararea grupurilor cu markerii de greutate moleculară calibraţi).
Transferul de proteine din matricea de gel pe o membrană
imobilizată le face mult mai accesibile pentru analizele ulterioare
prin reagenţi adiţionali şi sonde, inclusiv anticorpi
Transferul de la gel la membrană

- Transferul proteinei de la gel la o membrană necesită

electroforeză în continuare şi poate fi realizată fie într-un bazin
umplut cu soluţie tampon sau făcut sandwich între un filtru de
hârtie înmuiat în soluţie-tampon, de unde şi termenii
descriptivi, „ud” şi „semiuscat”, ai transferului.

- Transferul cantităţilor suficiente de proteină ţintă către

membrană se poate realiza de asemenea alegând soluţia
tampon corectă.
2.3. Detectarea proteinei ţintă

Anticorpii
Anticorpii folosiţi vor depinde de mai mulţi factori inclusiv
disponibilitatea, costul şi obiectivul experimental. Trebuie să ţineţi
întotdeauna minte că proteinele reprezintă structuri complexe care
pot conţine numeroşi determinanţi antigenici distincţi sau epitopi,
iar succesul relativ al analizei Western blot este determinat de
abilitatea anticorpului de a recunoaşte epitopul (ii). Un epitop este
în mod normal format dintr-o secvenţă de proteină primară
specifică , o structură peptidică sau o structură specială rezultată
din modificări post translaţionale- adăugarea unui zahar, un acetil,
sau un reziduu fosfatic.
Dacă cineva încearcă să caraterizeze o proteină novel , anticorpul
va trebui să fie crescut în condiţiile centrului de cercetare pe
animale folosind protocoalele stabilite.
3. Detectarea
• Există câteva metode de vizualizare a benzii dumneavoastră de
interes în Western blot. Proteina A sau G etichetată i
• Proteinele din peretele celular având locuri specifice de
legătură în regiunile constante ale moleculelor
imunoglobulinei câtorva clase- lucrează destul de bine.
Acestea au fost deseori metodele de alegere datorită
capacităţii lor de a se lega de anticorpii multor specii diferite
cât şi pentru capacitatea lor de a menţine semnalul de fundal
la un minim prin optimizarea timpului de expunere la un film
autoradiografic
4. Prepararea eşantionului
Bacteriile
O analiză Western blot a tirozin
fosforilării în lizatul celular bacterian, de
exemplu BL21 (DE3). Expresia proteinei
ţintă este sub control. Pata a fost
sondată cu anticorp anti-fosfotirozin
monoclonal şi vizualizat cu
chemiluminescenţă mărită.
- Culoarul A: lizat de celule
(neindus:control);
- Culoarul B: lizat de celule (indus:
proteina este văzută ca o creştere a
semnalului tirozin fosforilării, de
exempli, săgeata). (Blot pus la
dispoziţie de N. Jolicoeur).
Tesut creier
O analiză Western blot de
sintează constitutivă oxid nitric
neuronală (nNOS) în creier de
şobolan. O intensitate a
semnalului liniar este văzută cu
un volum ridicat de proteine
citosolice cerebrale, de
exemplu, 20, 40, şi 80 µg de
proteine au fost încărcate pe
culoar. Portacavul de manevră,
o metodă folosită pentru
inducerea encefalopatiei
hepatice experimentale, duce la
niveluri crescute de proteine
imunoreactive cerebeloase
nNOS. Blot a fost cercetat cu
anticorpi monoclonali anti-
nNOS.
5. SDS-PAGE

se foloseste :
Mini Trans-Blot Cell unitate de 9 cm
• Modelul Bio-Rad 200/2.0 Power Supply
este foarte de încredere şi la preţuri
accesibile, şi oferă o opţiune constantă
curent, care este recomandată pentru
geluri de dimensiuni standard gelului).
•  Acest lucru este util pentru a limita
cantitatea de caldură generate în timpul
electroforezei. Această sursă de
alimentare vă oferă, de asemenea, o
opţiune constantă de tensiune, care
este recomandată pentru minigeluri
(20-30 V / cm de lungimegel).
SCOP :
Prezenta procedura precizeaza regulile sii responsabilitatile
pentru metoda de separare a proteinelor pe gel de
poliacrilamida SDS PAGE din probe lichide sau din probele din
care s-au extras proteinele.
Migrarea macromoleculelor aflate in solutie, in camp electric in
functie de sarcina electrica, marimea si forma lor se numeste
electroforeza.
 Principiul SDS-PAGE :
Aceasta metoda de electroforeza utilizeaza
pentru migrare un gel puternic hidratat
de poliacrilamida, a carui porozitate poate
fi reglata pentru a evita fenomenul de
sita moleculara a gelului. Solventul utilizat
pentru dizolvarea proteinelor contine un
detergent anionic numit dodecil sulfat de
sodiu, care se leaga de regiunile hidrofobe
ale proteinelor, cauzand despachetarea lor
si eliberarea lanturilor polipeptidice din
agregatele moleculare. Prin adaugarea la
solutia proteica a agentului reducator
puntile disulfurice dintre lanturile
polipeptidice ale unei proteine sunt rupte,
fiecare lant polipeptidic putand fi analizat
separat.
6.transferul
• Metoda electroforetică "Umedă" metoda de transfer (Towbin et al, 1979.) este
cel mai des folosită.

