Universitatea “Dunărea de Jos” Galaţi

Spitalul Judeţean “Sf. Apostol Andrei” Galaţi

Specializarea Laborator farmaceutic

Citotoxicitatea determinată de acțiunea

metalelor grele

Rezidenți: Farm. Alexandra-Mariana Ionescu Coordonator Rezidențiat: Șef Lucr. Dr. Farm. Denisa Batîr Marin
Dr. Farm. Mihai Tudor
 Identificarea unor metode rapide de dozare a metalelor grele și
înțelegerea mecanismelor prin care acestea produc citotxicitate drept
Scop consecință a tendinței de acumulare în organismul animal și uman,
datorat consumului de alimente de origine vegetală sau animală.

Introducere

Intoxicația cu metale grele determină o serie de afecțiuni patologice. Lipsa unei evidențe clare asupra
cantități de metale grele pe care omul le ingeră, ca urmare a consumului de alimente, este un indicator important
asupra efectelor nefaste pe care aceste elemente le pot avea.
Alimentele de origine vegetală, constituie un element de bază al lanțului alimentar. Elementele absorbite de
plante, provenite din sol, pot fi transportate la straturile superioare ale lanțului alimentar. Prezența în sol al unor
elemente toxice precum: arseniu, cadmiu, crom, mercur și plumb, poate determina transferul acestor elemente în
lanțul trofic. Astfel prin mecanisme de absorbție, biotransformare și bioacumulare, plantele au impact asupra
consumatorilor, în special oamenilor, ca utilizator final [32].
Obiectivele studiului

I. Identificarea metodelor experimentale de dozare a metalelor grele din diferite surse alimentare.

II. Identificarea mecanismelor prin intermediul cărora metalele grele provoacă citotoxicitate.

III. Metode rapide de evaluare a citotoxicității determinate de expunerea cronică la metale grele

IV. Identificarea mecanismelor de acțiune a diferitelor specii de metale grele ce pot declanșa boli cronice
neurodegenerative incurabile (Alzheimer, Parkinson, Scleroză multiplă).

V. Rolul protector al seleniului în intoxicația cu metale grele

 Metode experimentale de
dozare a metalelor grele din
diferite surse alimentare
Spectroscopie de masă cuplată
inductiv (ICP-MS)
Spectrometrie de absorbție atomică
(AAS)
Spectrometriei de masă cuplată
inductiv (ICP -SFMS)
Spectrometrie de absorbție atomică
(AAS)
- Dozare a reziduurilor de Ni, Cd, As și Pb
- Probe de legume și pește
- Rezultatele obținute arată că în cazul probelor de origine vegetală, As,
Cd și Pb se acumulează în țesuturi peste limitele impuse de legislație,
în timp ce în cazul probelor de origine animală nu a fost identificată
aceeași tendință [18]
- Dozare a reziduurilor de Pb, Cd, Cu și Zn
- Probe de suc din fructe
- Rezultatele au arătat că probele respectă legislația europeană în ceea ce
privește limitele maxime admise, eventualele depășiri ale
concentrațiilor ne având semnificație statistică [21]
- Dozare a reziduurilor de Al, As, Cd, Hg , Ni și Pb
- Probe de lapte de vacă, capră și brânză
- Rezultatele au arătat că probele respectă legislația europeană în ceea
ce privește limitele maxime admise cu excepția Pb, date obținute cu
ajutorul ICP -SFMS
- În cazul determinărilor efectuate cu ajutorul AAS s-au identificat
concentrații mai mari de Cd și Pb în laptele de capră, în timp ce în
probele de lapte de vacă s-a observat tendința de acumulare a Ni [34]
 Mecanisme prin intermediul
cărora metalele grele
provoacă citotoxicitate

Citotoxicitatea manifestată de metalele grele poate fi explicată de acțiunea inhibitoare asupra mitocondriilor și a asupra
mecanismelor transportoare de electroni specifice lanțului respirator. Denaturarea mitocondriilor determină formarea
ROS, accelerarea fenomenului de apoptoză și a căilor de semnalizare proinflamatoare [1].

