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HISTORIA DE LA INSULINA
En 1921, los fisilogos canadienses Frederick G. Banting y Charles H. Best extrajeron por primera vez la insulina del tejido pancretico de perros, y en 1923 la insulina estaba comercialmente disponible en los Estados Unidos. Luego, la insulina para diabticos se obtuvo a partir de pncreas de cerdos o vacas, que aunque es biolgicamente activa en humanos, no es idntica a la humana, de modo que se pueden producir algunos problemas de reacciones inmunes adversas. partir de 1982, cuando se introdujo en el mercado insulina humana producida por ingeniera gentica, empleando como organismo productor la bacteria Escherichiacoli.

INSULINA
La insulina es una hormona producida por el pncreas. Tiene una estructura proteica y su funcin consiste en regular la concentracin de glucosa en la sangre. Sin la insulina, la glucosa se acumula en la sangre hasta que alcanza niveles elevados y puede causar diferentes complicaciones en el funcionamiento del organismo. Esta es la enfermedad conocida como diabetes mellitus. Cuando la diabetes es causada por una escasa o nula produccin de insulina, se puede regular el nivel de glucosa en la sangre (glucemia) mediante la administracin exgena de insulina.

ESTRUCTURA DE LA INSULINA
La insulina es un hormona proteica constituida por 51 aminocidos. La sntesis de insulina atraviesa diferentes etapas: se fabrica como preproinsulina que luego se transforma en proinsulina al cortarse sus extremos. La mayora de la proinsulina se separa en dos partes: el pptido C" (conector) y la insulina, que est constituida por dos cadenas polipeptdicas, una de 21 aminocidos y otra de 30, unidas por dos puentes disulfuro.

pre-pro-insulina: La insulina regula el metabolismo de los azcares y es normalmente secretada en la sangre por las clulas del pncreas. Es una protena de 108 aminocidos, con una secuencia hidrofoba secuencia seal (24 aminocidos) que le permite atravezar las membranas intracelulares y que se conoce como pre-proinsulina. pro -insulina y peptido C A lo largo de su transporte, la secuencia seal de 24 aminocidos se separa de la cadena del polipptido, formando la pro-insulina, que se almacena en vesculas que se lian a las membranas de las clulas pancreticas. La pro-insulina es entonces replegada comprimida como una letra G, insulina.-los 2 extremos del chorro sostenidos juntos por 3 puentes disulfuros y entonces transformada en insulina dentro de las vesculas pancreticas mediante la excisin enzimtica de un segmento polipptidico de 33 aminocidos conocidos como pptido

ESTRUCTURA DE LA INSULINA

LA INSULINA RECOMBINANTE

La insulina es el primer caso de protena producida por ingeniera gentica aprobada para uso en humanos, desde 1982. En la actualidad, varios laboratorios farmacuticos producen insulina humana, tanto a partir de bacterias como de levaduras, y sin ningn riesgo para la salud.

En la siguiente figura, se muestra un esquema general de la obtencin de insulina a partir de pncreas de vacas o cerdos, y mediante ingeniera gentica

EL SER VIVO MEJOR CONOCIDO

El organismo mejor conocido en el mbito cientfico es una bacteria que habita en el intestino humano. Invisible a simple vista, llamado Escherichiacoli se debe en gran medida el conocimiento de algunos de los fundamentos de la biologa moderna que han merecido el reconocimiento. Se trata de los procesos de recombinacin gentica de las bacterias, de transcripcin del ARN, de replicacin del ADN y de la regulacin gnica. Adems, en las ltimas dcadas esta bacteria se ha convertido en un instrumento ms del laboratorio, sobre todo en el campo de la biologa molecular. E. coli no es la nica bacteria que se utiliza en el laboratorio pero es la ms conocida entre los investigadores de ciencias de la vida. el principal inters de E. coli estaba relacionado con las infecciones que causaba.

ESTRUCTURA DE E. COLI

REPRODUCCION DE BACTERIAS ASEXUALMENTE

El mtodo ms habitual es la biparticin o fisin binaria en la que, a partir de una clula original, resultan dos clulas hijas aproximadamente iguales en tamao y con la misma dotacin gentica: una copia de la molcula de ADN circular propia de la clula madre en cada una de ellas. Podemos considerar los siguientes pasos:

REPRODUCCION DE BACTERIAS SEXUALMENTE

Las bacterias, en sentido estricto, no poseen mecanismos de reproduccin sexual. No se forman gametos, ni estos se fusionan en un zigoto. Sin embargo si que tienen mecanismos de intercambio de genes que conllevan la aparicin de bacterias hijas con caractersticas diferentes a las originales, lo que es una de las principales consecuencias de los procesos sexuales. CONJUGACION TRANSDUCCION

INSULINA DE UNA BACTERIA

En 1977, Francisco Gonzalo Bolvar Zapata trabaj en la produccin de insulina humana en la bacteria Escherichiacoli por ingeniera gentica junto con la institucin Genentech South San Francisco, California, EU. Particip en el grupo que desarroll por primera vez en el mundo tecnologa para producir insulina humana en bacterias utilizando tcnicas recombinantes. La insulina, junto con la somatostatina, son las dos primeras hormonas humanas producidas por ingeniera gentica. es el primer producto farmacutico producido recombinante que se vende ya en farmacias de varios pases.

