|




    
  
R R
||
‡Metode de studiu al
proteinelor
‡Metode de studiu al
materialului genetic
r||
|
‡ | 
‡ ||!
|


 | 
‡ PR
 P  particulele încărR
cate electric migrează întrRun
mediu vâscos, sub acţiunea
unui câmp electric.

‡ Aplicaţii practice studiul proteR

inelor şi al acizilor nucleici. G
 | 
|
a. " # , cand
migrarea se realizează în gel
întrRo singură direcţie
b. " # , când
migrarea se realizează
succesiv în două direcţii
ÿ
 | 
|
‡ Tipuri de electroforeză unidiR
mensională
Dþ þ ± PAGE
DFOAL AREA OELETR 
 | 
!$
‡ realizează separarea proteiR
nelor dintrRun amestec pe
baza greutăţii/gabaritului
molecular, direct proporţioR
nal cu masa moleculară.
 
 | 
!$
‡ % adsorbţia uniformă
a dodecilsulfatului de sodiu pe
unitatea de masă de proteină,
realizând o încărcare constanR
tă de sarcini negative (migraR
rea va depinde numai de masa
moleculară)
 & & 
efiniţia separarea electroR
foretică a proteinelor dintrR
un amestec pe baza
punctului lor izoelectric.

ü
 & & 
‡ Principiu migrarea proteinelor în
funcţie de punctul izoelectric,
până în zona din gel cu pHRul
identic cu cel al punctului lor
izoelectric, unde devin neutre
oprinduRşi mişcarea
‡ Gradientul de pH din gel este
realizat de compuşi amfoteri
numiţi amfoliţi
 & & 
Rezultate "%i 

' &%    % & 


  ( &
" # 
‡ migrarea proteinelor în două
direcţii
. prima direcţie ± FOAL ARE
OELETR 
. a doua direcţie ± þ þRPAGE

  ( &
" # 
‡ Rezultatele se prezintă sub
forma unei hărţi cu proteinele
separate în planul gelului.
  ( &
" # 

Electroforeză  pe fracţiuni celulare din hepatocite (Fengsrud et al.


 
    ± 
,  ) G
  ( && 
 
‡ Foloseşte, de regulă, geluri de
agaroză, sau geluri de poliaR
crilamidă la concentraţii mici
(până în 5%), care asigură
spaţii largi de migrare
 |
||
‡ Metodă de extragere, în câmp
electric, a macromoleculelor
(proteine, acizi nucleici)
separate electroforetic întrRun
gel, cu ataşarea lor pe hârtii cu
proprietăţi adsorbante speciale


 |
||
Avantajele tehnicii
‡ þporeşte accesibilitatea partenerilor
de identificare (anticorpi la epitopi,
care se pot şi regenera datorită
eliminării þ þ
secvenţe oligonucleR
otidice marcate fluorescent la A
,
sau AR
)
‡ þe pretează şi la identificări de
receptori prin liganzi marcaţi
 
|#(   (  
%  )* #  +
—

. Electroforeză þ þRPAGE
. Transfer electroforetic membrană
. ncubarea cu anticorpul primar specific
4. ncubarea cu anticorpul secundar conjugat
cu peroxidază, sau fosfatază alcalină
5. ezvoltarea reacţiei de identificare (de
regulă reacţie de chemiluminiscenţă
amplificată)
 * # ' 
tilizări
R determinare semicantitativă de
proteine (prin densitometrie)
R oferă informaţii legate de
modificarea de expimare a
proteinelor, sau de starea lor de
activare în decursul diferitelor
procese celulare ü
|#(   (  
%  )* #  +
—






Exprimarea diferitelor tipuri de

integrine pe diverse tipuri celulare
evidenţiată prin electroforeză,
transfer şi imunodetecţie. Poziţiile
R4 reprezintă nivelul de exprimare
a integrinelor în keratinocite pasajul
 (poziţiile , ), respectiv pasajul 
(poziţiile , 4)
poziţiile 5R

reprezintă nivelul de exprimare a
integrinelor în celule musculare
netede de trompă uterină la
pasajele  (poziţia 5), 4 (poziţia 6),
6 (poziţia  ) şi
(poziţia
).
(°