redox-active: Fe, Cu, Cr Epuizează principalii

antioxidanți ai celulelor, fiind
vizați în special antioxidanții și
redox-inactive: Pb, Cd, Hg
enzimele care conțin tiol.
ROS (OH, O2.-
,H2O2)

„Stres oxidativ“
Perturbarea mecanismelor de
sinteză și eliminare al:
- Lipidelor
- Proteine
- ADN
 Evaluarea citotoxicității Citotoxicitatea determinată de acțiunea unui agent este cuantificată cu
determinate de expunerea la ajutorul testelor in vitro și presupune estimarea numărului de celule
metale grele eucariote viabile de pe diferite placi de cultură

1. Reducerea sărurilor de
tetrazoliului măsoară activitatea metabolică
generală
2. Reducerea resazurinei

Markeri ai proteazei și detecția ATP marker țintit al activități enzimatice

LDH eliberată este dozată cu

Compus colorant roșu, solubil în
Lactatul dehidrogenază (LDH) este o Degradare ușurință utilizând NADH produs Rosu de
celualara metil apă din clasa formazan cu o
enzimă citoplasmatică stabilă în timpul transformăriii lactatului
absorbanță la 492 nm [22]
în piruvat
Metode rapide și moderne
de evaluare a citotoxicității

Cip microfluidic În comparație cu testul tradițional de determinare al

citotoxicități ce utilizează reactiv tetrazolium, acest cip
microfluidic poate genera diverse forțe de forfecare prin
schimbarea geometriei zonelor de cultură sau a debitului.
Creșterea forțelor de forfecare determină crește sensibilitatea
celulei la expunerea față de metalul considerat toxic [28].

Biosenzor cu celule de
Se obține detecția în timp real a ionilor de cupru (Cu) și a
combustie microbiene
altor specii de metalele grele prezente în medii apoase.
(MFC)
Biosenzorii au reușit să detecteze, în timp real, concentrații ale
ionilor de Cu până la 35 - 40 μg L-1. Rezultatele sunt
confirmate de datele obținute prin teste standardizate cu
Daphnia [2].
 IV Identificarea mecanismelor de acțiune a diferitelor specii de metale grele ce pot declanșa boli cronice
neurodegenerative incurabile (Alzheimer, Parkinson, Scleroză multiplă).

Zincul

Maladia Alzheimer Boala Parkinson Scleroza multiplă

În maladia Alzheimer (AD), în funcție de
concentrația zincului și de acțiunea acestui
metal, se pot forma două răspunsuri
farmacologice. La concentrații scăzute se
suprimă neurotoxicitatea indusă de β-amiloid
prin precipitarea selectivă a intermediarilor
de agregare. Atunci când zincul atinge
concentrații ridicate se produce legarea
acestuia de β-amiloid ce stimulează formarea
de agregate fibrilare cu efecte
neurodegenerative [9].
Deficitul de zinc determină un dezechilibru ce are repercusiuni în funcționarea corectă a celulelor T
helper (Th1 și Th2). Aceste celule specifice participă la sinteza Th17, denaturarea proceselor de
sinteză are efect domino și astfel Th 17, dependentă de funcționarea corectă a sistemului T helper,
contribuie în patogeneza sclerozei multiple [25]. Homeostazia zincului este esențială pentru
funcționarea corectă a creierului (zincul și fierul sunt metale ce predomină la nivel cerebral) și
modificări ale concentrație are implicații în declanșarea Prakinsonului și a sclerozei multiple. În
aceste boli, deficiența de zinc scade activitatea timulinei serice (hormon timic), necesară pentru
maturarea și diferențierea celulelor T helper. Deficitul de zinc afectează neogeneza celulelor T
CD41+ din timus. Suplimentarea cu zinc a dietei la pacienții cu maladia Alzheimer, boala Parkinson
și scleroză multiplă a produs scăderi ale expresiei genelor implicate în producția de citokine
proinflamatorii precum și scăderea biomarkerilor de stres oxidativ [6].

