Aislamiento e Identificacin de Parsitos

Generalidades
Diagnstico . de laboratorio
Reconocer verdaderos parsitos Diferenciarlos de otros objetos y artefactos

Examen de muestras

Descubrimiento de un parasito evidenciar parasito, a simple vista o microscopio Identificacin objeto es un parasito a una fase del ciclo vital: trofozoto, quiste, huevo, larva o ninfa.

Falsos positivos, ya que en heces, orina, sangre, esputo y tejidos pueden verse numerosos objetos que parecen parsitos

HECES FECALES

Consistencia 1. Dura, resiste puncin 2. Formadas, pueden puncionarse

Color

Elementos

1. Negro 1. Pulpa Examen de las hecesy fibras casi puras 2. Marrn oscuro 2. Claramente fibrosas

Identificacin 3. Marrn(tonos, de elementos moderada o y registro de 3. Cantidad negro a escasas de fibra macroscpicos, olores o colores patolgicos Eleccin de mtodo: arcilloso) 4. Pulposas, pueden 4. Marrn claro 4. Heces coloidales puras Examen microscpico de heces, no existe una tcnica peculiares reconformarse Consistencia Elementos nica, tampoco una optima. (pulpa a moco) (1 a 7) 5. Cantidades anmalas de elementos con moco escaso Sueltas, se Se tiene a la combinar varios mtodos. adaptan que 5. Amarillo 5. Heces normales, Muestra normal: tcnica y modo en que se formadas o La fiabilidad depende de la forma de recipiente como sangre, exudados celulares, fragmento practique consistencia blanda o pulposa,Verde Descripciny 6.diarreicas, fluyen 6. de color marrn 6. Heces con mucho moco de tejidos,coloidales 2,3,4 no digeridos y residuos de alimento muestra de 7. Acuosas, pueden verterse 7. Arcilloso fecal 7. Moco con heces medicamentos escasas**
3. Blandas, pueden cortarse 8. Otros* 8. Otros (sangre) *Ciertos colores, como azul, rojo o purpura, pueden indicar la presencia de algn tipo de medicacin **Una muestra que contenga sangre y moco macroscpico con o sin pus debe registrase como disentrica, sin codificar consistencia o color

Color

Examen directo
Frotis fecal Trofozotos y solucin Frotis grueso de Kato: quistes de glicerina-verde fresco, teido, dedeVentajas Forma lente y son transparentes Tincin malaquita
Frotis salino directo
Suspensin en suero salino Diagnostico de parasitosis intestinales en todo el mundo

permanente salino Gota de suero

2mg de heces No sirve para Caracteres diagnsticos se Preparaci tamao Identificacin Mezclan y se retiran partculas de granpueden diagnostico de frrica: aspecto distinguen mejor y Hematoxilina Identificacin fiable de Diagnostico n Cubreobjetos verse a mayor aumento. morfolgico evidentes

Protozoos Aceite de inmersin y protozoos o Helmintos de huevos de Entamoeba protozoos cuantitativo histolytica y otras larvas de Necator,pequeas amibas como cualitativo de Necesario helminto, ni Ancylostoma, Cantidad mxima de elementos fecales observables Schistosoma teirlo helmintiasis 2 microscopistas o mas Con solucin acuosa de yodo Frotis Trichuris, Ningnmansoni pueda pasar desapercibidotampocoColorante tricrmico: componente pueden examinar la misma para diferencia tejidos, menos intestinales preparacin tiempo ideal heces duras o y cuidado Ascaris liquidas
Examinaci n
Protozoos, Huevos y larvas . Objetivo x100 No puede emplearse el Puede conservarse para aceite de inmersin

Larvas y huevos de helmintosConservar con PVA o

solucin fijadora de

examen posterior Identifican sin tincin Schaudinn Para larvas tincin de yodo, porque las inmoviliza

Muestras fcales conservadas

Cuando se recogen grandes Frotis fecal cantidades de muestras y no sea en Muestra Muestra Muestras PVA conservadas con conservada conservada en MIF: conservar factible solucin de inmediato formalina: con analizar MIF Falta de protozoos infecciones adherencia de la Schaudinn Helmnticas conservantes: Quistes, huevos Solucin de extensin 4 y larvas Cuando no sea En heces microscpicas conveniente el solucin se de diarreicas y formalina, de parsitos fijado PVA Solucin de Solucin de pulposas conservan Schaudinn, yalcohol polivinlico Shaudinn PVA: Shaudinn y PVA: trofozotos infecciones teidos (PVA) helmnticas por mertiolato-yodoy permanentes mtodos de para hallazgo de concentracin protozoos formaldehido

