universitatea de stat de medicina si farmacie ,,

nicolae testemitanu “

ELECTROFOREZA
CAPILARĂ

Cataraga Elena , gr.1905

 INTRODUCERE

• Electroforeza capilara este o metoda separativa de analiza care

s-a dezvoltat datorita experientei dobandite in HPLC si
procedeelor mai vechi de electroforeza. Ea permite separarea
atat a biomoleculelor pentru care HPLC este mai putin
performanta cat si a compusilor cu mase moleculare mici, dificil
de studiat prin procedeele clasice de electromigrare pe suport.
• Electroforeza capilara de inalta performanta (HPCE) si-a facut
debutul in laboratoarele de biochimie de la inceputul anilor
1990 alaturi de o alta metoda numita electrocromatografia
capilara.
 PRINCIPII DE BAZA IN ELECTROFOREZA CAPILARA

Electroforeza capilara corespunde unei adaptari particulare a

metodei generale de electroforeza. Aceasta metoda
separativa se bazeaza pe migrarea speciilor purtatoare de
sarcini electrice globale din proba aflata in solutie sub efectul
unui camp electric si in contact cu un suport corespunzator.
In tehnica clasica obisnuita, larg utilizata in domeniul
bioanalitic, se utilizeaza benzi de material plastic acoperite cu
o substanta poroasa impregnata cu un electrolit. Capetele
sunt imersate in doua rezervoare independente, continand
acelasi electrolit si cuplate la electrozii unui generator de
tensiune continua.
 PRINCIPII DE BAZA IN ELECTROFOREZA CAPILARA

Proba este depusa sub forma unui strat subtire transversal pe

banda, eventual presata intre doua placi izolante. Speciile
hidratate prezente migreaza intr-un timp variabil cuprins intre
cateva secunde pana la cateva ore spre una dintre
extremitatile benzii. Fiecare compus se diferentieaza prin
mobilitatea sa. Detectia speciilor prezente dupa migrare se
efectueaza in general prin transferul acestora printr-un
procedeu de contact pe o membrana unde sunt relevate cu
ajutorul unor reactivi specifici. Prelucrarea datelor se face ca
si in CSS.
 PRINCIPII DE BAZA IN ELECTROFOREZA CAPILARA

In electroforeza capilara suportul plan din tehnica clasica este

inlocuit de un tub capilar deschis la ambele capete, din sticla de
siliciu cu diametrul variind intre 15 si 150 μm. Acest capilar cu
lungimea 20-80 cm este umplut cu un electrolit tampon.
 Echipament complet
automat de electroforeză
capilară
MOBILITATEA ELECTROFORETICA SI FLUXUL ELECTRO-
OSMOTIC

Particulele aflate in suspensie intr-un lichid la fel ca si

moleculele solvatate pot fi incarcate cu o sarcina electrica a
carei marime si semn depind de natura lor si a electrolitului si
in particular de pH.
Aceasta sarcina provine din fixarea pe suprafata lor a ionilor
continuti in electrolitul tampon. Sub efectul diverselor
fenomene (agitare, temperatura, vascozitate, diferenta de
potential) aceste particule vor avea viteze de migrare cu atat
mai mari cu cat ele sunt mai mici si au sarcina mai mare.
MOBILITATEA ELECTROFORETICA SI FLUXUL ELECTRO-
OSMOTIC
Pentru fiecare ion de raza r, viteza limita de migrare este
rezultatul echilibrului intre forta electrica F care se exercita intr-
un camp electric E cu paricule de sarcina q si fortele de frecare
care decurg din vascozitatea η a mediului.
Separarea depinde de asemenea de raportul volum / sarcina
ionului hidratat. Speciile neutre se separa greu fiind necesara
adaugarea unui agent ionic in electrolit care sa se asocieze cu
acesta si sa provoace o antrenare diferentiata a lor.
 MOBILITATEA ELECTROFORETICA SI FLUXUL ELECTRO-
OSMOTIC