• În timp ce gelul se înmoaie în soluţia tampon de transfer, pregătiţi-vă

membranele şi hârtiile de filtru Whatman 3MM.

• Acestea ar trebui să fie tăiate la dimensiunea exactă a gelului, astfel încât

hârtiile de filtru pe fiecare parte a gel / membrana să nu atârne şi să intre în
contact. Acest lucr ar scurt circuita sistemul şi ar afecta transferul de proteine

• Asamblati casetă de transfer şi de preferinţă într-un recipient de plastic parţial

umplut cu un soluţie tampon de transfer, astfel încât hârtiile de filtru,
membranele, şi gelul să rămână umede. 

• Puneţi un pad de Scotch-Brite pe partea neagra a casetei de transfer. 

• Adăugaţi o bucată de hârtie Whatman 3MM, gel dumneavoastră, şi
membrana. 

• Asiguraţi-vă că nu există bule între gel şi membrana rulând încet o baghetă

de sticlă sau o pipetă Pasteur peste membrană, forţând orice bulă să iasă de
sub membrană.

• . Adăugaţi a doua bucată de hârtie Whatman 3MM şi celălalt pad de Scotch-

Brite

• . Închideţi caseta şi introduceţi-o în piesa de sprijin care o însoţeşte, cu

partea neagra a casetei înspre partea neagră a piesei de support.

• . Introduceţi întreaga unitate în aparatul de transfer, adăugaţi o bară

magnetică de amestecare, si umpleţi rezervorul de transfer cu soluţie tampon
de transfer.
• Aşezaţi rezervorul pe o farfurie şi ataşaţi firele (roşu la pozitiv).

• Transferaţi la 100 V (0,3 A), pentru aproximativ 1 h (sau 14 V peste noapte,

4 ° C). Scoateţi gel din casetă şi pătaţi-l /marcaţi-l cu Ponceau S-timp de 5
minute pentru a confirma eficienţa de transfer şi faptul că cantităţi egale de
proteine au fost încărcate în toate benzile.

• Proteinele migrează spre polul pozitiv pe membrana imobilizatoare Filtrul de

hârtie oferă un flux uniform al soluţiei tampon prin gel.

• Săgeţile indică bule de aer prezente sau formate în timpul transferului de

mostre din gel la membrana.

• Prezenţa de bule interferează cu eşantionul de transfer şi pot afecta grav

detectarea în cazul în care bulele sunt situate la nivelul culoarului de interes.
Detectarea 

 Zonele nespecifice de pe membrană sunt blocate prin

incubarea membranei cu o soluţie salină Tris-tamponată
(TBS), care conţine lapte praf 5% timp de 2 ore (25 ° C)
sau peste noapte (4 ° C). 
 Soluţia de blocare este îndepărtată şi se adaugă anticorpi
primari ( diluarea corespunzătoare este, de obicei,
furnizată de producător), în TBS care conţine lapte
praf1%.Membranele minigel pot fi incubate în doar 5 mL
(pungă de plastic) sau 10 mL (recipient de plastic). Mai
multe membrane pot fi blocate şi / sau cercetate dintr-o
dată pentru a minimaliza costurile de pregătire ale
anticorpilor. Incubaţi pe un agitator-tavă pentru cel puţin 1
h. Scoateţi soluţia de anticorpi şi după trei clătiri rapide,
spălaţi în membrana în TBS-Tween (3 x 10 min).
Adăugaţi cea de-a doua soluţie de anticorpi secundari
(TBS care conţine lapte praf 1%) şi incubaţi cu
amestecare cel puţin 1 h. Îndepărtaţi soluţia şi clătiţi din
nou, rapid membrana de trei ori şi spălaţi-o în TBS-Tween
(3 x 10 min).Complexul de proteine-anticorpi este apoi
vizualizat, de exemplu, prin chemiluminescenţă
îmbunătăţită (ECL: Amersham). 
Într-o cameră obscură, amestecaţi volume
egale ale celor două soluţii furnizate în set
( Cat. Nr. RPN 2106 :5 ml este suficient
pentru o membrană minigel).
 Acoperiţi membrana cu soluţie şi incubaţi
timp de 1 min. Îndepărtaţi soluţia deoarece
poate fi refolosită de mai multe ori, păstraţi-
o pentru incubările ulterioare (depozitaţi la
întuneric).
 Acoperiţi membrana în SaranWrap,
asigurându-vă că aţi eliminat toate
bulele. Expuneţi la film într-o casetă de
aproximativ 15 s. Scoateţi filmul, şi în cazul
în care aveţi nevoie de mai mult expunerea
imediat expuneţi la o altă bucată de film. 
Nu folosiţi bucăţi întregi de film! Tăiaţi
filmul în fragmente de lucru pentru a
minimaliza costurile. Developaţi filmul şi
reexpuneţi, dacă este necesar.
  Vă puteţi normaliza datele prin sondaj pentru o proteina de menaj pe
acelaşi test Western blot. 
 Două proteine citoskeletol, α-tubulină-şi ß-actina, sunt foarte abundente în
creierul mamiferelor şi sunt adesea folosite pentru normalizarea datelor
obţinute din extractele de creier.
 În anumite circumstanţe, atunci când integritatea proteinei citoskeletol este
alterată, este mai bine să utilizaţi glyceraldehyde-3- fosfat dehidrogenază ca
marker
 .Pur şi simplu incubaţi pata în soluţie tampon de stripare pentru 30 min (60 °
C) După stripping,pata se spală cu TBS-Tween (2 x 10 min, RT).
 Pata este apoi blocată şi cercetat cu un anticorp specific pentru una din
genele de menaj.
 Îndepărtarea problemelor comune
 Problemele apărute în timpul
analizei Western blot nu sunt
predominante, deşi numeroşii
paşi implicaţi în analiza Western
Blot cresc şansele de a întâlni cel
puţin una dintre ele.
  Vom discuta despre unele dintre
cele mai evidente probleme,
inclusiv despre transferul slab de
proteine (sau nu), semnalul slab,
sau zgomot de fond mare.
 Discuţiile cum ar fi cele
prezentate de Bjerrum et
al. (1988) şi Bio-Rad (1996) sunt
mult mai complete.
 Un semnal slab sau pierderea semnalului (a se vedea figura 5.) indică faptul că o cantitate
insuficientă a eşantionului a fost încărcată în gel, sau faptul că transferul de la gel la membrana a
fost afectat. 
 Verificaţi cantitatea de proteine de pe membrană prin colorarea cu o pata reversibilă, cum ar fi
Ponceau S.
 În cazul în care proteina nu s-a transferat, verificaţi (1) orientarea gelului / membranei în caseta
dumneavoastră de transfer sau (2), sursa de alimentare, şi (3), asiguraţi-vă că procentul corect de
acrilamidă gel a fost utilizat pentru a oprimiza transferul. 

