INGINERIA GENETICĂ ȘI

BIOTEHNOLOGIILE

Prof. Corina Sersea

Colegiul Agricol ”Gh. Ionescu-Sise ști” Valea Călugărească
 INGINERIA GENETICĂ
Ingineria genetică reprezintă un ansamblu de metode de lucru prin care se
manipulează materialul genetic la nivel molecular și celular. Astfel se
obțin microorganisme, plante și animale reprogramate genetic, în al căror
genom sunt incluse gene străine, utile, exprimabile și transmisibile stabil
la descendenți.
 Metodele și tehnicile ingineriei genetice permit fie introducerea în
patrimoniul genetic al unei celule a uneia sau mai multor gene noi, “de
interes”, fie modificarea expresiei unei/unor gene prezente, deja, în celulă și
constau în adăugarea, eliminarea sau rearanjarea secvenței de nucleotide din
molecula de ADN.
 Cunoștințele și tehnicile ingineriei genetice au putut fi reunite și puse la punct
în urma progreselor determinante realizate în virusologie (cercetări pe
bacteriofagi), bacteriologie (investigații asupra bacteriilor și plasmidelor), în
genetica moleculară (cod genetic) și în enzimologie (enzime de restricție).
Istoric
 Istoria ingineriei genetice își are rădăcinile în vremurile preistorice, de când omul a
selecționat diferite specii de organisme pe care le-a crescut și cultivat artificial în scopul
obținerii diferitelor produse.
 1906 – anul oficial de naștere al geneticii.
 1938 – este utilizat pentru prima dată termenul de ”inginerie genetică”.
 1945 – Erwin Schrodinger emite ipoteza că informa ția genetică pentru sinteza
proteinelor este în acizii nucleici.
 1951 – se realizează secvențierea primei proteine.
 1953 – F.H.C. Crick, J.D. Watson și M.H.F. Wilkins descoperă structura spațială a
ADN.
 Sanger stabilește structura completă a proteinei insulină.
 1958 – este stabilită replicarea semiconservativă a ADN.
 1963 – Marshall Nirenberg și Gobind Khorana descoperă codul genetic care explică
modul de funcționare a materialului genetic.
 1960 – Stewart Linn și Werner Arber descoperă enzime de restricție (endonucleaze) în
Escherichia Coli; acestea segmentează ADN în locuri specifice și interven ția lor lasă
capete ”lipicioase” în molecula de ADN, făcând posibilă ata șarea altor fragmente de
ADN.
 1967 – sunt izolate ADN-ligazele – enzime care determină sudarea capetelor moleculei
de ADN.
 1970 – se reușește refacerea unei plante pornind de la o celulă vegetală fără perete celular
(protoplast).
 1972 – Paul Berg obține primul ADN recombinat ”in vitro” la eucariote – premiul Nobel 1980.
 1973 – Herbert Boyer și Stanley Cohen inserează cu ajutorul endonucleazelor ADN într-o
plasmidă (ADN circular din citoplasma bacteriilor) pe care o utilizează pentru transformarea
genetică a unei bacterii.
 1977 – Frederick Sanger determină secvența bazelor azotate ale genomului virusului ɸX174
 1977 – s-a descoperit că la eucariote genele sunt constituite din introni și exoni.
 1978 – Louise Brown realizează nașterea primului copil ob ținut prin fertilizare in vitro.
 1979 – insulina este produsă artificial.
 1982 – se demonstrează că genele pot fi transferate de la o specie de plante la alta pentru
îmbunătățirea nutriției, creșterii și rezistenței la îmbolnăviri a acestora.
 1983 – se nasc primele ”himere” interspecifice.
 1990 – James Watson și colaboratori ini țiază proiectul de alcătuire a mapei genomului uman.
 1991 – prima terapie genică umană.
 1993 – Richard Palmiter și Ralph Brinster plasează genele pentru hormonul de cre ștere într-un
șoarece care va deveni un adult de două ori mai mare ca talie, decât cea a speciei.
 1995 – a fost secvențiat genomul bacterian
 1997 – primul miel clonat prin implantarea unui ovul rezultat din transferul unui nucleu dintr-o
celulă donor de la o oaie adultă într-un ovul anucleat – oaia Dolly.
 1998 – se descoperă la oaia Dolly îmbătrânirea prematură a celulelor.
 2001 – este secvențiat genomul uman.
TEHNICI UTILIZATE ÎN INGINERIA GENETICĂ

