PARAZITOLOGIE MEDICALA

AN UNIVERSITAR 2015-2016

1 LP 5
 CARACTERELE GENERALE ALE
FUNGILOR (DEFINITIE,
MORFOLOGIE, CLASIFICARE).

LEVURI DE INTERES MEDICAL

(CANDIDA, CRYPTOCOCCUS).

2
CARACTERELE GENERALE ALE
FUNGILOR

 Definitie:

Fungii sunt :
 bioentitati microscopice,
 eucariote,
 uni- sau pluricelulare,
 heterotrofe,
 contin chitina in peretele celular.

3
MORFOLOGIE

 Se bazeaza pe:
 aspectul si

 structura partii asimilatoare a fungului- talul,

 permite descrierea a 3 tipuri principale de fungi:

 Levuriformi

 Filamentosi

 Dimorfici

4
1. Fungi levuriformi:

 microorganisme unicelulare,
 de forma rotunda sau alungita,
 se multiplica in principal prin burjeonare;
 burjeonul- denumit blastospor sau blastoconidie,
 fie se poate desprinde de celula-mama printr-un proces

de fisiune,
 fie ramane atasat la aceasta si genereaza succesiv noi

indivizi, sub forma unor agregate liniare – pseudohife.

5
2. Fungi filamentosi:

microorganisme pluricelulare,

cu talul alcatuit din filamente tubulare, septate sau nu,

denumite hife;

hifele sunt de obicei ramificate si aglomerate formand

miceliul.

6
3. Fungi dimorfici:

microorganisme care apar

 sub forma de levuri in tesuturile organismelor

parazitate sau la 370C in vitro

si

 sub forma filamentoasa cand sunt cultivate la

temperatura camerei sau la 300C, pe medii uzuale.
7
LEVURI DE INTERES MEDICAL
GENERALITATI
 Levurile sunt fungi unicelulari care se multiplica vegetativ
(asexuat)
 fie prin burjeonare,

 fie prin fisiune.

 Habitatul lor natural este extrem de diversificat.

 Levurile sunt intalnite la:

 plante,
 insecte,

 animale si om (pe piele, mucoase si in tractul digestiv),

 in sol,

 apa (dulce si sarata),

8
 aer.
 Au caracter ubicuitar.

 Levurile de interes clinic sunt

 microorganisme aerobe sau facultativ anaerobe,

 mezofile si

 acidofile.

 Temperatura optima de cultivare variaza

 pentru marea majoritate a levurilor intre 250C si 300C,

insa
 cele patogene tolereaza si temperaturi de 370C.

9
IDENTIFICAREA LEVURILOR

 1. Examenul microscopic direct al produselor patologice:

 preparat extemporaneu intre lama si lamela cu solutie

20% KOH (scuame, fragmente unghiale, secretii linguale,
vaginale);

 preparat extemporaneu cu sol 20% KOH + substanta

fluorescenta sau frotiu colorat cu aceeasi substanta
fluorescenta (Calcofluor); necesita microscopie in lumina
ultraviolet;

10
 preparat extemporaneu cu tus de India (pune in evidenta
levurile capsulate din genul Cryptococcus, in sedimentul
LCR, urinar);

 frotiu colorat Gram (pune cu usurinta in evidenta

filamentele, pseudohifele;

 frotiu colorat May Grunwald-Giemsa (este coloratia de

rutina pentru depistarea levurilor intracelulare de tip
Histoplasma);

11
12
2. Cultivarea pe medii de izolare

Ingeneral, insamantarea prelevatelor se face pe Agar

Sabouraud aditivat cu cloramfenicol;

acest mediu
 permite o buna dezvoltare a levurilor si

 suprimă multiplicarea eventualelor bacterii

contaminante.

13
 Levurile de interes medical se dezvolta in 24-72 h de incubare.

 pentru prelevatele provenind din situsuri in care in mod

normal temperatura este identica cu cea a organismului se
va alege temperatura de 370C pentru incubare;

 in cazul prelevatelor provenind de la nivelul tegumentelor

sau unghiilor, incubarea se va face atat la 370C cat si la
300C deoarece, unele levuri cultivabile la 300C dar
necultivabile la 370C, pot avea semnificatie clinica, fiind
cauza unor micoze superficiale.

