UNIVERSITATEA „ȘTEFAN CEL MARE’’ SUCEAVA

FACULTATEA DE INGINERIE ALIMENTARĂ

MASTERAT CONTROLUL ȘI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE

CROMATOGRAFIA
HPLC

PROFESOR: STUDENT, MASTERAND:

CONF.DR.POROCH MARIA ȚÎRDEA MARIA
MCEPA,1A
SUCEAVA, 2022
 CROMATOGRAFIA

 Cromatografia este o metodă de separare și analiză a substanțelor chimice din

amestecuri, care se bazează pe interacțiunea diferențiată a doi sau mai mulți
compuși de separat cu două faze cromatografice: faza mobilă și faza staționară.
 Istoric
Cromatografia a fost inițiată în 1901 de botanistul rus Tswet, care a separat
niște pigmenți vegetali pe o coloană umplută cu carbonat de calciu, folosind
ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o
acestei metode provine de la faptul că, inițial a folosit-o pentru separarea
unor coloranți (chromos = culoare, graphos = scriere în limba greaca).
Următorul pas important în dezvoltarea cromatografiei a fost făcut în 1941,
când A. Martin și R. Synge au inițiat cromatografia lichidă de repartiție pe
coloană, pentru care au primit ulterior Premiul Nobel pentru chimie în
1952.
 SCHEMA DE PRINCIPIU A
CROMATOGRAFULUI
Faza mobilă se găsește într-un rezervor de
fază mobilă 1 trece printr-un dispozitiv de
măsurare și reglare a debitului 2, apoi ajunge
în dispozitivul pentru introducerea probei 3.
Aici are loc preluarea probei de către faza
mobilă, proba fiind în continuare
transportată prin coloana cromatografică 4,
unde are loc separarea componentelor.
Coloana 4 se găsește în mod uzual într-o
incintă termostatată (cuptor în cazul
cromatografiei de gaze) pentru ca analiza să
se desfășoare la o temperatură stabilită.
Componentele separate ajung în detectorul 5,
unde fiecare componentă este pusă în
evidență sub forma unui semnal distinct.
Aceste semnale sunt înregistrate de un
înregistrator 6 sau reprezintă semnalul de
intrare al unui sistem de achiziții de date
(integrator sau calculator) care permite
prelucrarea și stocarea rezultatelor.
 CLASIFICAREA TEHNICILOR
CROMATOGRAFICE

Cromatografia de lichide (LC), când faza mobilă este

un lichid.
Cromatografia de gaze (GC), când aceasta este un
gaz.
Cromatografia cu fluide supracritice la care faza
mobilă este un lichid aflat peste temperatura critică.

Cromatografia de lichide se împarte în:

cromatografia pe coloană deschisă și cromatografia
pe coloană închisă
 Cromatografia de lichide (LC) se referă la orice proces
cromatografic în care faza mobilă este lichidă, în contrast cu
faza mobilă gazoasă din cromatografia de gaze.
 Cromatografia tradițională pe coloană (de adsorbție, partiție,
schimb ionic), în strat subțire sau pe hârtie, și cromatografia
modernă sunt toate forme ale cromatografiei de lichide.
 Diferența dintre acestea se referă la detalii de echipament,
material cromatografic, tehnică de lucru, însă cromatografia
de lichide modernă are câteva avantaje majore față de
celelalte tehnici menționate cum ar fi: viteză sporită de
separare, posibilitatea de a separa amestecuri complexe,
ușurință în executare, ș.a.
 HPLC
Cromatografie de lichide de înaltă
performanță (prescurtată HPLC, din engleză High Performance
Liquid Chromatography), este o metodă de separare și de analiză
calitativă cromatografică utilizată în biochimie și chimie
analitică pentru separarea, identificarea și cuantificarea compușilor
chimici.
În HPLC se utilizează o coloană încărcată cu diferite materiale
(faza staționară), o pompă ce împinge faza(ele) mobilă(e) prin
coloană și un detector care indică timpurile de retenție ale
moleculelor. Timpul de retenție depinde de interacțiunea dintre faza
staționară, moleculele de analizat și solvenții utilizați.
HPLC face parte din categoria tehnicilor de analiză moderne,
împreună cu cromatografia de gaze (GC).
 Industria
farmaceutică
Cercetarea medicală clinică Industria polimerilor

Industria
alimentară APLICAȚII HPLC Petrochimie

Toxicologie Biochimie

Protecția mediului
Fotografie a unui aparat HPLC. De la stânga la dreapta: Pompa de gradient, ce
asigură fluxul de solvent, coloana cromatografică, aparat de înregistrare a
absorbanței
 STUDIU DE CAZ

Studiu de caz nr.1.

