In situ hybridization

丁玉强

Lab of Neural Development 
ION
E­mail: dingyq@ion.ac.cn
             Phone: 5492­1773
 Main contents
• In situ hybridization (distribution of 
mRNA)

• Neural tracing (retrograde and 
anterograde)

• General approaches to analyses phenotype 
in KO mice (CNS)
 Main contents
• In situ hybridization (distribution of mRNA)

• Neural tracing (retrograde and anterograde)

• General approaches to analyses phenotype 
in KO mice (CNS)
 Why do we need in situ 
hybridization?
Cellular localization of the interested genes 
(Southern blot)

Distributions of mRNA (ISH) and protein 
(IHC) may differ
Advantages compared with IHC

• Any interested genes, and save 
time

– Takes time to make specific antibody, 
especially when you caught a new gene
– Antibodies against mouse and other 
species are very limited 
 Disadvantages compared with 
IHC
• Keep in mind, localizations of mRNA and 
functional sites (protein) may differ
– e.g. when study functional site of a receptor, you 
need to get antibody
• Procedures are more complicated than IHC
– Two days vs 3­4 days
– Making probes also takes time—but it is not hard 
 Disadvantages compared with 
IHC

• It is not convenient to do double in situ, 
or a combination with IHC, although it 
is practicable. 

– Note: in a combination with IHC, do ISH 
first
 Probes
Two major: 
– RNA probe
– DNA probe (Oligonucleiotide)
• Specificity­­­RNA
• Sensitivity­­­RNA
• S/N­­­RNA
• Complexity­­­RNA (DNA is simple)
Labeling of probe:
Non­radioactive­­­ Digoxygenin ( 地高辛 ) 
Radioactive­­­35S
 Probe sequence selection and 
primer design
­­RNA probe­­
• Using the cDNA sequence not the genome 
sequence
• Blast the sequence and select the specific 
region for the interested genes 
• Length: 300­1000bp; >1kb need to hydrolyze
• Design primers (> 19nt)
Procedure for construction of vectors
Mouse Brain

Total RNA extraction

AAAAAAAAAA
mRNA
TTTTTTTTTTTT Oligo d(T)18
1st Strand cDNA synthesis
AAAAAAAAAA

TTTTTTTTTTTT
First Strand cDNA
PCR
Specific Primer/F
First Strand cDNA
Specific Primer/R
Specific Amplication

PCR product of specific gene A

A
 The features of PCR product and 
subcloning
• Taqase usually adds a A to 3’­end of PCR product 
without DNA template, and this PCR product can 
be ligated with the T Vector

A
A PCR product

T7 SP6

Of course, you can use other vectors, such as pBluescrip
 In vitro transcription
Restriction site
T7 Antisense SP6

DNA construct

Cut with restriction enzyme

T7 Antisense SP6

RNA transcripts

In situ hybridization
 Probe Preparation
Exactly follow the protocols unless you are 
a superman in this!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
1. Cut between 20 µg of mini­prep quality 
plasmid DNA with a five­fold excess of an 
appropriate restriction enzyme for 2 hs. 
Check digestion on mini­gel.
2. Extract cut template in an equal volume of 50 
: 48 : 2 phenol : chloroform : isoamyl alcohol. 
Spin down, transfer the upper layer to a fresh 
tube and extract with chloroform : isoamyl 
alcohol. 
3. Precipitate upper layer with 1/9 volume of 
3M NaOAc and 2 volume ethanol at‑80°C. 
Spin down at 4°C for 15 min. Wash pellet 
with 70% EtOH and spin again. Resuspend 
pellet in 20µl of RNAse­free TE, and store at 
4°C until required.