Maladia Alzheimer
Acumularea cuprului, este un catalizator
indispensabil al neurotoxicității. Eliminarea
acestuia din creier ar putea preveni sau inversa
efectul specific plăcilor de β-amiloid. În prezent
se consideră că reacțiile toxice sunt mediate de
linii celulare non-neuronale, cum ar fi celulele
endoteliale capilare. Aceste celule accelerează
dezvoltarea neuropatologiei specifică boli
Alzheimer.
Cuprul liber stimulează procesele de stres
oxidativ, datorită oligomerizării proteinei α-
synucleinice și formarea de corpi Lewy prin
reacţia Fenton și reacţia Haber-Weiss. Pe de altă
parte, cuprul este cofactor al unei importante
enzime antioxidante, Cu/Zn-SOD, care
diminuează stresul oxidative [39].
Boala Parkinson
La nivel cerebral doar forme ionice libere ale
cuprului pot depăși bariera hematoencefalică
[8].
S-a constatat că ceruloplasmina și concentrația
cuprului în sânge rămân nemodificate la
pacienții ce suferă de boala Parkinson și, prin
urmare, este puțin probabil ca acest metal să
reprezinte un marker de diagnostic valid sau un
instrument de predicție [10].
Cuprul
Scleroza multiplă
Lezarea sistemului de transport electronic
mitocondrial, scăderea activității citocrom
oxidazei și activarea gliei determină creşterea
concentraţiei de cupru [25]. Acumularea
cuprului în LCR și serul pacienţilor cu scleroză
multiplă se datorează reducerii ceruloplasminei
serice sub acțiunea feroxidazei. Intensificarea
proceselor guvernate de această enzimă
declanșează mecanismele specifice de apărare
împotriva stresului oxidativ. Acești markeri ai
stresului oxidativ fiind prezenți în concentrații
mai ridicate la pacienții cu scleroză multiplă
[35].

Maladia Alzheimer Boala Parkinson
Neuronii globus pallidus par a fi cei mai sensibili
Dereglările metabolismului specific manganului la degenerarea produsă de mangan. Reacțiile
și disfuncții în sistemul de captare Mn-SOD, toxice produse de mangan afectează intens
determină formarea depozitelor proteice sistemul nervos central și periferic. Aceste reacții,
polimorfe beta-amiloide (plăci senile) [11]. specifice intoxicației cu mangan au fost
Importanța sistemului Mn-SOD în identificat în: cerebel, nucleul roșu, cortex,
neuropatologia bolii Alzheimer a fost confirmată talamus și cornul anterior al măduvei spinării.
de scăderea activității acestui sistem enzimatic Identificarea profilului toxicologic specific
odată cu exacerbarea simptomatologiei specifică manganului a ajutat la diferențierea acestui tip de
acestei boli [24]. patologie față de boala Parkinson idiopatică. În
cazul degenerării parkinson idiopatice, neuronii
substantia nigra pars compacta sunt degradați la
nivelul sinapselor dopaminergice [23].
Manganul
Scleroza multiplă
Are loc activarea microgliei precedată de
astroglioză ce determină pierderi ale influxului
nervos. Microglioza are un rol important în
reacțiile neurotoxice specifice manganului.
Prezența manganului determină activarea căilor
de semnalizarea a factorilor de transcripție
proinflamatori kappa B (NF κB) din microglie.
Acești factori joacă un rol esențial în răspunsurile
inflamatorii ca urmare a modificărilor ce au loc în
mecanismele de reglarea a citokinelor și
chemokinelor determinând amplificarea
proceselor de activarea a astrocitelor [20].