 Dacă aceasta este primul dumneavoastră gel, aţi putea introduce o membrană pe fiecare parte a
gelului pentru a vă asigura că nu pierdeţi proteina în timpul transferului. 

 Este posibil ca timpul de transfer să nu fi fost suficient sau că setarea de putere să fi fost prea
mică. 
 Creşteţi-le pe ambele, dar asiguraţi-vă că menţineţi sistemul rece deoarece generarea de căldură
creşte odată cu timpul şi / sau cu puterea. 
 Eficienţa de transfer poate fi mărită prin scăderea procentului de acrilamidă sau prin adăugarea de
SDS la soluţia tampon de transfer
 CONCLUZIE

• Metoda Western blot este una din metodele de bază utilizate în laboratoarele de biologie celulara și
moleculară.
• Folosită corect, această metodă duce la rezultate ușor de interpretat, unice, lipsite de ambiguitate, care pot
fi utilizate ca atare sau în completarea altor metode de imunomarcare, în cercetare sau în diagnosticul de
laborator.
• Cu ajutorul metodei Western blot putem deduce diagnosticul următoarelor patologii:
 Diagnosticul infectiilor virale: Confirmarea testelor HIV in cazuri neconcludente,Hepatita B,
Confirmarea testelor FIV la feline, in medicina veterinara
 Diagnosticul infectiilor bacteriene: Boala Lyme
 Diagnosticul infectiilor parazitare: Protozoare (Toxoplasma gondii), Viermi (Trichinella spirallis)
 Diagnosticul unor boli prin detectarea proteinelor umane specifice acestora: Encefalopatia
spongiforma bovina (boala Creutzfeldt-Jakob), Distrofii musculare, unele forme de cancer.
 Bibliografie

1. Alwine J, Kemp D, Stark G (1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer
to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". Proceedings of the National
Academy of Sciences USA. 74 (12): 5350–5354. Bibcode:1977PNAS...74.5350A.
doi:10.1073/pnas.74.12.5350. PMC 431715. PMID 414220.
2. Burnette WN. (1981). "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl
sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and
radioiodinated protein A". Analytical Biochemistry. 112 (2): 195–203. doi:10.1016/0003-
2697(81)90281-5. ISSN 0003-2697. PMID 6266278.
3. Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels
to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". Proceedings of the National Academy of
Sciences USA. 76 (9): 4350–54. Bibcode:1979PNAS...76.4350T. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. PMC
411572. PMID 388439.
4. Sudha, T; Lakshmi, S; Teja, VD (2006). "Western blot profile in HIV infection". Indian Journal of
Dermatology, Venereology and Leprology. 72 (5). doi:10.4103/0378-6323.27752. PMID 17050930.
5. Gilda, J. E.; Gomes, A. V. (2013). "Stain-Free total protein staining is a superior loading control to β-
actin for Western blots". Analytical Biochemistry. 440 (2): 186–8. doi:10.1016/j.ab.2013.05.027. PMC
3809032. PMID 23747530.