Ingineria genetică utilizează tehnologia ADN recombinat, metode de cultură in vitro a celulelor
și țesuturilor animale și vegetale. Pe aceste metode se bazează hibridarea somatică la plante și
animale, haploidia prin androgeneză și ginogeneză experimentală, precum și clonarea. 
 II.1 Tehnologia ADN recombinat
 Această tehnologie grupează tehnicile care permit sinteza chimică sau izolarea genelor unor
organisme, urmată de inserția (transferul) acestora în genomul unor celule apar ținând altei
specii. Gazda va copia ADN-ul străin inserat artificial și-l va transmite descenden ței. Rezultă
astfel organisme reprogramate genetic.
 Avantajul acestei tehnici constă în faptul că poate depă și barierele de specie (poate transfera
ADN-ul de la o specie la alta).
 Etapele acestei tehnologii sunt: sinteza genelor, izolarea ADN-ului corespunzător unei
anumite gene; construirea unor molecule de ADN hibride; transferul de la o specie la alta.
 ADN-recombinat (ADN-rec) este molecula de ADN în care secvențele de gene nu sunt în
ordine naturală, ci juxtapuse prin manipulare in vitro. Aceasta se realizează prin integrarea
unui fragment de ADN de la un organism (ADN-insert) într-un vector de clonare.
 Principalii vectori de clonare sunt: plasmide bacteriene, bacteriofagi, cosmide (plasmide
hibride care conțin factorul cos de la bacteriofagul ʎ ,virusuri, drojdii ( cromozomii artificiali
de tip YAC sau HAC), ADN-T și enzime specifice.
Metoda plasmidelor