Maladia Alzheimer
Cd acționează asupra celulelor gliale declanșând
o cascadă de reacții proinflamatoare ce determină
moartea dentritelor și a sinapselor neuronale.
Boala Parkinson
Mecanismul de desfășurare al bolii Parkinson
este extrem de complex, una dintre câteva gene
implicate codifică alfa-sinucleina (α-Syn)
proteină identificată la pacienții cu forme
idiopatice ale acestei boli [36]. Această proteină
este implicată în procesele ce guvernează
homeostazia dopaminei [7].
α-Syn are afinitate pentru ionii metalici și odată
ce formează complexe cu aceștia se observă
creșterea vitezei de agregare pentru această
proteină. Datorită acestui fenomen apare o
creștere a densității de plăci senile [5].
Cadmiu
Scleroza multiplă
Proteinele S100B ating concentrații ridicate în
lichidul cefalorahidian (LCR) al pacienților cu
SM în timpul fazelor acute sau atunci când apar
exacerbări ale bolii [37]. La pacienții cu SM se
înregistrează o creștere a concentrației de
cadmiu la nivel cerebral. Aceste acumulări de Cd
determină modificări în mecanismele de sinteză
specifice proteinelor S100B. Cadmiu, este un
catalizator cu rol crucial în declanșarea și în
evoluția sclerozei multiple [30].

Maladia Alzheimer
Acumularea de fier este difuza, regiunile de
acumulare fiind cortexul și hipocampul. Acumularea
exagerată a Fe se datorează proceselor inflamatorii
care modifică permeabilitatea barierei
hematoencefalice și atrage macrofage bogate în fier,
ce stimuleaza formarea plăcilor senile [38]
. liber amplifică fenomenul de stres oxidativ. Această
Fierul
Boala Parkinson Scleroza multiplă
Fierul intervine în patogeneza bolii Parkinson
datorită proprietăților sale pro-oxidante care
stimulează generarea speciilor reactive de oxigen
[14]. Se observă acumularea focală a fierului în
Specific sclerozei multiple, este acumularea
substantia nigra. Datorită acestui fenomen, fierul
fierului în talamus și striatum. Acumularea
participă ca și co-factor în reacțiile de sinteză
fierului este o consecință a proceselor
enzimatică ale tirozinhidroxilazei. Această enzimă
limitează sinteza dopaminei și scade concentrația de inflamatorii care modifică permeabilitatea
barierei hematoencefalice și atragerea
fier liber disponibil [27]. Scăderea cantității de fier
macrofage bogate în fier [38].
epuizare a formelor libere de fier precum și apariția
disfuncțiilor în mecanismele mitocondriale ca o
consecință a stresului oxidativ celular, provoacă
lezarea sau chiar moartea neuronilor precum și
apoptoza altor cellule [4].
 Rolul protector al seleniului
în intoxicația cu metale grele
Glutation peroxidaza
Cofacto
Seleniul este un micronutrient esențial în Tioredoxin reductaza
r
buna funcționare a tuturor organismelor. +Se exogen
Selenoproteine - afecțiuni neurodegenerative
- tulburări endocrine
- tulburări cardiovasculare
- procese cancerigene [19]
Hg
- demetilează mercurul organic în mercur anorganic- redistribuire
Se acționează împotriva toxicității metalelor, mercurului către organele țintă mai puțin sensibile;
atât la nivel tisular, cât și celular
Pb
- Intervine în activitatea complexelor mitocondriale din lanțul
respirator
- Reduce intensitatea proceselor inflamatorii [33]
Cd
induce sinteza oxidului nitric (iNOS); accelerează activitatea complexelor din lanțul respirator mitocondrial
(complexele I, II și V) - apoptoză celulară
Se a avut un efect pozitiv asupra ameliorării apoptozei induse de Cd în țesutul renal prin activarea căii de
semnalizare PI3K / AKT / Bcl-2 [3].
 Concluzii

