Carga Viral y genotipificacin del VIH-1

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Karen Belloso EPS- Qumica Biolgica UCREVE/VIH

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Qu es la Carga viral de VIH?

Es el nmero de copias de ARN (material gentico) del VIH, circulantes en cada mL de plasma.

Dos copias por cada virin (partcula viral). Se expresa en copias ARN/mL.

La semivida de una partcula viral en plasma es aproximadamente de 6 hrs, el de una 10/8/12 clula infectada es de 1 da y un ciclo de

Por qu se realiza?
La determinacin de carga viral se realiza para el monitoreo de pacientes infectados con VIH. Evala la eficacia del tratamiento antirretroviral. Se correlaciona directamente con:

pronstico clnico riesgo de transmisin recuento de CD4+.

Es un marcador predictivo del tiempo de progresin a la fase SIDA en conjunto con el conteo de CD4+. Una carga viral indetectable no significa que el virus 10/8/12

Progreso de la infeccin del VIH

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Cundo debe realizarse?

La carga viral de VIH se realiza en los siguientes casos: Luego de ser diagnosticado VIH positivo, antes del inicio de la terapia antirretroviral. Para medir la eficacia o respuesta al Tx. Cuando se cambia el esquema de Tx. Cada 3 4 meses en Tx de larga duracin.

En Guatemala se realiza cada 6 meses para 10/8/12 controlar a los pacientes.

Cmo se realiza?

Se realiza por medio de tcnicas de biologa molecular. Existen diversos mtodos disponibles comercialmente para la determinacin de carga viral.

RT- PCR Tiempo Real (Retrotranscripcin -Reaccin en Cadena de la Polimerasa) ADN ramificado NASBA (replicacin secuencial de cidos nucleicos). 10/8/12

Comparacin de mtodos comerciales disponibles

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PCR Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Es una tcnica de amplificacin de cidos nucleicos utilizada para la cuantificacin del VIH-1 (grupos M y O). Se basa en 3 procesos principales: 1. preparacin de la muestra para extraer el ARN viral. 2. Transcripcin inversa el ARN para generar ADNc. 3. ADNc y Amplificacin mediante PCR del deteccin simultanea. 10/8/12

1. Preparacin de la muestra
Preparacin automatizada de la muestra en el equipo COBAS Ampliprep basada en Slice Captura genrica

1000 uL de plasma con EDTA. Lisis de partculas vricas VIH1. Se unen a micropartculas magnticas. Unido el ARN de VIH-1 y QS a las partculas magnticas, se les agrega la mezcla de amplificacin (master mix).

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2. Transcripcin reversa y PCR

Target RNA Mg
2+ 2+

Taq DNA Polymerase rTth Z05 DNA Polymerase AmpEras e Primer marcado

Reverse Transcripti on and PCR

Mn

dCT dGT P P dNTP dU TP s dAT P Des: 95C Hib: 3765C Amp: 72C

Amplico n marcad o

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3. Amplificacin y deteccin
COBAS TaqMan 48

Amplifica y simultneamente cuantifica de forma absoluta el producto de la amplificacin. Se emplean sondas doblemente marcadas (FAN) con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor, en los cules hay una trasnferencia de energa fluorescente mediante resonancia.

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Caractersticas del mtodo

Es un proceso automatizado, lo cual evita la contaminacin y errores en el procedimiento.

Utiliza un control de calidad interno (QS) para garantizar la amplificacin en la muestra. Utiliza Amplilink, un software para reportar muy prctico y fcil de utilizar. Permite procesar 48 muestras en 4hrs aprox. Un amplio rango de deteccin

Desde 20 copias/mL Hasta 10,000,000 copias/mL

Cuantifica adecuadamente el VIH-1 del10/8/12 O y grupo M.

Desventaja
Este es un mtodo muy costoso pues necesita de equipo especial para llevar a cabo la prueba. Actualmente un kit de CV para 42 muestras cuesta aproximadamente Q.12,000

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Trabajo realizado en el rea

Se realiza la determinacin de Carga viral a pacientes de varias regiones del pas. Las muestras son referidas desde las Clnicas de Atencin Integral. Los lugares que envan muestras son: -Hospital de
-Hospital Nacional Juan Ortega de Coatepeque. -Hospital Dr. Rodolfo Quetzaltenango. -Hospital Nacional Escuintla. Jos Robles, la Amistad JapnGuatemala, Izabal. -Hospital Dr. Jorge Vides Molina Huehuetenango. -Hospital Infantil Martnez Izabal. Elisa

-Hospital Regional de Zacapa. Regional de

-Hospital Pedro de Bethancourt, Antigua Guatemala. 10/8/12

Ingreso de muestras durante 2011

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

P or c e nt aj e s %

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Genotipificacin Viral del VIH

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Qu es la Genotipificacin?

Es el anlisis de secuencias especficas del genoma del VIH en un paciente, con el fin de comprobar si existen mutaciones asociadas a la resistencia especfica a ciertos antirretrovirales.

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Ejemplo:
Cada regin de la secuencia del virus codifica a un aminocido y dependiendo de las mutaciones existentes cambia el aminocido que codifican. Esto confiere resistencia a los antirretrovirales. Codn (posicin)

M184 V
Aminocido tipo silvestre Metionina Aminocido mutado 10/8/12 Valina

Cundo se realiza?

Cuando se sospecha de resistencia Cuando los pacientes no han demostrado progreso de la infeccin con la terapia antirretroviral que se le administra.

Mantienen valores de carga viral elevados mientras estn adheridos a la terapia. Se les ha cambiado de esquema varias veces. 10/8/12

Cmo se realiza?
Por medio de la secuenciacin del genoma viral.

Secuencias de ADN de la regin del genoma amplificada previamente por PCR Secuencia de aminocidos, la cual se compara con la de una cepa de referencia o silvestre del VIH. El ltimo resultados secuencia resistencia paso es la interpretacin de detectando variaciones en la de genes que se asocian a 10/8/12 a los antirretrovirales.

Equipo necesario
ViroSeq HIV-1 Genotyping

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Preparacin de la Muestra y RT-PCR

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Secuenciacin

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Electroforesis, anlisis de datos y reporte

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Resumen

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Reporte

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Ventajas y desventajas
Desventajas Ventajas:

Es una medida ms rpido que otros mtodos Ms barato y indirecta de la susceptibilidad. basados en replicacin (fenotpicos). Requiere interpretacin clnica por expertos. Patrones de resistencia no estn claramente definidos.

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Preguntas?
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Muchas Gracias!
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