a). Sinteza genelor

 Dacă se cunoaște secvența de aminoacizi dintr-o proteină, se poate realiza, pe baza codului genetic,
sinteza de ARNm corespunzător, iar apoi sinteza genei respective de ADN. Se poate produce pe
această cale gena pentru o proteină.
b). Izolarea genelor unor organisme (genele de interes)
 Se utilizează enzimele de restricție (endonucleaze)-”bisturie moleculare” extrase de la diferite specii
de bacterii, unde au fost identificate peste 150 astfel de enzime; fiecare dintre ele recunoaște o
anumită secvență din molecula de ADN. La acest nivel restrictaza taie ADN, prin hidroliza
legăturilor dintre nucleotide, în așa fel încât lasă niște prelungiri monocatenare ale fragmentelor de
ADN. Aceste prelungiri se numesc ”capete lipicioase”, deoarece se asociază instantaneu cu secvențe
complementare. Capetele pot fi egale sau inegale (sticky); este de preferat obținerea de capete inegale
 Fragmentele de ADN rezultate sunt supuse electroforezei și ca urmare vor migra după încărcătura lor
electrică.
c). Transferul genelor de la o specie la alta
 - Sinteza unei gene sau izolarea unei gene este indiscutabil o victorie în plan știin țific, dar rămâne
fără ecou practic, dacă gena nu va fi introdusă într-o celulă unde să func ționeze. Gena străină
funcționează doar dacă este introdusă în materialul genetic al ”celulei gazdă”. Celulele au mijloace
prin care să recunoască și să distrugă un ADN străin cu ajutorul enzimelor de restric ție. Deci
pentru a transfera o genă, trebuie găsită o metodă de a ”înșela” vigilența celulei- țintă.
 Pentru aceasta se asociază gena cu un vector. Vectorul este o structură genetică pe care gena o
recunoaște și o acceptă, un fel de ”cal troian”. Vectorii utilizați sunt plasmidele și virusurile.
 Se acționează și asupra vectorului (plasmid) cu aceea și enzimă de restric ție (endonuclează) și
acesta va deveni linear; va avea la capete secvențe monocatenare, complementare cu cele ale genei
care urmează a fi transferată. Gena și vectorul vor fi amestecate în prezen ța enzimei ADN ligaza,
sub acțiunea căreia se vor reface legăturile tăiate de endonuclează.
 Gena și vectorul formează o structură genetică nouă, un ADN recombinat. Acesta se introduce
într-o cultură de bacterii. Deoarece nu toate bacteriile au acceptat încorporarea ADN recombinat
se aplică tehnici de eliminare a celulelor ”necontaminate”.
 Organismele care au primit gene de la alte specii se numesc organisme transgenice.
 Procesul de introducere în celula bacteriană a unui plasmid recombinat și de replicare a acestuia în
descendență, cu menținerea și funcționarea genei străine de-a lungul generațiilor celulare se numește
”clonare moleculară”.
 Din rândul vectorilor pentru transferul genei de interes face parte și ”cromozomul artificial de
drojdie-YAC”. Este cel mai util vector molecular pentru transferul de gene umane în celulele de
drojdie. Aceste celule sunt utilizate preferențial ca celule-gazdă, deoarece este un eucariot și are
toată ”mașinăria” necesară de sinteză a proteinelor de tip eucariot.
 YAC conține o regiune corespunzătoare centromerului și capetele cromozomului- telomerele; gena
de interes se inserează între centromer și telomere. Secvențele cromozomului artificial YAC sunt:
 Originea replicării autonome-ARS
 Două secvențe telomerice-TEL- originare de la un cromozom de Saccharomyces cerevisiae
 O secvență centromerică CEN, necesară pentru comportarea normală a cromozomului în timpul
diviziunii celulare.
 Cromozomii de tip HAC sunt cromozomi artificiali umani, având caracteristici similare celor de
tip YAC.
 ADN-T (ADN-transferred) este un segment al plasmidului Ti de la specii de Agrobacterium
 prezintă capacitatea de a integra gene de la alte specii (exogene) și care poate fi transferat în celula
vegetală (transferă gene ) de la bacterii la plante.
 În practică sunt utilizate plasmidele Ti de la A.tumefaciens (provoacă tumori în zona coletului de la
plante) și plasmidele Ri de la A.rhisogenes (induc formarea de rădăcini adventive la nivelul nodului
tulpinii de la castraveți sau tomate, atunci când epiderma este ruptă).
Metoda vectorului viral
 Este asemănătoare metodei plasmidului, dar genele sunt inserate direct în genomul unei celule prin
intermediul unui virus.
 Segmentarea ADN viral și ADN ce trebuie introdus este realizată cu endonucleaze, sudarea celor două
segmente de ADN este realizată cu ajutorul ligazelor, iar separarea prin centrifugare (pe baza diferențelor
de greutate moleculară) sau electroforeză.
 Deosebirea fundamentală este că secvențele responsabile de efectele patogene ale virusului trebuie
eliminate în prealabil pentru a nu îmbolnăvi celula gazdă.
 Dacă acest lucru este realizat, virusul cu ADN recombinat este eliberat în orgnismul țintă unde își va
insera genomul și va începe exprimarea. Tehnica poate fi folosită în tratarea unor maladii genetice. În anul
1971 C.R.Merril, M.R.Geier și J.C.Petricciani de la Cancer Institute din Bethesda (SUA) au transferat gena
gal implicată în sinteza galactazei pentru metabolizarea galactozei, de la bacteria Escherichia coli în
hepatocite umane, cu ajutorul bacteriofagului ʎ.
 Metoda împușcării cu particule învelite cu gene este utilizată la plante pentru
introducerea unor gene, ca cele pentru rezistența la insecticide sau la atacul dăunătorilor.
 Prin această metodă mici particule de metal (tungsten, argint) sunt placate cu ADN și sunt percutate în
celule, de unde sunt ulterior transportate în nucleu și utilizate de celule.
 Deși nu este la fel de precisă ca cele descrise anterior, totuși s-a dovedit eficientă.
 Microinjecția
 Utilizează micropipete din sticlă care ”înțeapă” membrana celulară și sunt introduse genele în citoplasmă,
de unde vor pătrunde în nucleu. Această tehnică se poate aplica numai în celule de dimensiuni mai mari
cum sunt ovulele.
  