 În studiul de față au fost identificate o serie de metode analitice ce fac posibilă identificarea și dozarea metalelor grele
prezente în alimente.
 Totodată au fost identificate și metode rapide de evaluare a citotoxicității.
 O parte din metalele esenţiale, cum ar fi zincul, cuprul, manganul și fierul exercită roluri critice în fiziopatologia maladiei
Alzheimer, bolii Parkinson și a Sclerozei multiple. Aceste metale se acumulează în diferite regiuni ale creierului la
diferite nivele.
 Delimitarea mecanismelor specifice, prin care metalele modifică homeostazia proceselor redox, este esențială pentru
înțelegerea proceselor patologice specifice unor boli incurabile, înțelegerea acestor mecanisme oferă noi perspective
pentru prevenirea bolilor menţionate în studiu, precum și tratarea pacienților afectați de acestea.
 Acțiunea protectoare a seleniului, are rolul de a întregii imaginea în ceea ce privește tema abordată.
 Bibliografie
1. Al Doghaither H., Elmorsy E., Al-Ghafari A. et al. Roles of oxidative stress, apoptosis, and inflammation in metal-induced dysfunction of beta pancreatic cells isolated from CD1 mice. Saudi journal of
biological sciences, 2021; 28(1): 651-663.
2. Adekunle A., Rickwood C. & Tartakovsky B. Online monitoring of heavy metal–related toxicity using flow-through and floating microbial fuel cell biosensors. Environmental monitoring and assessment,
2020; 192(1): 1-12.
3. Bao R. K., Zheng, S. F. & Wang, X. Y. Selenium protects against cadmium-induced kidney apoptosis in chickens by activating the PI3K/AKT/Bcl-2 signaling pathway. Environmental Science and Pollution
Research, 2017; 24(25): 20342-20353.
4. Behl T., Makkar R., Sehgal A., et al. Current trends in neurodegeneration: Cross talks between oxidative stress, cell death, and inflammation. International Journal of Molecular Sciences, 2021; 22(14): 7432-
7448.
5. Bisaglia M., Tessari I., Mammi S. et al. Interaction between α-synuclein and metal ions, still looking for a role in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Neuromolecular medicine, 2009; 11(4): 239-251.
6. Bredholt M. & Frederiksen J. L. Zinc in multiple sclerosis: A systematic review and meta-analysis. ASN neuro, 2016; 8(3): 1-9
7. Calo L., Wegrzynowicz M., Santivañez‐ Perez J.et al. Synaptic failure and α‐synuclein. Movement Disorders, 2016; 31(2): 169-177.
8. Choi B. S. & Zheng W. Copper transport to the brain by the blood-brain barrier and blood-CSF barrier. Brain research, 2009; 1248: 14-21.
9. Cristóvão J. S., Santos R. & Gomes C. M. Metals and neuronal metal binding proteins implicated in Alzheimer’s disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016; 1-15.
10. Davies K. M., Mercer J. F., Chen N. et al. Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical Science, 2016; 130(8): 565-574.
11. Du K., Liu M., Pan Y. et al. Association of serum manganese levels with Alzheimer’s disease and mild cognitive impairment: A systematic review and meta ‐analysis. Nutrients, 2017; 9(3): 231-239.
12. Engwa G. A., Ferdinand P. U., Nwalo F. N. et al. Mechanism and health effects of heavy metal toxicity in humans. Poisoning in the modern world-new tricks for an old dog, 2019; 10: 20-27
13. Ercal N., Gurer-Orhan H. & Aykin-Burns N. Toxic metals and oxidative stress part I: mechanisms involved in metal-induced oxidative damage. Current topics in medicinal chemistry, 2001; 1(6): 529-539.
14. Garcia S. J., Gellein K., Syversen T.et al. Iron deficient and manganese supplemented diets alter metals and transporters in the developing rat brain. Toxicological Sciences, 2007; 95(1): 205-214.
16. Genchi G., Sinicropi M. S., Lauria G. et al. The effects of cadmium toxicity. International journal of environmental research and public health, 2020; 17(11): 73-82.
17. Gossai A., Zens M. S., Punshon T., et al. Rice consumption and squamous cell carcinoma of the skin in a United States population. Environmental health perspectives, 2017; 125(9): 97-105.