14
 Coloniile pot imbraca diverse aspecte in functie de genul si
specia in cauza.

 In general,
 au forma rotunda,
 sunt bombate si
 nu prezinta pigment.

 Suprafata poate fi
 neteda,
 uneori neregulata,
 cu margini fin franjurate si
 au aspect umed sau uscat.

 Consistenta este
 pastoasa,
 mucoida sau
 cerata.
15
 3. Teste de identificare

 Algoritmul de identificare a unei tulpini levurice se

bazeaza pe o combinatie de:
 caractere microscopice

 caractere de cultură

 caractere biochimice

 caractere genetice

16
a)obtinerea si examinarea preparatelor extemporanee cu tus de
India

pe o lama de sticla curata si degresata se etaleaza o picatura de

tus in care se suspensioneaza apoi cu ajutorul unei anse
microbiologice un mic fragment din colonia levurii de identificat;

se acopera cu o lamela si se examineaza la microscop cu

obiectiv X20 (X40);

observarea unor levuri rotunde sau ovoidale, inconjurate de un

halou necolorat, clar, pe fond brun –negru, indica prezenta
capsulei.
17
b)testul de filamentare (testul de blasteza sau germ-tube test)
ca medii pentru blasteza se utilizeaza serul sanguin de cal, serul
sanguin uman;

Tehnica:
se prepara suspensia levurica in solutie salina fiziologica,
densitatea acesteia ajustandu-se la 0,5 Mc Farland (cca.105-106
celule /ml) ;

in fiole cu capacitatea de 2 ml se pun in contact 0,5 ml

suspensie levurica si 0,5 ml ser sanguin de cal;

fiolele se mentin apoi in baia de termostatare la 360C timp de

2h.
18
 Dupa expirarea celor 2h, fiolele se agita si din fiecare
amestec se preleveaza un volum de 25µL care se etaleaza
apoi intre lama si lamela.
 
 preparatul extemporaneu astfel obtinut se examineaza la
microscop in vederea decelarii tubilor germinativi
caracteristici tulpinilor de Candida albicans si Candida
dubliniensis-filamente scurte care emerg din blastospori
fara strangulare;

19
 ca martor al filamentarii, se utilizeaza de fiecare data o
tulpina tip de Candida albicans;

 si alte levuri pot produce formatiuni similare de tipul

pseudofilamentelor, insa ele se diferentiaza de adevaratii
tubi germinativi prin existenta unei strangulari la locul de
emergenta din blastospor.

20
TESTE BIOCHIMICE

a)fermentarea zaharurilor
utilizarea metabolica a zaharurilor este utila in
diferentierea diverselor specii apartinand genului Candida;

b)capacitatea de asimilare a surselor de carbon

abilitatea levurilor de a creste pe diverse medii in
prezenta anumitor substante chimice adaugate ca unica
sursa de carbon, poarta numele de auxanograma;

21
c)capacitatea de asimilare a surselor de azot
important pentru diferentierea levurilor apartinand genurilor
Cryptococcus si Rhodotorula;

d)producerea de ureaza
pune in evidenta capacitatea levurilor de a produce enzima
numita ureaza (ex. Cryptococcus);

22
e)rezistenta la cicloheximida
testul se refera la abilitatea levurilor de a se dezvolta pe medii
de cultura continand doua concentratii de cicloheximida- 0,01
%, repectiv 0,1%;

f)producerea de fenol-oxidaza
permite identificarea speciei de Cryptococcus neoformans pe
baza unei reactii de culoare ce determina o brunificare a
mediului in aproximativ 24h de incubare la 30 0C;
 

23
g)producerea altor enzime
este evidentiabila prin cultivarea levurilor pe medii
cromogene;
 

h)teste rapide de identificare a unor specii de levuri:

latex-aglutinare (exemplu: pentru C.dubliniensis- BICHRO-
DUBLI, Fumouze)
asimilarea trehalozei.