 Speciile prezente in proba sunt supuse la doua fenomene

principale care se manifesta atat pentru ioni cat si pentru
molecule: este vorba, pe de o parte, de mobilitatea
electroforetica proprie lor iar, pe de alta, de fluxul
electroosmotic.
 MOBILITATEA ELECTROFORETICA-ELECTROMIGRATIA

 Toti compusii incarcati electric se deplaseaza in electrolit cu o

viteza v care depinde de conditiile experimentale si de
mobilitatea lor electroforetica.
 Mobilitatea electroforetica se poate obtine plecand de la
electroforegrama, calculand viteza electroforetica a
compusului intr-un camp E si tinand cont de viteza
electrolitului.
 MOBILITATEA ELECTROOSMOTICA SI ELECTROSMOZA

 Al doilea factor care controleaza migrarea solutiilor este

curgerea electrolitului numit flux electro-osmotic caracterizat
prin mobilitatea electro-osmotica.
 Pentru calcularea mobilitatii electro-osmotice trebuie
determinata viteza electroosmotica. Viteza electroosmotica
este raportul intre lungimea capilarului parcursa de un marker
neutru in timpul t. Se utilizeaza ca marker o molecula organica
nepolara la pH-ul electrolitului folosit si care este usor
detectabila prin absorbtia in UV apropiat.
MOBILITATEA ELECTROOSMOTICA SI ELECTROSMOZA

Fluxul electro-osmotic aflat la originea deplasarii tuturor

speciilor prezente in proba, depinde de natura peretelui intern
al tubului capilar.
Acest perete de silice este captusit de grupari silanice care se
ionizeaza daca pH-ul este mai mare de 3, formand o suprafata
cu pozitii anionice fixe ce creeaza un potential negativ
(potential Zeta) alaturi de un strat cationic.
 MOBILITATEA ELECTROOSMOTICA SI ELECTROSMOZA

In interiorul solutiei, campul electrolitic provoaca migrarea

cationilor spre catod. Acesti ioni sunt sunt solvatati si antreneaza
moleculele de apa din electrolit dirijandu-le spre catod. Anionii se
deplaseaza intr-o maniera contra- electrosmotica. Daca se
trateaza peretele capilar cu un surfactant de tipul
tetraalchilamoniu, polaritatea se inverseaza, ceea ce conduce la o
inversare a fluxului electrosmotic.
MOBILITATEA ELECTROOSMOTICA SI ELECTROSMOZA

In general o suprafata a peretelui capilar negativa

provoaca un flux electro-osmotic dirijat spre catod si
invers, o suprafata pozitiva provoaca o dirijare a acestuia
spre anod.
Cunoasterea fluxului electro-osmotic este esentiala
pentru practica EC pentru obtinerea de rezultate
reproductibile.
 Modul de injectare

Pentru introducerea unui microvolum de proba, care nu

trebuie sa depaseasca 1% din lungimea utila a capilarului,
pentru a nu diminua rezolutia, se utilizeaza procedeele:
a) Injectarea hidrodinamica – consta in aplicarea unei
diferente de potential intre cele doua extremitati ale
capilarului. Procedeul poate fi ameliorat prin crearea unei
presiuni de circa 50 mbar in solutia de proba.
b) Injectare electrocinetica – se utilizeaza in
electroforeza pe gel si consta in aplicarea unei diferente de
potential intre extremitatile capilarului pentru crearea unei
diferente de polaritate.
c) Injectarea prin gravitatie – bazata pe diferenta de
inaltime intre capetele capilarului
 TEHNICI ELECTROFORETICE

 Tehnicile electroforetice sunt urmatoarele:

A. Electroforeza capilara de zona
B. Electroforeza capilara micelara
C. Electroforeza capilara pe gel
D. Electroforeza prin izofocalizare
E. Electrocromatografia capilara
 ELECTROFOREZA CAPILARA DE ZONA

