Sunteți pe pagina 1din 40

| 



   
  
R R
||
‡Metode de studiu al
proteinelor
‡Metode de studiu al
materialului genetic
r||
|
‡ | 
‡ ||!
|


| 
‡ PR  P  particulele încărR
cate electric migrează întrRun
mediu vâscos, sub acţiunea
unui câmp electric.

‡ Aplicaţii practice studiul proteR


inelor şi al acizilor nucleici. G
| 
|
a. " #  , cand
migrarea se realizează în gel
întrRo singură direcţie
b. " #  , când
migrarea se realizează
succesiv în două direcţii
ÿ
| 
|
‡ Tipuri de electroforeză unidiR
mensională
Dþ þ ± PAGE
DFOAL AREA OELETR 
| 
!$
‡ realizează separarea proteiR
nelor dintrRun amestec pe
baza greutăţii/gabaritului
molecular, direct proporţioR
nal cu masa moleculară.
 
| 
!$
‡ % adsorbţia uniformă
a dodecilsulfatului de sodiu pe
unitatea de masă de proteină,
realizând o încărcare constanR
tă de sarcini negative (migraR
rea va depinde numai de masa
moleculară)
  & & 
efiniţia separarea electroR
foretică a proteinelor dintrR
un amestec pe baza
punctului lor izoelectric.

ü
  & & 
‡ Principiu migrarea proteinelor în
funcţie de punctul izoelectric,
până în zona din gel cu pHRul
identic cu cel al punctului lor
izoelectric, unde devin neutre
oprinduRşi mişcarea
‡ Gradientul de pH din gel este
realizat de compuşi amfoteri
numiţi amfoliţi
  & & 
Rezultate "%i  

' &%     % & 


  (  &
" #  
‡ migrarea proteinelor în două
direcţii
. prima direcţie ± FOAL ARE
OELETR 
. a doua direcţie ± þ þRPAGE

  (  &
" #  
‡ Rezultatele se prezintă sub
forma unei hărţi cu proteinele
separate în planul gelului.
  (  &
" #  

Electroforeză  pe fracţiuni celulare din hepatocite (Fengsrud et al.


       ± ,  ) G
  (  && 
 
‡ Foloseşte, de regulă, geluri de
agaroză, sau geluri de poliaR
crilamidă la concentraţii mici
(până în 5%), care asigură
spaţii largi de migrare
|
||
‡ Metodă de extragere, în câmp
electric, a macromoleculelor
(proteine, acizi nucleici)
separate electroforetic întrRun
gel, cu ataşarea lor pe hârtii cu
proprietăţi adsorbante speciale

|
||
Avantajele tehnicii
‡ þporeşte accesibilitatea partenerilor
de identificare (anticorpi la epitopi,
care se pot şi regenera datorită
eliminării þ þ secvenţe oligonucleR
otidice marcate fluorescent la A ,
sau AR)
‡ þe pretează şi la identificări de
receptori prin liganzi marcaţi

|#(    (   
%   )* #  +
— 
. Electroforeză þ þRPAGE
. Transfer electroforetic membrană
. ncubarea cu anticorpul primar specific
4. ncubarea cu anticorpul secundar conjugat
cu peroxidază, sau fosfatază alcalină
5. ezvoltarea reacţiei de identificare (de
regulă reacţie de chemiluminiscenţă
amplificată)
* # ' 
tilizări
R determinare semicantitativă de
proteine (prin densitometrie)
R oferă informaţii legate de
modificarea de expimare a
proteinelor, sau de starea lor de
activare în decursul diferitelor
procese celulare ü
|#(    (   
%   )* #  +
—  

Exprimarea diferitelor tipuri de


integrine pe diverse tipuri celulare
evidenţiată prin electroforeză,
transfer şi imunodetecţie. Poziţiile
R4 reprezintă nivelul de exprimare
a integrinelor în keratinocite pasajul
 (poziţiile , ), respectiv pasajul 
(poziţiile , 4) poziţiile 5R
reprezintă nivelul de exprimare a
integrinelor în celule musculare
netede de trompă uterină la
pasajele  (poziţia 5), 4 (poziţia 6),
6 (poziţia  ) şi  (poziţia ).
(°  
     