Validarea unei metode de cromatografie lichidă de înaltă
performanță pentru determinarea vitaminei A, vitaminei D3,
vitaminei E și alcoolului benzilic într-o soluție injectabilă
uleioasă de uz veterinar

A fost realizată și validată o metodă de cromatografie lichidă de

înaltă performanță simplă, rapidă și precisă pentru determinarea
vitaminei A, vitaminei D3, vitaminei E și alcoolului benzilic într-o
soluție injectabilă uleioasă.
Metoda poate fi utilizată pentru detectarea și cuantificarea
impurităților cunoscute și necunoscute și degradate în substanțe
medicamentoase în timpul analizei de rutină cât și pentru studiile de
stabilitate în ceea ce privește capacitatea de separare a produșilor de
degradare. Metoda a fost validată pentru acuratețe, precizie,
specificitate, robustețe și limite de cuantificare conform Ghidurilor ICH.
Evaluarea vitaminei A, vitaminei D3, vitaminei E și acoolului benzilic s-
a realizat prin sistemul de purificare a apei HPLC prin utilizarea
 Analiza cantitativă a compoziției multivitaminelor rămâne o provocare pentru
chimiștii analitici. Una dintre dificultățile de bază este legată de natura înalt
reactivă a vitaminelor și izolarea cantitativă a fiecărei componente. Procedura
analitică de evaluare a vitaminelor este foarte laborioasă și de durată. S-a estimat o
durată de câteva luni pentru determinarea lipo/hidro solubilității vitaminelor prin
metoda cromatografică.

Materiale și Metode

 Substanțe chimice și reagenți

Vitamina A a fost obținută din USP, vitamina D3, vitamina E și alcoolul
benzilic au fost obținute din EDQM. Acetonitrilul, n-hexanul și
tetrahidroxifuranul, reagenți, au fost obținuți de la Merck. S-a utilizat de
asemenea apa purificată.

 Aparatură
Aparatura utilizată a fost Modulul de separare Waters HPLC 2695 de
tip autoinjector și detectorul Waters PDA 2696. Coloana utilizată a fost
Thermo BDS Hypersyl – C18, mm x 4.6 mm, dimensiune particule 5 µm.
Condiții cromatografice
Separarea cromatografică s-a realizat la 25°C pe o coloană cu fază inversă prin
utilizarea unei faze mobile formată din solventul A (tetrahidroxifuran), solventul B
(acetonitril) și solventul C (apa).

Validarea Metodei
Parametrii studiați pentru validarea metodei au fost limita de detecție (LDD), limita de
cuantificare (LDC), liniaritatea, acuratețea, precizia, repetabilitatea, robustețea și
specificitatea. LDC a fost definită drept concentrația minimă care poate fi determinată cu
acuratețe și precizie acceptabile. LDD și LDC au fost realizate cu un răspuns de la semnal la
zgomot.
 Studiu de caz nr.2:
Separarea clorofilelor și carotenoidelor din fitoplanctonul marin: o nouă
metodă HPLC folosind o coloană C8 cu fază inversă și faze mobile care conțin
piridină

O metodă de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) bazată

pe o coloană C8 cu fază inversă și faze mobile care conțin piridină a fost
dezvoltată pentru separarea simultană a clorofilelor și carotenoidelor. 
Metoda este suficient de selectivă pentru a elimina perechile monovinil
(MV) și divinil (DV) de clorofile polare și DV clorofilă a. Această capacitate
de rezoluție pentru clorofile a fost obținută anterior doar folosind polimerul
C 18coloane în combinație cu acetat de amoniu sau faze mobile care conțin
piridină.  
 Metoda folosește un gradient binar, astfel încât poate fi utilizată atât cu
instrumente de amestecare de joasă presiune, cât și de înaltă
presiune.  Selectivitatea metodei față de niște pigmenți recent descoperiți de
clorofilă și carotenoizi o face deosebit de potrivită pentru studiul nu numai a
probelor de teren, ci și pentru reexaminarea compoziției pigmentare a diferitelor
clase de alge.