 Folosind tehnica ADN recombinat, gena pentru sinteza insulinei a fost izolată din celula
umană (ADN insert) și a fost integrată într-un plasmid bacterian, ob ținându-se un plasmid, respectiv
o bacterie modificată genetic; a urmat multiplicarea (clonarea) acestora și obținerea de insulină în
mediul de cultură.
 Transferul genelor nif (gene fixatoare de azot)- numeroase specii de bacterii și alge albastre-verzi pot
fixa azotul atmosferic. Diverse plante, ca leguminoasele trăiesc în simbioză cu aceste bacterii și pot
utiliza astfel azotul atmosferic. Fixarea azotului se realizează cu un complex enzimatic denumit
nitrogenaza de la Clostridium pasterianum, alcătuit din 2 molecule proteice:
 O moleculă mare (proteina MoFe) și o moleculă mică (proteina Fe). Genele nif se găsesc pe
cromozomul bacterian în apropierea genei his (gena pentru sinteza histidinei). S-a reușit transferul
genelor nif de la bacteria Klebsiela pneumonie la bacterii înrudite (Escherichia coli, Salmonela, etc.)
 Genele nif au fost transferate și în protoplaști la drojdia de bere. Se urmărește transferul genelor nif
în genomul plantelor superioare sau în ADN plastidial.
 BIOTEHNOLOGIILE

 Ingineria genetică a permis aprofundarea cunoștințelor despre structura și funcțiile materialului

genetic și a dus la dezvoltarea unui domeniu nou numit BIOTEHNOLOGIE.
 Biotehnologiile constau de fapt în utilizarea bacteriilor, levurilor și celulelor animale și vegetale
de cultură, al căror metabolism și capacitate de biosinteză sunt orientate spre fabricarea substanțelor
specifice; ele permit să se tragă foloase în plan tehnologic de pe urma proprietăților și capacităților
microorganismelor și culturilor celulare.
 Produsele biotehnologiilor moderne sunt utilizate în:
 industria farmaceutică- obținerea insulinei umane, a hormonului de creștere, interferon, factorii VIII
și IX implicați în coagulare, angiotensina II, eritropoetina, în culturi celulare de bacterii; se folosesc
bacterii din specia Escherichia coli.
 în terapia genică- genele răspunzătoare de producerea unor boli sunt înlocuite cu gene normale; se
aplică în bolile canceroase, fibrozei chistice, HIV;
 obținerea plantelor și animalelor transgenice.
 
 II.2 Hibridarea somatică la plante – Biotehnologia vegetală
 Se realizează cu ajutorul protoplaștilor, celule în care s-a distrus peretele celular prin tratamente
enzimatice (exemple: celulaza, pectinaza). Drept urmare, fiecare celulă va fi perfect izolată de
celelalte, permițând efectuarea experimentelor.
 Protoplaștii pot fi izolați din orice organ al plantei. Ei manifestă totipotență, având capacitatea să
regenereze plante întregi, prin cultivarea pe mediul artificial in vitro (exemplu mediu solid de agar-
agar).
 Fiind lipsiți de perete celular protoplaștii pot fuziona spontan sub influența anumitor substanțe
(nitrat de sodiu, polietilenglicol, ioni de calciu). După fuzionarea celulelor, fuzionează nucleii, se
reface peretele celular și începe diviziunea celulară. După circa trei săptămâni se formează calusuri
de culoare verde, care încep să crească (celule nediferențiate). După o reprogramare genetică anumite
celule ale calusului devin veritabile ”semințe artificiale”, numite embrioni somatici.
 Pentru a regenera plantele, calusurile se transferă în medii speciale de diferențiere și formează
rădăcini
 În urma hibridării somatice rezultă hibrizi interspecifici asemănători cu cei obținuți prin hibridarea
sexuată.
 Avantajul hibridării este acela că se pot obține hibrizi celulari între specii
diferite care în mod normal nu se pot încrucișa sexuat. Un exemplu este cazul
amfiploizilor de tutun (2n = 42 cromozomi) obținuți din două specii de tutun:
Nicotiana glauca (2n = 24 cromozomi) și Nicotiana langsdorfii (2n=18
cromozomi).
 Hibrizii obținuți înglobează numărul de cromozomi ai celor doi părinți.
 Alte avantaje ale utilizării protoplaștilor sunt: înmulțirea vegetativă foarte
rapidă în urma căreia rezultă clone; obținerea unor forme poliploide ce vor fi
utilizate în ameliorare; inducerea de mutante; transferul de gene sau
cromozomi în protoplaști; transferul de cloroplaste în protoplaști; obținerea
unor plante rezistente la viroze, etc.
 