Write down the concentration, date, and 
owner on the tube
4. Set up the following reaction in 50µl total volume:

5x Stratagene synthesis buffer 10µl
0.1M DTT (RNAase free) 5µl
10mM NTPs/digoxygenin­UTP 2.5µl
RNAsin  0.25µl (10 units)
RNA polymerase (T3, T7 or Sp6)                4.5µl   (90 
units)
DNA template 2.5µg
RNAse free­water (Not DEPC water) to 50µl

Incubate at 37°C for 2 hours.
5. Remove 2µl for mini­gel sample. Add 20 
units of RNAse­free DNAse and continue 
incubation for a further 10 min at 37°C. 
Remove a second 2µl sample and check that 
DNA has been degraded on a mini­gel
6. Add 52µl of 'Stop' buffer to the reaction
7. Transfer the purified probe to a clean tube. 
Add 1/9 volume of 3M NaOAc, pH4.8 and 2 
volumes of ethanol. Precipitate at ­80°C for 
10 minutes. Spin down at 4°C for 15 min, 
wash the pellet in 95% EtOH/5% DEPC­
water and spin again for 5 min 
8. Resuspend the pellet in 50µl of an RNAse­
free solution of 40mM NaHCO3 / 60mM 
Na2CO3. Remove a 1µl sample for OD260 
measurement. Incubate at 60°C for 35 
minutes to hydrolyse the probe into small 
fragments (between 200­300 bp). 35 minutes 
works fine for a 1kb probe. 
 
The amount of time, t , for hydrolysis in 40mM NaHCO3 / 60mM 
Na2CO3 at 60°C is given by:
             (Starting length, kb) ­ (Desired length, kb)
t =  —————————————————————
          (0.11) (Starting length, kb) (Desired length, kb)
 Principles of In situ 
procedures
• All reagents and mailers must be RNAse­
free during pre­ and hybridization
– Treat all containers (forceps) with DEPC water
– Wear gloves always

Again, please exactly follow the protocols

THIS IS TO ALL FRESHMAN!!!!!!!!!!!!
 Sections
Tissues: Fresh tissue, fixed tissue or paraffin­
embedded
Sections: (5­20 µm) are collected on Superfrost/Plus 
    slides (Fisher) and dried in air for 1 hour at RT, 
stored at  ­20°C (for a long period, at 70°C). 

– Alternatively, use RNAse­free slides coated with 
TESTA. Details of how to prepare TESTA coated slides 
are in the Appendix
 A: Pre­Treatment of Sections
• 1. Warm slides to RT and dry at 50°C for 15 min.
• 2. Fix in 4% PFA in DEPC­PBS at RT for 20 min.
• 3. Wash twice in DEPC­PBS at RT for 5 min.
• 4. Treat slides with 50µg/ml Proteinase K in PK 
buffer at RT for between 8­15 min depending on 
the age of the embryo.
– Determine yourself­­­Concentration or digestion time
• 5. Wash once in DEPC­PBS at RT for 5 min. 
        Fix in 4% PFA in DEPC­PBS for 15 min
•  6. Rinse once in DEPC­water
• 7. Acetylation. Place slides in an RNAse­free 
glass trough with a stir bar. Add 250ml 0.1M 
RNAse­free triethanolamine( 三乙醇胺 )­HCl 
pH 8.0. Add 0.625ml acetic anhydride with 
constant stirring. Turn off stirrer when the 
acetic anhydride ( 醋酸酐 ) is dispersed and 
leave for a further 10 min. (Note: Most probes like 
this, but some do not)
• 8. Wash slides in DEPC­PBS at RT for 5 min.
• 9. Hybridization: Prehybridise for 3­4 hs at 
60°C. Replace with 1­2µg/ml of probe and 
continue incubation for a further 12­16 hs.  
These steps should be performed in the 
hybridization oven, not the regular 60°C 
oven, as the latter does not maintain its 
temperature well.
 B: Washing Steps
Note: 1. After hybridisation, it is not necessary 
to use RNAse­free buffers and containers; 2. 
Make sure real temperature of SSC solution 
is 60°C 

1. Place slides in a trough (a big container) with 
a stir bar. Wash in 1xSSC at 60°C for 10 min
2. Wash in 1.5xSSC at 60°C for 10 min, and then 
cool slides to 37°C
3. Wash twice in 2xSSC at 37°C for 20 min each.
4. Treat with 0.1µg/ml RNAse A in 2xSSC at 
37°C for 30 min (remove unbound probe)
5. Wash in 2xSSC at RT for 10 min
6. Wash twice in 0.2xSSC at 60°C for 30 min each
Note: 0.2xSSC is vital to reduce background 
7. Wash once in 0.2xSSC at RT for 15 min
8. Wash once in PBT for 15 min
9. Incubate slides in 4% normal sheep serum in PBT 
for several hr at RT (blocking)
  