 Se mai numeste si electroforeza in solutie libera si este

procedeul electroforetic cel mai frecvent utilizat. In acest
procedeu capilarul este parcurs de electrolit intr-un mediu
tampon fie acid ( fosfat sau citrat) fie bazic (borat) sau amfolit
( molecule posedand o functie acida si una bazica). Fluxul
electro-osmotic creste cu pH-ul fazei lichide sau poate
ramane neutru.
 Prin aceasta tehnica cationii sunt separati primii, apoi
ansamblul neutru si la sfarsit anionii. Tehnica nu permite
separarea speciilor neutre unele de altele.
 ELECTROFOREZA CAPILARA MICELARA

Se mai numeste si cromatografie capilara electrocinetica micelara.

In aceasta varianta, fazei mobile i se adauga un compus cationic
sau anionic pentru formarea de micele incarcate electric.
Micelele care nu sunt miscibile cu solutia, absorb compusii neutri
mai mult sau mai putin eficace printr-o afinitate de tip hidrofil/
hidrofob.
Acest tip de electroforeza se aplica moleculelor care au tendinta de
a migra fara separare.
 ELECTROFOREZA CAPILARA PE GEL

 Consta in transpunerea electroforezei pe gel de poliacrilamida sau

agaroza. Capilarul este umplut cu un electrolit continand un gel
care produce efect de filtrare ce retine moleculele mari si reduce
fenomenul de difuziune.
 Metoda se preteaza la separarea a trei clase mari de biomolecule:
polipeptide, oligonucleotide (fragmente de ADN sau ARN) mono
si polizaharide.
 ELECTROFOREZA PRIN IZOFOCALIZARE

Aceasta tehnica cunoscuta in egala masura ca

electroforeza pe suport consta in crearea unui gradient de pH
liniar intr-un capilar cu peretele tratat cu amfolit. Capilarul este
introdus in acid fosforic la anod si in hidroxid de sodiu la catod,
fiecare compus migreaza si se focalizeaza la pH-ul care are
aceeasi valoare cu potentialul lui izoelectric.
 ELECTROCROMATOGRAFIA CAPILARA

 Acest tip de separare asociaza electromigrarea ionilor, proprie

electroforezei si procesele de repartitie intre faze prezente in
cromatografie.
 Avantajele electroforezei capilare
-gradul mare de rezolutie, specificitate si sensibilitate.
-rapiditatea conferita de posibilitatea analizei simultane a 10
probe/ora (in cazul imunotiparii) pana la 80 de probe/ora (in cazul
proteinelor serice). In termeni de timp vorbim despre 20 minute in
electroforeza standard in gel de agaroza si de 120 de secunde in
electroforeza capilara.
-trasabilitatea totala de la proba primara pana la rezultat, precum si a
lotului de reactivi.
-implementarea programului de control de calitate pe 3 nivele cu
posibilitatea de prelucrare statistica a rezultatelor (curba Levey-
Jennings) si a programului de transfer a rezultatelor pentru controlul
inter laboratoare si a celui de acces la aceste rezultate.
 Avantajele electroforezei capilare
- posibilitatea conectarii la un scanner pentru importul si
monitorizarea imaginilor obtinute pentru imunofixarea (IF) sau
a rezultatelor pentru proteine specifice.
-diversificarea parametrilor de investigat prin posibilitatea
determinarii, cu o rezolutie excelenta, a sialoformelor
tranferinei si a hemoglobinelor normale(Hb F si A) si
patologice (Hb S, C, D, E, Bart) ale noului nascut.
-analiza directa a globulelor rosii nespalate, centrifugate sau
decantate, hemoliza fiind efectuata de catre aparat.
-eliminarea interferentelor uzuale: hemoliza, icterul si
lactescenta serului, precum si artefactele legate de punctul
de aplicare a probelor si prezenta componentelor
monoclonale de concentratie scazuta