Mtodos de concentracin de muestras fecales

Sedimentacin en y separacin de quistes decon Concentracin Centrifugacin con Sedimentacin agua ter formalina-ter protozoos y huevos de helmintos Huevos de HCl para disolver Concentrar Por sedimentacin, flotacin o combinacin helmintos ciertos huevos de presentes se componentes y Sedimentacin:suspendiendo la helmintos en muestra de decantan en quistes ter para disolver lquido protozoos agua o solucin acusa que sedimente natural y separar otros sobrenadante de la Descubrimiento o por centrifugacinsuspensin Sedimento se de huevos de Quede reduce a huevos esquistosomas sedimento Flotacin: de suspender la muestra enheces medio un y partculas en huevos y otras las misma de densidad superior a la de los quistes ypara partculas de Formalina densidad tamao y huevos , para que se concentren fijar y conservar en superficie densidad muestra
similares

La ventaja del empleo de cidos es su capacidad de disolver el moco y otras sustancias diversas, dando lugar a un sedimento mas limpio. Resultan tiles para el descubrimiento de huevos de equistosomas y otros trematodos.
El cido mas utilizado es el HCl (15%): Suspensin en cido Mezcla Centrifugado Re suspensin en cido Adicin de ter Agitacin en un tubo Se centrifuga y se separa el sedimento. Se transfiere a un portaobjeto y se examina en busca de larvas.
Schistosoma haematobium

 En esta tcnica los huevos y los quistes se concentran en la parte superior ya que su densidad es menor al del medio de suspensin. Flotacin en salmuera: No deshirata quistes se emplea El mtodo de flotacin que y huevos. para hacer flotar los huevos de parsitos nematodos como uncinarias,muy utiles paraquistes Estas tecnicas de flotacion son triscostrongilios, Ascaris y Trichuris. de protozoos y huevos de helmintos (asacaris Trichuris, Este medio no sirve para los huevos de trematodos, de los quistes y Taenia e Hymenolepsis nana) de todos los quistes de protozoos intestinales. toma muestras Se Pueden ser: de heces, se mezcla y se suspende en 10 veces su
vol. de salmuera. Se filtra a travs de una gasa y se transfiere a un tubo de ensaye, dejndolo en reposo por 20-30 min. Los huevos se retiran con un asa y se ponen en un portaobjeto para su exanimacin.

 Se basa en los tropismos positivos: geotropismo, termotropismo e hidrotropismo de los trofozotos de protozoos y larvas de helmintos. Es til principalmente para Balantidium coli y larvas de Strongyloides stercoralis.

Los mtodos son tiles para saber aproximadamente la

Descrita por Stoll y Hauscheer. intensidad d infeccin. Bsicamente se toman muestras de heces, se pesa y se mezcla vigorosamente con agua (1/15 mL). Se papel Se toman partescoloca de sobre iguales esta higinico muestra fecal. suspensin (0.3mL) y se mezclan con partes iguales travs de una Se presiona a de solucin saturada de fructosa. tela. Los huevos flotan en este Se retira las heces fecales medio.

que traspasan la tela. Se colocan en un portaobjetos y se cubre con papel celofn. Se espera de 1-2 horas para

 Los huevos observados en muestras fecales pueden ser difciles de diagnosticar, mientras que las larvas que surgen de ellos se identifican fcilmente. Se pueden cultivar por:

Harada y Mori (1955): Cultivos en tubos de ensaye. Se extiende carbn: Se realiza mezclandouna tira dede heces blandas o Cultivos en una fina pelcula de heces en una parte papel filtro. Se coloca la tira enagua conde a 10 partes de carbn animal fino granular reblandecidas con un tubo 5 centrifugacin con agua destilada. Se humedeceel tubo se T ambiente en la oscuridad por 7-10 das aadiendo a se conserva bien y a guarda en un recipiente cubierto. diario das despusse valla necesitando. la superficie, de donde pueden 7-10 agua segn las larvas migran a retirarse por el mtodo de Beaver: Las humedece una almohadilla gruesa de tela de algodn,flujo del agua y ala se larvas migran hacia abajo contra la corriente de se presiona alcanzar superficie de cultivo. sobre la en nivel de esta se sumergen hacia el fondo, donde pueden verse son una mayora de las larvas migran hacia la almohadilla de algodn. La lupa y tomarse con una pipeta para su examen microscpico.

 Para el examen de las heces en busca de gusanos adultos pueden utilizarse dos mtodos:

Despus de las heces, la sangre es el medio donde con mayor frecuencia se encuentran las distintas fases de los parsitos animales.