C: Antibody Visualisation of 
Digoxygenin
1. Incubate slides with (pre­absorbed) anti­
digoxygenin antibody (alkaline phosphatase 
(AP)­coupled; 1:2000) in 4% sheep serum in 
PBT at 4°C overnight
2. Wash three times in PBT at RT for 30 min 
each
3. Wash twice in Alkaline Phosphatase buffer at RT 
for 5 minutes each. 
4. Visualization: For every ml of AP buffer, add 
1µl of NBT and 3.5µl of BCIP, and develop in 
the dark for between 2­20 hours
Note: Since the AP enzyme is very stable, it is possible to 
wash out the NBT/BCIP, replace with AP buffer, and to 
continue the reaction at a later time
5. Wash twice in PBS to remove substrates
Note: many crystals may exist in the section, so check the 
sections under microscopy
6. Fix slides in 4% PFA for at least 15 min at RT. 
Mount slides in glycerol/PBS.
Note: Fix NBT/BCIP precipitate, because background may 
come dark
For
Whole Mount In Situ Hybridization
In Situ Hybridization on Cultured Cells 

Basically the same

Please see the protocols in Word file
 Main contents
• In situ hybridization

• Neural tracing (retrograde and anterograde)
– A brief introduction

• General approaches to analyses phenotype 
in KO mice (CNS)
 Neural tracing

Take the advantages of:
a. Axonal flows
Retrograde and anterograde

b. Membrane can take up (endocytosis) 
    tracers by receptors or by a non­specific 
    manner
 Well­used tracers
• HRP( 辣根过氧化物酶 ) and WGA­HRP
Both antero­ and 
   retrograde manners
Transganglionic labeling
EM
Combination with ISH
• BDA (Biotinylated Dextran Amine; 结合生物素的葡
聚糖胺 )
– Both anterograde 
   and retrograde
– Easy to handle
– Reveals fine axon 
   terminals and 
   dendrites
– EM

•CTb (cholera toxin B subunit;  霍乱毒素 B 亚单位 )

–Visualization with antibody­­retrograde
• Fluorescent dyes — 荧光染料
(retrograde) 
– Fluoro­Gold (FG) －紫外激发－黄色
– Fast blue (FB) －紫外激发－蓝色
– Nuclear yellow (NY)  －紫外激发－黄色
– DiI (DiA, DiO)  －绿光激发－红色
• Physical diffusion along the membrane
• Can be sued in fixed tissue
• Label fine dendritic spine

DiI labeling in spinal cord

• PHA­L(phaseolus vulgaris agglutinin,  菜豆凝集素
) 

– Anterograde
– Visualization with IHC
 Main contents
• In situ hybridization

• Neural tracing (retrograde and anterograde)
– A brief introduction

• General approaches to analyse phenotypes 
in KO mice (CNS)
Several aspects before you start

– Possible categories of the genes 
•Transcription factor? Receptor? 
Intracelluar kinase? 
– Possible functions of the genes
•Axonal guidance cue? Migration? 
Differentiation? cell fate determination? 
Projection? 
 Step 1
Temporospatial Expression 
patters of the genes
• Where: 
– Localization
• Regions?
– Subpopulation
• Subtypes?
• Neurons or glia?
• Postmitotic vs 
proliferating?

  
• When:
– Earliest stage?
– Time point at which expression pattern 
changes?
– Transient or persistent?
One more example of further defining 
subtypes of the interested genes
 Step 2
Earliest stage detected 
morphological changes
Purpose of KO:

Gene’s function
Mechanisms

Molecular events 
occur earlier
 Step 3
Possible causality 
between inactivation of gene 
and phenotype 
• 1. Expression of genes that have possible association
with the phenotype, and other approaches
• 2. Think about how LOF makes the defects happens
• 3. Test your hypothesis
– GOF
– In vitro assay
• 4. Make a story
Gene expression profiles in the mutant
GOF to test the hypothesis
• Collection of the data you got, and 
draw a conclusion

– DCC is essential for ventral 
migration of early­born spinal 
interneuron during spinal cord 
development
• Submit your paper
– Choose one you like most: 
•Cell, Nature, Science, or….
• Wait for comments­­­revise (add more 
data)­­­and send back­­­
• publish 
• Get your degree
• Continue your research career, go 
abroad to learn more
• A PI position is waiting for you