OBTENCION DE LA INSULINA RECOMBINANTE HUMANA Y BACTERIANA Si bien estos son los pasos a seguir para la obtencin de insulina recombinante, si se inserta en el plsmido bacteriano el gen entero de la insulina, se obtendra como resultado la preproinsulina. Para evitar estas dificultades se sintetizan qumicamente las secuencia de ADN correspondiente a las cadenas polipeptdicas A y B que se insertan separadamente en un gen bacteriano. Los plsmidos recombinantes se introducen en bacterias E. coli, donde se multiplican. Una vez purificadas las dos cadenas, se unen mediante una reaccin que forma puentes disulfuro (de azufre) y se obtiene insulina humana pura. El producto final, la insulina humana biosinttica, es idntica en todos los aspectos a la insulina purificada del pncreas humano.

EXPRESCIN DE GENES CLONADOS EN E.COLI

CAPACIDAD BACTERIANA PARA PRODUCIR LA INSULINA HUMANA

Por medio de ingeniera gentica, la bacteria mas utilizada es Escherichiacoli (nombre real) pero no es la nica, se introduce un plsmido -elemento gentico con una porcin del gen humano de la insulina- con enzimas de restriccin y haciendola competente (capaz de aceptar nueva informacin gentica)por medio de elecctricidad o con CaCl2, y asi la bacteria es capaz de producir consecutivamente la insulina.

PRODUCCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES HUMANAS La recombinacin de genes humanos en el ADN de bacterias es una de las posibilidades que ofrece la biotecnologa, y que posibilita obtener protenas humanas con fines teraputicos. Por ejemplo, insulina humana obtenida a partir de la bacteria Escherichiacoli. Esta tcnica es de gran valor porque las bacterias se reproducen rpidamente y pueden duplicar su nmero cada 20 minutos. De esta forma se pueden obtener en poco tiempo muchas copias del gen humano inserto en el ADN bacteriano, y producir grandes cantidades de protenas recombinantes.

ETAPAS EN LA REPRODUCCION A ESCALA INDUSTRIAL Fermentacin: las bacterias son cultivadas en tanques sellados (fermentadores) que contienen un medio de cultivo nutritivo. Extraccin: las clulas son centrifugadas para recuperar las protenas de su interior. Purificacin: se separa la protena recombinante de las otras protenas bacterianas. Formulacin: la protena recombinante es modificada para conseguir una forma estable y estril que puede administrarse teraputicamente.

Crecimiento de microorganismos conteniendo la enzima de utilidad

Purificacin de la enzima Determinacin de la secuencia parcial de aminocidos

Purificacin de mARN total

mARN

ADN

Sntesis de oligonucletidos

Clonacin del ADN en E. coli Identificacin de clones Transformacin de microorganismos Produccin industrial de enzima

Cada una de las fases de la elaboracin implica un manejo muy cuidadoso de los materiales y un estricto control de calidad para optimizar la extraccin, la pureza, la actividad y la estabilidad del frmaco. Dependiendo del producto y del tipo de clula utilizada, la produccin de protenas recombinantes puede ser un proceso simple o ms complejo. Aunque la complejidad del proceso aumentara el costo final del producto, el valor nunca sobrepasar al gasto de aislar el compuesto desde su fuente original (por ejemplo, obtencin de insulina a partir de pncreas de porcinos o bovinos) para llegar a cantidades medicinales.

COMIENZO DE LA TRANSCRIPCIN

ARN polimerasa (ARN pol): En las bacterias slo existe una ARN polimerasa (ARN pol). Las ARN pols de las bacterias se unen directamente al ADN sin utilizar un complejo de iniciacin. ARN pol de la bacteria E. coli est constituido por una enzima de base tetramrica que contiene sub-unidades de tipo alpha y con una esteroquiometra alpha2'. El asemblaje alpha2' es suficiente para alargar la transcripcin

UNIDAD SIGMA
La iniciacin por otro lado necesita la sub-unidad sigma, que completa a sta holoenzima (alpha2'sigma). El factor sigma reconoce al promotor. La enzima de base se puede unir al promotor en ausencia de sigma, pero solamente de manera inficaz y sin especificidad. La funcin principal del factor sigma es la de aumentar la eficiencia de la unin de la ARN polimerasa al promotor y de reducir los enlaces inespecficos. Un solo factor s (s70 chezE. coli) comienza la transcripcin de la mayora de gens. Ciertos bacterifagos (virus de bacteria) como el T4, sintetizan su propio factor s que tiene la habilidad de cambiar la enzima de base de su vctima E. coli para que ella slo y nicamente transcriba

polimerasa explora la doble hlice del ADN de la bacteria y .se la de manera dbil a ella hasta que encuentra a un promotor. La enzima se une entonces fuertemente a la secuencia del promotor, desnatura un segmento pequeo de ADN cercano del promotor y comienza la transcripcin de ste ADN en ARN. El factor sigma se disocia de la holoenzima cuando alrededor de una docena de ribonucletidos han sido asemblados. El primer nucletidodo de la cadena de ADN contiene genralmente una purina (adenina guanina). Los promotores bacterianos poseen cuatro caractersticas comunes:
1.- el punto de comienzo de la transcripcin, denominado +1 2.- la secuencia de la posicin 10 llamada caja de Pribnow (TATAAT), 3.- la secuencia 35 (TGTTGACA) 4.- la distancia entre las secuencias 10 y 35. E punto donde se inicia la transcripcin