PALUDISMO

BABESIASIS FILARIASIS

TRIPANOSOMIAS IS AFRICANA

Extensin fina

Cantidad de sangre pequea Los eritrocitos reposan planos sobre la superficie del vidrio. Es til para estudiar detalles de los hemates y de los parsitos en la sangre.

Extensin gruesa

Mayor cantidad de sangre til para el diagnstico rpido de las parasitemias No sirve para estudios anatmicos finos.

El primer estadio del parsito se denomina microfilaria y estn presentes el sistema circulatorio. Migran de la circulacin profunda hasta la circulacin perifrica. Durante el da estn presentes en las venas profundas y durante la noche migran a la circulacin perifrica, desde donde el gusano es transferido al vector.

Aedes

Anopheles

Culex

Mansonia

CENTRIFUGACIN

Onchocerea volvulus

Mansonella

Examen de orina

Las parasitosis urinarias, muy infrecuentes hasta la fecha en nuestro medio, estn siendo diagnosticadas cada vez con mayor frecuencia.

La orina se define como el lquido excretado por los riones que contiene sales y productos de desecho del organismo disueltos o en suspensin en agua.

Volumen

Transparencia

1 a 1.5 L /24 horas

Lmpida

Color

Densidad

Amarillo claro

1.012 a 1.024 g/mL

pH

Sedimento

4a5

Escaso

Sedimento
Clulas epiteliales Microorganismos

Cristales

Cilindros

Trichonomas vaginalis

Schistosoma haematobium

Fuscina

Azul de metileno Alcohol cido

Strongyloides stercoralis

Paragonimus westermani

Ascaris lumbricoides

Probablemente puede ser el mtodo ms cmodo y a veces el nico de confirmar la sospecha clnica de una infeccin.

Si una masa extirpada quirrgicamente contiene un parsito lo ms seguro es que se encuentre en el centro
Se obtienen rebanadas muy delgadas que se pegarn a un portaobjetos y se teirn para diferenciar los componentes de los tejidos.

Se anestesia la zona y se retira parte o toda la lesin, con un poco de tejido sano, que servir de comparacin.

El tejido se introduce en una formol al 10% que evitar que el tejido presente modificaciones.

Examinacin al microscopio

Mansonella streptocerca

Mansonella ozzardi

Trypanosoma brucei

Trypanosoma cruzi

Trichinella

Taenia solium

Schistosoma

Schistosoma mansoni

Aislar quistes y huevos de parsitos de ropa, vegetales, agua y tierra

Los huevos se repartes en forma desigual y poco uniforme.

Las muestras obtenidas del ambiente suelen recogerse de una forma ms selectiva.

Se toman compresas de gasa que se humedecen y se presionan contra una muestra de tierra hmeda

Se cubren con un plstico y se dejan en reposo durante 20 o 30 minutos

Se coloca en posicin invertida en un vaso de sedimentacin lleno casi hasta el borde de agua caliente

TCNICAS DE CULTIVO
Constituyen una parte sustancial del estudio actual de los parsitos; sobre todo especies de protozoarios.

Propsito de los cultivos

Diagnstico preciso del parsito. Produccin del organismo en la preparacin de antgeno para diagnstico inmunolgico. Fuente de inoculacin para animales susceptibles en experimentacin. Pruebas de frmacos In vitro. Investigacin de fisiologa de los parsitos.
El cultivo ideal de parsitos con propsitos prcticos o de investigacin debe ser un medio axnico, es decir, carente de seres vivos asociados, como bacterias. El cultivo de flagelados sanguneo e hstico exige medios libres de bacterias.

CULTIVO DE PROTOZOARIOS PARSITOS

Amebas y otros parsitos intestinales Para un cultivo de amebas intestinales se requiere heces frescas no contaminadas con orina Pueden emplearse heces que contengan quistes o muestras lquidas con trofozoitos vivos. Para evita la rpida superpoblacin de bacterias entricas es conveniente agregar penicilina cuando se inocula la muestra fecal en el medio de cultivo. Se inocula alrededor de 0.5 ml del material en el medio de cultivo y se inocula a 37C . Los subcultivos se hacen generalmente a intervalos de 48 hrs.

Medio monofsico
Totalmente lquido.
son de difcil aplicacin y uso en las reas endmicas de los pases pobres, debido a su costo y a la necesidad de importacin lo que dificulta su aprovechamiento.

Medio monofsico de Balamuth: Suele utilizarse para el aislamiento y el mantenimiento de Entamoeba histolytica y algunos otros protozoarios intestinales. En el cultivo de Leishmania se han empleado medios de cultivo de clulas de mamferos, suplementados con porcentajes variables de Suero Bovino Fetal (SBF). Estos medios son de difcil aplicacin y uso en las reas endmicas de los pases pobres, ya que el costo y la necesidad de importacin dificultan su aprovechamiento.