18. Islam M. S., Ahmed M. K. & Habibullah-Al-Mamun M.. Determination of heavy metals in fish and vegetables in Bangladesh and health implications. Human and Ecological Risk Assessment: An
International Journal, 2015; 21(4): 986-1006.
19. Kieliszek M. Selenium–fascinating microelement, properties and sources in food. Molecules, 2019; 24(7): 1200-1298.
20. Kirkley K. S., Popichak K. A., Afzali M. F. et al. Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity. Journal of neuroinflammation, 2017; 14(1): 1-18
21. Krejpcio Z., Sionkowski S. & Bartela J. Safety of fresh fruits and juices available on the Polish market as determined by heavy metal residues. Polish Journal of Environmental Studies, 2005; 14(6):879-877.
22. Kumar P., Nagarajan A. & Uchil P. D. Analysis of cell viability by the lactate dehydrogenase assay. Cold Spring Harbor Protocols, 2018; 6: 94-97.
23. Kwakye G. F., Paoliello M., Mukhopadhyay S. et al. Manganese-induced parkinsonism and Parkinson’s disease: shared and distinguishable features. International journal of environmental research and
public health, 2015; 12(7): 7519-7540.
24. Martins A. C., Morcillo P., Ijomone O. M. et al. New insights on the role of manganese in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. International journal of environmental research and public health,
2019; 16(19): 35-46.
25. Mezzaroba L., Alfieri D. F., Simão, A. N. C. et al. The role of zinc, copper, manganese and iron in neurodegenerative diseases. Neurotoxicology, 2019; 74: 230-241
26. Mitra J., Guerrero E. N., Hegde, P. M. et al. New perspectives on oxidized genome damage and repair inhibition by pro-oxidant metals in neurological diseases. Biomolecules, 2014;.4(3): 678-703.
27. Mostile G., Cicero C. E., Giuliano L. et al. Iron and Parkinson's disease: A systematic review and meta-analysis. Molecular medicine reports, 2017; 15(5): 3383-3389.
28. Mugnano M., Memmolo P., Miccio L., et al. In vitro cytotoxicity evaluation of cadmium by label ‐free holographic microscopy. Journal of biophotonics, 2018; 11(12): 90-99.
29. Orr S. E., George H. S., Barnes M. C. et al. Co-administration of Selenium With Inorganic Mercury Alters the Disposition of Mercuric Ions in Rats. Biological trace element research, 2020; 195(1): 187-195.
30. Paknejad B., Shirkhanloo H. & Aliomrani M. Is there any relevance between serum heavy metal concentration and BBB leakage in multiple sclerosis patients? Biological trace element research, 2019;
190(2): 289-294.
31. Patel R. & Aschner M. Commonalities between Copper Neurotoxicity and Alzheimer’s Disease. Toxics 2021, 2021; (9)1: 4-8.
32. Peralta-Videa J.R., Lopez M.L., Narayan M. et al. The biochemistry of environmental heavy metal uptake by plants: implications for the food chain. The international journal of biochemistry & cell biology,
2009; 41(8-9): 1665-1677.
33. Rahman M. M., Hossain K. F. B., Banik S., et al. Selenium and zinc protections against metal-(loids)-induced toxicity and disease manifestations: a review. Ecotoxicology and environmental safety, 2019;
168: 146-163.
34. Rezaei M., Dastjerdi H. A., Jafari H. et al. Assessment of dairy products consumed on the Arakmarket as determined by heavy metal residues. Health, 2014; 6(5): 323-327.
35. Sheykhansari S., Kozielski K., Bill J. et al. Redox metals homeostasis in multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis: a review. Cell death & disease, 2018; 9(3): 1-16.
36. Stefanis L. α-Synuclein in Parkinson's disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine, 2012; 2(2): 93-99.
37. Steinacker P., Weidehaas K., Cepek L. et al. Influence of the blood‐CSF‐barrier function on S100B in neurodegenerative diseases. Acta Neurologica Scandinavica, 2013; 128(4): 249-256.
38. Ward R. J., Dexter D. T. & Crichton R. R. Ageing, neuroinflammation and neurodegeneration. Front Biosci (Schol Ed), 2015; 7(1); 189-204.
39. Xu W., Barrientos T. & Andrews N. C. Iron and copper in mitochondrial diseases. Cell metabolism, 2013; 17(3): 319-328.
Vă mulţumim pentru atenţie!