II.3. Haploidia prin androgeneză și ginogeneză experimentală
 Este o altă metodă de cultură in vitro.
 Androgeneza constă în reprogramarea informației genetice a microsporilor (grăunciorilor de polen),
în culturi in vitro. Ulterior, prin diviziuni repetate, rezultă plante haploide (conțin doar jumătate din
numărul de cromozomi ai speciei).
 Există două tipuri de androgeneză:
 directă, care se realizează prin embriogeneză (din microspori se obțin embrioizi, care prin diviziuni
repetate formează plante haploide);
 indirectă, care se realizează prin organogeneză (din calus, prin diferențiere, se formează țesuturi și
organe, și ulterior, plante haploide).
 Factorii cu o importanță deosebită în reușita androgenezei experimentale sunt: vârsta anterelor,
mediul de cultură, hormonii, temperatura și lumina.
 Plantele haploide obținute prin androgeneză prezintă următoarele avantaje: sunt pure genetic, sunt
folosite pentru obținerea liniilor izogene (sunt homozigote pentru toate genele), sunt utilizate pentru
producerea de soiuri noi și de hibrizi ce manifestă fenomenul heterozis; ajută la identificarea rapidă a
mutațiilor recesive și la inducerea unor mutații artificiale.
 Androgeneza experimentală constă în obținerea de plante prin cultura in vitro a grăuncioarelor de
polen, prin reprogramarea informației genetice din nucleul acestora. Din microspori se vor dezvolta
direct sau via calus embrioni somatici. Aceștia se transferă pe medii proaspete cu o balanță hormonală
care favorizează organogeneza.
 Ginogeneza constă în reprogramarea informației genetice a macrosporilor (sacilor embrionari) în
culturi in vitro. Astfel, dintr-un nucleu haploid, prin diviziuni repetate, se vor forma plante haploide.
 Deoarece plantele haploide astfel obținute sunt sterile, ele sunt diploidizate (prin tratamente cu
colchicină și transformate în plante izogene) și apoi utilizate în diverse experimente.
II.3. Hibridarea somatică la animale- Biotehnologia animală