24
TEHNICI MOLECULARE
 se bazeaza in principal pe amplificarea si
secventializarea unor regiuni unanim prezente in
genomul levurilor;

 regiunile tinta sunt amplificate prin PCR cu ajutorul a

doua secvente nucleotidice cunoscute, denumite amorse.

25
 GENUL CANDIDA

26
 Cuprinde peste 160 de specii, de ex.:
 C.albicans,

 C.parapsilosis,

 C.glabrata,

 C.kefir,

 C.krusei,

 C.tropicalis s.a.

27
 C. albicans este comensală a cavităţilor naturale (în special
gură, intestin, vagin).

 Alte specii se întâlnesc atât pe mucoase, cât şi la nivelul

pielii sănătoase.

 Sunt levuri oportuniste; produc infecţii când apar deficienţe

ale mecanismelor de apărare (nespecifică şi specifică) ale
gazdei.

 Determină candidoze cu localizare superficială sau

profundă.
28
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

 Produsul patologic recoltat: variază în funcţie de localizarea

leziunilor.

 recoltarea scuamelor din leziunile cutanate se face cu pensa;

 din leziunile mucoasei, cu ajutorul tamponului steril;

 prelevarea prin raclarea unghiilor la limita dintre zona

sănătoasă şi cea infectată.

 recoltarea sputei, l.c.r., urină se face în recipiente sterile.

29
 Transportul produsului patologic:

 trebuie efectuat rapid (max 1h), datorită multiplicării

rapide a levurii.

30
Examen direct, microscopic, se practică:
în stare proaspătă, lamă-lamelă (materii fecale, urină);

după clarificare cu solutie de hidroxid de potasiu 20% sau cu

solutie cloral-lactofenol (scuame, unghii);
după colorare (frotiu, preparate histologice).

 
Se pot observa:
 Levuri circulare sau rotunde, cu diametrul de

2-6 μm, înmugurite.

 Pseudofilamente (excepţie C. torulopsis, care nu

filamentează).

31
 Cultivare

 Cultivă sub formă de levuri pe mediul Sabouraud (cu

antibiotice), formând colonii albicioase, după 24-48 ore.

 Temperatura de cultivare este de 26ºC sau 37ºC după

localizarea superficială sau profundă a infecţiei.

32
 Identificare

 -se face pe baza caracterelor morfologice

 macro- si microscopice,
 biochimice si
 genetice.

 Testul de filamentare este pozitiv pentru Candida albicans si

Candida dubliniensis.

33
 Antifungigrama permite stabilirea sensibilităţii la
antifungice:

 Fluconazol,
 Itraconazol,
 Amfotericina B,
 Nistatina,
 Flucitozina,
 Ketoconazol,
 Miconazol,
 Econazol.
34
 GENUL CRYPTOCOCCUS

35
 Cuprinde levuri capsulate al caror habitat natural este
reprezentat de mediul ambiant.

 A fost izolat din excrementele păsărilor domestice (în special

porumbei) şi sălbatice, precum şi din solul îngrăşat cu
acestea.

 Contaminarea este predominant aerogena.

36
 Specia cea mai importanta din punct de vedere a
implicarii in aparitia infectiilor criptococice este C.
neoformans; celelalte specii sunt mai rar semnalate.

 C. neoformans interesează, în special, persoanele

imunodeficiente (HIV pozitive sau cu hemopatii
maligne), la care produce cel mai frecvent meningite.

37
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
 Produse patologice: l.c.r., urină, puroi, biopsie.

 Examen microscopic: levuri; se evidentiaza capsula.

 Levuri sferice, înmugurite, cu diametrul de 3-8μm, înconjurată
de o capsulă groasă.
 Nu formează filamente sau pseudofilamente.

38
 Cultivare:

 Cultivă pe mediul Sabouraud,

 incubat la 37ºC,

 în timp de 3-5 zile.

 Coloniile de C. neoformans sunt foarte mucoase, de culoare

bej.