Medio difsico
Son medios de dos fases una slida y una lquida Entre algunas de medios difsicos y muchas veces se Existen varios las ventajas prcticas de la adopcin de usan bifsicos para el diagnstico primario se medios para el diagnstico de infecciones por mencionan las siguientes: hemoflagelados: Existen tambin algunos inconvenientes entre los cuales
- Son particularmente valiosos para el aislamiento primario Medio de agar podramos citar: sangre difsico. el son apropiados para el crecimiento en -y Nomantenimiento, por largo tiempo. Nicolle)masa de los Medio NNN (Medio de Novy, McNeal, -Permiten la morfognesis celular. agar, por lo que es flagelados por la presencia del necesariofcil preparacin ylos concentrado obtenido por Se recomienda mejor de medios lquidos para la - Son de utilizar emplear el bajo costo. sedimentacin con centrifugacin de heces en suero preparacin de antgenos convencionales y clulas para salino bioqumicos. estudios en lugar de las heces completas.

Medios especficos
Cultivo axnico de Entamoeba histolytica en ausencia de de Giardia : mantuvo Giardia Cultivo axnico bacterias. Lquido transparente monofsico, con lamblia en cultivo con ycrecimiento una levadura Medio de Trassell asociacin de rpido de Johnson: aislamiento (Candida). El medio empleado para establecer un poblaciones densas de Es sencillo y las amebas. Es se de Trichomonas vaginalis. simplificado (STS): Medio de Tripticasasaero colonias fue suero humanoen numerosos estudios componente crecimiento vaginalis de exudados esencial en un caldo de peptona Sirve para el aislamiento de T. consigue buen Medio de culbertson: clorhidrato de L- cisteina. que inmunologicos y bioqumicos satisfactorio para contenia glucosa y Medio de E. histolytica uretrales y vaginales. Se utiliza para obtener cultivos el separacin crecimiento axenico, este medio Paraaislamiento y primario de Medio de Willaert: Mtodo ms Naegleria y sencillo para libres de bacterias. Las bacterias pueden eliminarse se combino con glutatincisteina Medio difusico de Tobie: desarrollado para ellquido cultivo Acanthamoeba seriada en un medio que contenga a partir del cultivar Naegleria y Acanthamoeba comprende por transferencia de tripanosomas africanos; tambin nutritivo o poco satisfactorio cefalorraqudeo o de deshidrostreptomicinal. para del tejido cerebral. el uso de sulfato penicilina y placas de agar no el cultivo de T. crazi, T. rangeli, Leishumania tropica y nutritivo. muchas especies de hemoflagelados.

Xenodiagnstico
Es de utilidad en la identificacin de reservorios animales en caso de que las tcnicas serolgicas estndar son de utilidad dudosa. Chinches criadas en el laboratorio se alimentan directamente de pacientes o de su sangre a travs de una membrana. A cabo de 10-30 das de la ingestin de la sangre, se elimina el contenido intestinal del insecto en busca de flagelados, que puedan inocularse en ratones para obtener una confirmacin del diagnstico.

CULTIVO DE HELMINTOS
La identificacin de huevos de parsitos intestinales en las heces a veces es difcil, puesto que tienen morfologa y tamao similar. Se ha intentado cultivar helmitos parsitos en medios nutrientes.

cultivos
Cultivo de Harada-Mori en papel filtro
Tcnica de cultivo simple en tubo de ensaye con Tcnica de cultivo inclinado en papel filtro: se corta una tira de papel filtropara la incubacin de las heces papel filtro de igual tamao que el portaobjetos y Cultivo deportaobjetos con la tira Mtodo til para se coloca el carbn vegetal: en una caja de petri; un extremo del portaobjetos se larvas; ya que este obtener gran nmero deeleva. La ventaja de la cultivo es que se examina de forma directa al mezcla dey heces y carbn granulado, microscopio se observan las larvas libres y el parasito produce un medio similar a las condiciones adulto sobre la superficie de la masa fecal humeda o en agua circulante. alladas en el suelo.

CULTIVO DE ATROPODOS
Con fines diagnsticos conviene cultivar atropodos desde la fase inmadura hasta la forma adulta.

TCNICAS MOLECULARES
Con objeto de incrementar la sensibilidad y especificidad de diagnstico.

Nuevos mtodos de diagnstico molecular como:

La reaccin en cadena de la polimeraza (PCR) La tcnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin en conjunto con PCR (PCR-RFLP). La tcnica de hibridacin y anlisis de ADN. Estn siendo integradas en la identificacin y cuantificacin, as como para obtener genes de importancia en la interaccin hospedero-parsito

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