 Primele încercări au fost făcute în anul 1960 de către Georges Berski și colaboratorii săi, care au folosit
celule de șoarece aparținând la două linii diferite, cultivate în amestec; ei au descoperit că acestea pot
fuziona și forma celule hibride. Aceste celule prezintă caracteristici morfologice, fiziologice și
biochimice diferite de cele ale celulelor fuzionate, dar înglobează numărul total de cromozomi ai
genitorilor.
 Hibridarea celulară, la animale, reușește dacă sunt rezolvate două impedimente:
 - găsirea unui agent inducător care să grăbească fuzionarea celulelor; este utilizat virusul Sendai
inactivant;
 - selectarea celulelor hibride din cultură; s-au găsit medii de cultură selective în care celulele hibride
se multiplică, iar celulele genitorilor sunt eliminate.
 O dată îndeplinite aceste condiții, are lor fuzionarea celulelor somatice diferite și formarea
heterocarionului.
 Ulterior, are loc fuzionarea nucleilor, urmată de diviziuni mitotice succesive. În final, se formează
celulele hibride somatice. Aceste celule nu pot regenera organisme animale hibride. Ele formează
clone celulare hibride, la care sunt eliminați preferențial cromozomii uneia dintre speciile genitoare.
Astfel, în culturile celulare hibride om-șoarece, se elimină o parte din cromozomii umani. Drept
urmare, în descendența hibridă există o variație semnificativă a numărului de cromozomi.
 Importanța practică a acestui fenomen constă în faptul că pot fi realizate hărți cromozomale umane,
care permit o identificare precisă a genelor normale și mutante pe cromozomi.
 Celulele hibride care conțin restructurări cromozomale sunt testate ulterior, pentru prezența sau
absența enzimelor specifice. Astfel, sunt identificate cu precizie genele ce determină apariția
maladiilor ereditare umane.
 Celulele hibride rezultate din fuziunea de linii celulare diferite au fost utilizate în producerea
interferonului. Interferonul este o proteină produsă în mod natural de către celulele fibroblaste și
leucocite infectate cu virusuri, ca o măsură de împiedicare a răspândirii virusului în celulele vecine,
sănătoase. Dar interferonul are și proprietăți anticanceroase. S-a încercat producția sa în culturi de
fibroblaste; dar cultura de fibroblaste producătoare de interferon funcționează pe o perioadă limitată
de timp. Biotehnologia celulară modernă a oferit soluția acestei probleme- celulele umane HeLa sunt
celule transformate malign cu proprietatea de a se divide nelimitat. Au fost realizați hibrizi celulari
somatici între fibroblaste producătoare de interferon și celule HeLa. Asemenea hibrizi celulari
somatici se numesc HIBRIDOMA.
 Ei pot fi menținuți nelimitat în cultură, prin împrospătarea periodică a mediului de cultură.
II.4. Clonarea organismelor
 Reprezintă un ansamblu de procedee prin care se cultivă o singură celulă și se obține o colonie de
celule identice, prin diviziuni mitotice succesive. Clonă este și totalitatea indivizilor care rezultă prin
reproducerea asexuată sau vegetativă a unui organism.
 În urma clonării rezultă celule și organisme pure, identice, ce provin dintr-un singur părinte.
 La plante (care prezintă fenomenul de totipotență), clonarea se realizează prin androgeneză și
ginogeneză. La animale, se realizează transplantul de nuclei străini în ovule la care s-au îndepărtat
nuclei.
 Metoda clonării prezintă avantajul că, de la un singur organism adult, se pot obține copii perfect
identice, din punct de vedere genetic, ale organismului donator.
 În anul 1937 savantul german Spemann a demonstrat că nucleii rezultați prin mitoze succesive ale
nucleului zigotului sunt echivalenți genetic până în stadiul de 16 nuclei (4 diviziuni mitotice
succesive). Utilizând un fir de păr de cal cu care a ștrangulat un ovul fecundat de triton și a realizat un
”buzunar” embrionar în care a lăsat să intre unul din cei 16 nuclei. Spemann a tăiat la un moment dat
legătura buzunarului de restul embrionului, constatând că din acest buzunar s-a dezvoltat un
embrion normal. După cele 4 diviziuni citoplasma nu mai susținea dezvoltarea pe această cale a unui
triton normal, iar nucleii nu mai erau totipotenți. Spemann a primit premiul Nobel pentru
demonstrarea totipotenței nucleilor în primele 4 diviziuni de clivaj ale zigotului și a rolului
citoplasmei în dezvoltarea embrionară.
 Ulterior s-au realizat experiențe de reconstrucție a embrionilor de șoarece din embrioni cu trăsături
genetice distincte. Asemenea șoareci s-au numit alofenici - șoareci cu fenotip reconstituit din
fenotipurile unor părinți diferiți.
 În anul 1964 John Gurdon a dovedit că nucleul oricărei celule somatice la broasca cu gheare Xenopus laevis poartă
întreaga informație genetică necesară realizării unui organism, caracteristică denumită totipotența nucleului celulei
somatice.
 Spre deosebire de plante la animale clonarea nu se poate realiza cu celule somatice. Aceasta resupune obligatoriu
utilizarea unui ovul. Din ovul cu ajutorul unei microseringi se scoate nucleul (ovul enucleat). În acesta se introduce
nucleul diploid, prelevat prin microchirurgie, dintr-o celulă a corpului (epidermă, epiteliu intestinal, etc.). Astfel, se
reconstituie garnitura dublă de cromozomi nu pe calea fecundației, ci prin transplant de nucleu diploid dintr-o celulă
somatică într-un ovul enucleat.
 Ovulul evoluează spre embrion și dă naștere unui organism care are întreaga informație genetică de la individul care a
donat nucleul.
 În 1997 la Institutul Roslin din Edinborough (Scoția) a fost realizată prima clonare a unei oi- oaia
Dolly.