General procedure for

producing transgenic
mice.
 promotore esone introne spazio intergenico

DNA 1 2 3 4 5
5’ 3’

TRASCRIZIONE

RNA precursore

PROCESSAMENTO
ATG STOP

mRNA maturo AAAAAA(A)n

TRADUZIONE

proteina
The rat growth hormone gene (RGH), under the control of a mouse promoter region that is responsive
to heavy metals, is inserted into a plasmid and used to produce a transgenic mouse. RGH compensates
for the inherent dwarfism (lit / lit) in the mouse. RGH is inherited in a Mendelian dominant pattern in
the ensuing mouse pedigree.
Preparation of embryonic stem (ES) cells. Fertilized mouse eggs divide slowly at first; after 41/2 days,
they form the blastocyst, a hollow structure composed of about 100 cells surrounding an inner cavity
called the blastocoel. Only ES cells, which constitute the inner cell mass, actually form the embryo. Other
cells form the trophectoderm, which gives rise to the membranes (amnion and placenta) by which the
embryo is attached to the uterine wall. Embryonic stem cells can be removed from the blastocyst and
grown on lethally irradiated “feeder cells.”
General procedure for producing gene-
targeted knockout mice. Embryonic stem
(ES) cells heterozygous for a knockout
mutation in a gene of interest (X) and
homozygous for a marker gene (here,
black coat color) are transplanted into the
blastocoel cavity of 4.5-day embryos that
are homozygous for an alternate marker
(here, white coat color). The early
embryos then are implanted into a
pseudopregnant female. Some of the
resulting progeny are chimeras, indicated
by their black and white coats. Chimeric
mice then are backcrossed to white mice;
black progeny from this mating have ES-
derived cells in their germ line. By
isolating DNA from a small amount of tail
tissue, it is possible to identify black mice
heterozygous for the knockout allele.
Intercrossing of these black mice produces
individuals homozygous for the disrupted
allele, that is, knockout mice.
Cell-type-specific gene knockouts
using the loxP-Cre recombination
system. Two loxP sites are inserted
on each side of an essential exon (2)
of the gene of interest (i.e., gene X)
(blue) by homologous recombination.
These sites do not disrupt gene
function. The loxP-containing mouse
is crossed to a transgenic mouse
carrying a cell-type-specific promoter
controlling expression of the Cre
recombinase, which induces
recombination between loxP sites.
This mouse is heterozygous for a
constitutive gene X knockout. In the
resulting loxP-Cre mouse, Cre protein
is produced only in those cells in
which the promoter is active, and in
those cells recombination therefore
occurs between the loxP sites, leading
to deletion of exon 2. Since the other
allele is a constitutive gene X
knockout, deletion between the IoxP
sites results in complete loss of
function in all cells expressing Cre.
 I Virus

Virus a RNA = Retrovirus

Virus a DNA = Adenovirus
I Retrovirus (o virus a RNA)

mRNA
DNA

Integrazione

assemblaggio
mRNA
I Retrovirus (o virus a RNA)

Dr. Jekyll Mr. Hyde

Si integrano nel Integrano nel

genoma umano e genoma del
prendono sotto il paziente un gene
loro controllo geni terapeutico.
endogeni
alterando
l’espressione e
causando un
tumore.
 Problemi
 Geni terapeutici sino a 8
kb

 Integrazione possibile solo

in cellule in divisione
(escluse ad. es. cellule
nervose, cardiache e
scheletriche)

 Integrazione casuale che

può portare ad altre
 Adenovirus (virus a DNA)
Il loro genoma è costituito da DNA (36kb);
Sono patogeni naturali dell’uomo (raffreddore);
Possono accogliere geni terapeutici più lunghi;
Possono “infettare” anche cellule non in divisione;
DNA virale non si integra ma resta isolato (episoma) nella ce
Si elimina il pericolo della cancerogenesi;
Espressione transitoria (episoma si perde nelle divisioni cellu
Risposta immunitaria alle proteine della membrana.
 Terapia genica dell’immunodeficienza grave legata all’X

Il trattamento della Severe

Combined
Immunodefficiency Disease
(SCID) legata al
cromosoma X è stato il
primo esempio
documentato di correzione
permanente di un grave
difetto ereditario mediante
terapia genica
 La malattia SCID-
X1
• deficienza per la catena γ del recettore per
citochine sulla superficie di precursori dei
linfociti T
• il differenziamento di un precursore delle
celluleT e delle cellule NK (natural killer) è
bloccato
• bloccata anche la proliferazione dei linfociti B
• morte entro i 5 anni di vita
 Trattamenti possibili

-Trapianto di midollo osseo da individuo istocompatibile

- Terapia genica (a partire dal 1999):