    )
|#(    (   
)  ' +
efiniţie metodă utilizată pentru
identificarea unei anumite
secvenţe A  în materialul
genetic recoltat de la pacient,
animal de laborator sau cultură
celulară 
  ' 
Principiu
folosirea unei
probe compleR
mentare celei
investigate,
marcată fluoresR
cent sau
radiografic
|#(    (   
)  ' +
R etectarea anumitor secvenţe
de AR
R þimilară ca procedeu cu
þouthern Blot
R Poate furniza informaţii legate
de modularea exprimării
anumitor gene în celule 
 "& 
‡ Metodă de evidenţiere a unei
secvenţe A , sau AR în
celule dintrRun ţesut sau din
cultură, fără a trebui distrusă
integritatea celulară şi extras
materialul genetic
 "& V  V

‡ Principiu utilizarea unei
secvenţe complementare de
A /AR, marcate fluorescent,
care să evidenţieze prezenţa 

a secvenţei căutate
‡ eoarece foloseşte un preparat fluorescent,
metoda e cunoscută sub denumirea de 
(fluorescent 
hybridization)
),r
|+

‡ Metodă folosită pentru


obţinerea unui număr mare de
copii a unei anumite secvenţe
de A 



— 
‡ denaturarea A  şi separarea
catenelor complementare
‡ adaugarea primerilor (secvenţe
A  complementare secvenţeiR
ţintă)
‡ sinteza de noi secvenţe de A 
dc sub acţiunea TaqRpolimerazei

 - .   

Metodă care permite descifrarea


secvenţei de nucleotide care
intră în structura unei gene
 - .   
‡ Metoda þanger ± Principiu
‡ Blocarea sintezei catenei complementare
de A  prin legarea unei dideoxinucleoR
tide, în locul nucleotidei normale şi
generarea de fragmente intermediare
‡ Migrarea ulterioară în gel de agaroză va
etala secvenţe de A  din ce în ce mai
mari, diferind prin ultima bază azotată
legată
r  " 
|/ )0
||+
R Metodă foarte sensibilă de
detectare şi cuantificare a ARm
R niţial din ARRul ţintă se
sintetizează secvenţa cA , apoi
urmează etapele PR
R tilizată în diagnosticul unor boli
genetice, cuantificarea expresiei
diverselor gene prin determinarea
cantităţii de ARm 
 # 
R Animale de laborator cărora li
se inseră gene mutante pentru
a studia efectul lor asupra
organismului gazdă.
R Mediu de studiu pentru evoluţia
unor boli cu determinism genic
şi a opţiunilor terapeutice 
Animale de laborator
transgenice

G
 1 1 
R
nlocuirea genei de interes cu
o genă inactivă sau o alelă
mutată
R Animalul purtător nu va
exprima această genă,
putânduRse studia efectul
absenţei ei in organism. ÿ
 % 1 1  #


0r

‡ rmărirea comportamentului
celular în timp real în miniR
incubatoare cu sistem
microscopic încorporat
 
 #  2
‡ rmărirea celulelor timp îndelungat (ore, zile)
în modelări experimentale (adeziune, etalare,
stimulări, inhibări, stres hipoxic, stres oxidativ)
‡ þtabilirea momentelor critice în comportarea
celulelor în modelul experimental
‡ Măsurători morfologice
‡ Măsurători de mobilitate celulară
‡ Traiectorii ale dinamicii celulare
‡ Migrări individuale, migrări de grup
‡ ezvoltări de experimente asupra
mecanismelor (prin metode alternative)
0r
Analiza morfometrică şi fenomenologică a rezultatelor

 

3     

  
84
04 
%  " "  954> 

74 

       


64


4
 

4 

54 ˜ 

4 
4 7 54 57 4

%  


apacitatea de reacoperire a        

suprafeţei denudate 

 

Analiza direcţionalităţii de 

migrare prin trasarea traiectoriilor


 %
  
‡ u vă lamentaţi de complexitatea
informaţiilor!
‡ GândiţiRvă că cei ce vor veni în
anii următori vor avea şi mai
multe de învăţat!
¢