39
 Identificarea se face pe baza caracterelor morfologice
 macro- si microscopice,

 biochimice si

 genetice.

 Cryptococcus spp. produc urează.

 Antifungigrama permite stabilirea sensibilităţii la antifungice.

40
 FUNGI HIALINI NESEPTATI
(ZYGOMICETE DE INTERES
MEDICAL)

FUNGI HIALINI SEPTATI

(ASPERGILLUS)

41
CARACTERELE GENERALE ALE
FUNGILOR HIALINI NESEPTATI
(ZYGOMICETE DE INTERES MEDICAL).

Fungii hialini neseptati (zygomicetele) se caracterizeaza:

Macroscopic prin:
 aspectul lânos al coloniei,

 culoare alb-cenusie,

 crestere rapida, invaziva;

Microscopic: prin prezenta miceliului neseptat, format din

hife hialine, cu diametru neregulat.
42
INMULTIREA:

 Asexuata:
 este asigurata de endospori produsi in interiorul unor
structuri numite sporocisti (sporangi);

 sporocistiicontin sporangiospori, care sunt eliberati in

mediul ambiant prin dehiscenta peretelui sporocistului;

 filamentul micelian care sustine sporangele se numeste

sporocistofor (sporangiofor),

 jonctiunea dintre cele doua elemente este cunoscuta sub

denumirea de apofiza.
43
44
 Sexuata:

 se realizeaza prin:
 homotalism (intre structuri apartinand aceluiasi individ)
 heterotalism (intre structuri ale unor indivizi diferiti)

 se materializeaza prin formarea zigosporilor (spori sexuati).

45
HABITAT:
 sol,
 materie organica in descompunere,

 fructe,

 boabe de cereale,

 resturi de alimente.

46
PATOGENIE:

 Fungii familiei Mucorales:

 Absidia, Rhizopus, Mucor, Rhizomucor

 determina infectii pentru pacientii imunodeprimati

 infectii cutanate si viscerale profunde (forme rino-

cerebrale, pulmonare, gastro-intestinale, diseminate)

 prognostic nefavorabil pentru marea majoritate a

pacientilor. 47
 Fungii familiei Entomophthorales:

 Conidiobolus, Basidiobolus,

 determina infectii la pacienti imunocompetenti,

 infectii localizate in tesutul subcutanat,

 prezinta un prognostic favorabil.

48
PRODUSE PATOLOGICE:

 aspirat bronsic in infectii respiratorii,

 raclaj sau biopsie in micoze cutanate (frecvent la

nivelul fetei),

 LCR in zigomicoza rino-cerebrala,

 frecvent de la persoane diabetice.

49
EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECT:

 preparate microscopice de tipul frotiurilor colorate

Gomori sau cu calcofluor,

 se vizualizeaza:
 filamente miceliene largi, pana la 25 μm grosime,
 cu diametru neregulat,
 ramificate in unghi drept.

50
CULTIVAREA PRELEVATELOR:

 pe medii uzuale, fara adaos de cicloheximida,

 temperatura de incubare recomandata este de 370C.

51
IDENTIFICAREA GENURILOR SI A
SPECIILOR:
 Caractere de cultura:
 colonii lânoase, cu crestere rapida, de culoare alb-cenusie,
 la suprafata se observa sporocistii sub forma de granule
gri-negre.

52
 Caractere morfologice:

 pot fi urmarite prin:

 preparat extemporaneu cu scotch in albastru-lactoferol,

 dilacelarea miceliului cu ace in albastru-lactoferol,

 se urmaresc detaliile morfologice pentru stabilirea

genului.

53
Genul Rizoizi Sporangiofor Sporocist Apofiza Sporangiospori
ramificat

Rhizopus ++ nu sferic + Angulari, striati

Absidia + da piriform ++ Rotunzi-ovoizi,

netezi

Rhizomucor + da sferic _ Rotunzi-ovoizi,

netezi

Mucor _ da sferic - Rotunzi-ovoizi,

netezi

54
 FUNGI HIALINI SEPTATI
(ASPERGILLUS)

55
Generalitati:
Termenul de „hialin” se refera la lipsa pigmentului brun-
negricios de la nivelul hifelor, in vivo.

Habitat:

 sol,
 aer,

 plante.