1.trasfettare precursori dei linfociti T con un vettore
retrovirale contenente il gene normale per la catena γ del
recettore
2.reinfondere le cellule trasformate nel paziente
risultato: miglioramento immediato delle funzioni del sistema
immunitario in diverse decine di bambini trattatin

i precursori trasfettati riacquistano anche la proprietà di

perpetuarsi replicandosi
 Tre dei pazienti hanno
sviluppato una leucemia
con proliferazione
incontrollata di linfociti
T maturi 30-34 mesi
dopo l’intervento: uno
dei tre è deceduto
 Il rischio insito nella terapia genica con vettori retrovirali

- l’integrazione nella sequenza codificante di un gene può causare

la sua inattivazione
- l’integrazione a monte di un gene può causare una
iperespressione o una espressione incontrollata

nei tre casi SCID si è avuta inserzione a monte del gene LMO2,
che codifica un fattore di trascrizione implicato nella ematopoiesi
un’espressione aberrante di questo gene è implicata nella leucemia
linfoblastica acuta da linfociti T nei bambini
Types of gene therapy in mammals.
 =AMH

AMH RECEPTOR

+ ANDROGEN RECEPTOR
 =AMH

Persistance of Mullerian
Ducts Syndrome= PMDS

Phenotype: male
+ uterus
(cryptorchidism)
AMH RECEPTOR
La corretta differenziazione di testicoli è necessaria
per lo sviluppo di genitali maschili

La corretta differenziazione di ovaie NON è necessaria

Per lo sviluppo di genitali femminili

DETERMINAZIONE DEL SESSO =

DETERMINAZIONE DEL SESSO GONADICO
46,XY

47,XXY

48,XXXY

47,XYY

46,XX
48,XXXY
Sindrome di Turner
45,X0
FENOTIPO MASCHILE FENOTIPO FEMMINILE
46,XY 46,XX
47,XXY 47,XXX
48, XXXY 48,XXXX
47,XYY 45,X0

QUALUNQUE SIA IL NUMERO DEI CROMOSOMI X,

LA PRESENZA DEL CROMOSOMA Y E’ SUFFICIENTE
PER LA DETERMINAZIONE IN SENSO MASCHILE
DEL SESSO GONADICO
 SRY SRY

X Y XX male XY female
(a) The sequence-
tagged site (STS)
content of naturally
occurring Y
chromosome fragments
was used to order the
STSs on a Y
chromosome map.
Note: “q−” means
“lacking the q arm”;
“trans Yq” means
“translocation of Yq to
an autosome.” (b) Deep
freeze containing plates
of YAC clones used in
the human genome
project.
 Yp Pseudo 1A1
(140 Kb 60 Kb SRY
autosomal
pairing
region

ZFY 35 Kb
1 1A2
(140 Kb)
Yq 2

1B
3

4A 1C

1959 1966 1986 1987 1989 1990

The hunt for the testis determining factor (TDF) from 1959, when the Y chromosome was shown
To be male-determining in both mouse and man, to 1990 and the identification of the sex-determining
region (SRY in humans, Sry in mice).
 INVERSIONI DEL SESSO

46,XY femmine: 10% mutazioni o delezioni di SRY

46,XX maschi: 85% traslocazioni di SRY sull’ X

OVAIO

SRY
TESTICOLO
Nature 1991 May 9;351(6322):117­21
Male development of chromosomally female mice transgenic for Sry.
Koopman P, Gubbay J, Vivian N, Goodfellow P, Lovell­Badge R.
The initiation of male development in mammals requires one or more genes on the Y chromosome. A recently isolated gene, termed SRY 
in humans and Sry in mouse, has many of the genetic and biological properties expected of a Y­located testis­determining gene. It is now 
shown that Sry on a 14­kilobase genomic DNA fragment is sufficient to induce testis differentiation and subsequent male development 
when introduced into chromosomally female mouse embryos.
 FEMALE WNT7 Mullerian ducts Wollfian
DUCTS & WNT4 ­> oviducts Ducts
ORGANS ­> uterus
regress
­> upper vagina

Ovarian
Follicle cells Oocytes Theca cells connective
OVARY
Tissue &
vasculature
BMP8b
DAX­1 WNT4
SF1
WT1
URO­
BIPOTENTIAL Supporting  Steroidogenic Mesenchymal 
GENITAL M33 Primordial
RIDGE GONAD      cell   precursors       cells
Germ cells
LHX9 precursors
LIM1? SRY
EMX2 SF1
DAX­1 SOX9 WNT4
DAX­1
WT1

SOX9 Peritubular
        Pro­
TESTIS SF1 Sertoli  WT1 Leydig PTCH myoid cells& 
 cells GATA4 spermatogonia
DHH PTCH cells vasculature
DMRT1
AMH T DHT FGF9

MALE Wollfian ducts External Mesenchymal

Mullerian
DUCTS & ­> epididymus genitalia cells
Ducts
ORGANS ­> vasadeferentia MESONEPHOS
regress
­> seminal vesicles