Materiale și metode
Dezvoltarea metodei a fost realizată folosind Echipament HPLC Waters
Alliance (Sistem l), inclusiv un modul de separare 2690 (amestecare la presiune
joasă) și un detector cu matrice de diode Waters 996 (1,2 nm rezoluție optică)
interfațat cu un detector de fluorescență cu scanare Waters 474 prin intermediul
unui analog Sat/In interfata.
Pentru alte sisteme HPLC, s-au folosit și 2 instrumente suplimentare
(Sistemele 2 și 3). HPLC System 2 a fost un Beckman System Gold, inclusiv un
modul de solvenți programabil model 126 (sistem de amestecare de înaltă
presiune), un detector cu matrice de diode model 168 (rezoluție optică de 2 nm)
și o supapă de injecție Rheodyne 77251 prevăzută cu o buclă de 200 p1.
 Sistemul HPLC 3 a fost un sistem modular Waters (volum mare de locuire)
inclusiv un controler Waters 600 S, o pompă Waters 616 (sistem de amestecare la
presiune joasă), un Waters 717 Plus autosampler (200 p1 buclă) și un detector
Waters 996 diodearray (rezoluție optică de 1,2 nm).

Detectarea și identificarea pigmentului.

Clorofilele și carotenoizii au fost detectați prin matrice de diode spectroscopie
(350 până la 750 nm). Clorofilele au fost detectate prin fluorescență (Ex
[excitație]: 440 nm, Em [emisia]: 650 nm).
Cromatogramele de absorbanță au fost extrase la diferite lungimi de undă
(430, 440 și 450 nm). Pigmenții au fost identificați prin co-cromatografie cu
standarde autentice și prin spectroscopie cu matrice de diode (interval de lungimi
de undă: 350 până la 750 nm, 1,2 nm rezoluție spectrală).
Fiecare vârf a fost verificat pentru omogenitatea spectrală folosind software-
ul Millenium (Waters).
 Studiu de caz nr. 3
DETERMINAREA IZOFLAVONELOR ÎN SEMINȚE DE
SOIA PRIN METODA HPLC
Materiale și metode
Semințe de soia, recolta anului 2014; cromatograf de lichide de
înaltă presiune Agilent 7500, dotat cu detector spectrophotometric UV-
VIS; coloana Nucleosil C1, C-18 i.d.= 15 µm., 15x 0,4cm.
Condițiile tehnice instrumentale: temperatura coloanei este 40 °C;
volumul de injecţie -20 µl; debitul fazei mobilă – 1 ml /min; faza mobilă
acid fosforic 0,1 % și MeOH – apă 90:10.

 Rezultate și discuții
1.0 g de probă măcinată de semințe de soia sunt plasate într-un balon cu
fund rotund de 100 ml,se adaugă 50 ml metanol 70% și se extrage cu
ultrasunet timp de 10 minute. Extractul este filtrat printr-un filtru de
celuloză cu dimensiunea porilor de 0,45 μcm într-un balon cotat de 100
ml, aducând cu metanol 70% până la cotă; Se prepară soluția standard
de izoflavone – genisteină.
În urma determinărilor cromatografice s-a calculat conținutul de
izoflavone în recalcul la genisteină - 0,36%.
 BIBLIOGRAFIE
Manuel Zapata, Francisco Rodríguez , José L. Garrido -Separarea clorofilelor
și carotenoidelor din fitoplanctonul marin: o nouă metodă HPLC folosind o
coloană C8 cu fază inversă și faze mobile care conțin piridină, Centro de
Investigacións Mariñas, Consellería de Pesca, Xunta de Galicia, Apdo.13, 36620
Vilanova de Arousa, Spania, 31 martie 2000.
Maria Neagu, Georgiana Soceanu, Ana Caterina Bucur - Validation of a High-
Performance Liquid Chromatography method for the determination of vitamin A,
vitamin D3, vitamin E and benzyl alcohol in a veterinary oily injectable solution ,
Departamentul de Dezvoltare și Cercetare, SC Pasteur Filipesti, Calea Giulesti, nr.
333, sector 6, București, Romania
N METODA HPLC Roman Zinaida, Suvorchina Olga, Mazur Ecaterina
Universitatea de Stat de Medicina si Farmacie „Nicolae Testemiţanu” Conducător
științific: Livia Uncu conf. univ., DETERMINAREA IZOFLAVONELOR ÎN
SEMINȚE DE SOIA PRIN METODA HPLC
Maria Poroch, Note de curs, 2022
https://www.scritub.com/stiinta/chimie/Notiuni-generaleCromatografia32596.php
https://ro.wikipedia.org/wiki/Cromatografie_de_lichide_de_%C3%AEnalt
%C4%83_performan%C8%9B%C4%83
VĂ MULȚUMESC!