56
 Genuri:
 Aspergillus

 Penicillium

 Fusarium

 Acremonium

57
 Examenul microscopic direct:

 se efectueaza pe prelevate in stare proaspata, cu sau fara

colorare prealabila (calcofluor, Giemsa):
 biopsii (frotiuri prin amprenta),

 sputa (dupa tratare cu N-acetil-cisteina),

 hemoculturi,

 prelevate superficiale- cutanate, sinusale, conjunctivale,

unghiale, auriculare.

 elementele morfologice frecvent identificabile sunt

fragmentele hifale, fine (3-12μm diametru), regulate, septate,
ramificate dicotomic in unghi ascutit (450). 58
ASPERGILLUS FUMIGATUS

59
ASPERGILLUS FUMIGATUS

60
 Cultivarea prelevatelor:

 Mediu PDA (potato-dextrose-agar) sau agar cu malţ-

medii elective pentru fungi filamentosi,

 Mediu Agar Sabouraud cu cloramfenicol,

 Mediu Agar Czapek- mediu selectiv pentru Aspergillus.

61
 Incubare:

 370C pentru prelevate profunde,

 300C pentru prelevate superficiale,

 Aspergillus fumigatus poate creste la 450C.

62
 Caractere de cultura:

 Aspergillus fumigatus: colonie albastra-verzui inchis, uneori

pigment rosu

 Aspergillus niger: suprafata coloniei neagra (datorita

capetelor aspergilare), aspect granular

 Aspergillus flavus: colonie galben-verzuie, aspect granular

63
ASPERGILLUS NIGER

64
 Penicillium spp: colonii cu crestere rapida, pufoase,
galbene, albe, verzi sau rosiatice in functie de specie

 Fusarium spp: colonii lanoase, de culoare roz

 Acremonium spp: colonii catifelate, de culoare alb-galbui

sau roz

65
GENUL ASPERGILLUS

 din punct de vedere morfo-structural, fungii acestui gen

se caracterizeaza prin prezenta unor formatiuni de
fructificare cu aspect particular, cunoscute sub
denumirea de capete aspergilare.

 la nivelul acestor structuri se formeaza sporii asexuati

sau conidiile.

66
 In functie de randul de celule conidiogene, capetele
aspergilare pot fi:

 uniseriate (un singur rand de celule conidiogene –

fialidele) sau

 biseriate (doua randuri de celule conidiogene-metule

+ fialide).

67
 Speciile genului Aspergillus pot fi:

 uniseriate (prezinta doar capete aspergilare uniseriate),

 uni-biseriate (prezinta in aceeasi cultura atat capete

aspergilare uniseriate, cat si biseriate) sau

 biseriate (prezinta doar capete aspergilare biseriate).

 

68
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

1.Recoltarea produselor patologice trebuie făcută cu

precauţie pentru a limita contaminarea.

Produse patologice:
 aspirat bronsic: aspergiloza pulmonara invaziva,
aspergiloza bronhopulmonara alergica,
 secretie din punctie sinusala,
 LCR,
 raclaj tegumentar,
 sange in endocardita.

69
Transportul probei se face imediat.
2.Examenul direct poate releva:

 filamente miceliene, septate, cu diametru de 2 – 4 μm,

ramificate dihotomic (în aspiratul bronşic, lavaj
brohopulmonar, etc.),

 capul aspergilar (în otite, sinuzite).

Aspergillus
fumigatus

70
3.Cultivare:

Aspergillus se dezvoltă pe mediu Czapek, mediu Sabouraud

cu gentamicină sau cloramfenicol.

Apariţia rapidă, în 2 – 3 zile, de colonii caracteristice,

permite diagnosticul de gen.

Aspergillus fumigatus

71
4.Identificare:
Identificarea speciei se face pe baza caracterelor
microscopice si de cultura.

5.Antifungigrama: permite stabilirea sensibilităţii la

antifungice.

72