 
 

 



   )
|#(   (  
)
' +
efiniţie metodă utilizată pentru
identificarea unei anumite
secvenţe A
în materialul
genetic recoltat de la pacient,
animal de laborator sau cultură
celulară 
 
' 
Principiu
folosirea unei
probe compleR
mentare celei
investigate,
marcată fluoresR
cent sau
radiografic
|#(   (  
)
' +
R etectarea anumitor secvenţe
de AR

R þimilară ca procedeu cu
þouthern Blot
R Poate furniza informaţii legate
de modularea exprimării
anumitor gene în celule 
 "& 


‡ Metodă de evidenţiere a unei
secvenţe A
, sau AR
în
celule dintrRun ţesut sau din
cultură, fără a trebui distrusă
integritatea celulară şi extras
materialul genetic
 "& V  V

‡ Principiu utilizarea unei
secvenţe complementare de
A
/AR
, marcate fluorescent,
care să evidenţieze prezenţa 

a secvenţei căutate
‡ eoarece foloseşte un preparat fluorescent,
metoda e cunoscută sub denumirea de 
(fluorescent 
hybridization)
 ),r
|+

‡ Metodă folosită pentru

obţinerea unui număr mare de
copii a unei anumite secvenţe
de A

 
—

‡ denaturarea A
şi separarea
catenelor complementare
‡ adaugarea primerilor (secvenţe
A
complementare secvenţeiR
ţintă)
‡ sinteza de noi secvenţe de A

dc sub acţiunea TaqRpolimerazei

  - .   

Metodă care permite descifrarea

secvenţei de nucleotide care
intră în structura unei gene
  - .   
‡ Metoda þanger ± Principiu
‡ Blocarea sintezei catenei complementare
de A
prin legarea unei dideoxinucleoR
tide, în locul nucleotidei normale şi
generarea de fragmente intermediare
‡ Migrarea ulterioară în gel de agaroză va
etala secvenţe de A
din ce în ce mai
mari, diferind prin ultima bază azotată
legată
r " 
 |/ )0
||+
R Metodă foarte sensibilă de
detectare şi cuantificare a AR
m
R niţial din AR
Rul ţintă se
sintetizează secvenţa cA
, apoi
urmează etapele PR
R tilizată în diagnosticul unor boli
genetice, cuantificarea expresiei
diverselor gene prin determinarea
cantităţii de AR
m 
  # 
R Animale de laborator cărora li
se inseră gene mutante pentru
a studia efectul lor asupra
organismului gazdă.
R Mediu de studiu pentru evoluţia
unor boli cu determinism genic
şi a opţiunilor terapeutice 
Animale de laborator
transgenice

G
  11
R
nlocuirea genei de interes cu
o genă inactivă sau o alelă
mutată
R Animalul purtător nu va
exprima această genă,
putânduRse studia efectul
absenţei ei in organism. ÿ
 % 11#



 0r

‡ rmărirea comportamentului
celular în timp real în miniR
incubatoare cu sistem
microscopic încorporat
  
 #  2
‡ rmărirea celulelor timp îndelungat (ore, zile)
în modelări experimentale (adeziune, etalare,
stimulări, inhibări, stres hipoxic, stres oxidativ)
‡ þtabilirea momentelor critice în comportarea
celulelor în modelul experimental
‡ Măsurători morfologice
‡ Măsurători de mobilitate celulară
‡ Traiectorii ale dinamicii celulare
‡ Migrări individuale, migrări de grup
‡ ezvoltări de experimente asupra
mecanismelor (prin metode alternative)
 0r
Analiza morfometrică şi fenomenologică a rezultatelor

 

3   

 
84
04 
%  " "  954> 


74 

       

64


4
 

4 

54 ˜


4 
4 7 54 57
4

% 



apacitatea de reacoperire a        

suprafeţei denudate 

 

Analiza direcţionalităţii de 

migrare prin trasarea traiectoriilor

  %

 
‡
u vă lamentaţi de complexitatea
informaţiilor!
‡ GândiţiRvă că cei ce vor veni în
anii următori vor avea şi mai
multe de învăţat!
¢