1

GUSTAVO DELGADO
Len, JULIO del 2007
Consultora FARMAMUNDI
MDULO 4
LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE
MEDICAMENTOS
PROYECTO FARMAMUNDI/UNAN-LEN
2
OBJETIVOS ESPECIFICOS

Entrenar a personal de laboratorio en el uso de las tcnicas
quimiomtricas aplicadas a la validacin de los mtodos
analticos.
Entrenar al personal en la aplicacin de la validacin con el uso
de calculadoras con funciones de estadstica bsica
Aplicar la validacin de mtodos analticos utilizados en anlisis
farmacuticos.
OBJETIVO GENERAL
Entrenar a personal de laboratorio en la evaluacin de los diferentes
parmetros que caracterizan el desempeo de un mtodo analtico.
3
CONTENIDO

INTRODUCCIN: Requisitos de las normas ISO/IEC 17025.
Procedimiento normalizado.. Definicin de validacin. Parmetros
que caracterizan el desempeo del mtodo. Reglas para la
validacin. Plan de la validacin.

TCNICAS DE LA VALIDACIN A TRAVS DE EJEMPLOS EN
ANLISIS DE AGUAS : Evaluacin de la precisin (repetibilidad y
precisin intermedia). Linealidad y rango. Control de calidad de la
linealidad (elaboracin de carta de control bidimensional). Lmite de
deteccin y de cuantificacin. Evaluacin de la exactitud
(evaluacin del bias o sesgo, efecto de matriz, recobro, correccin
de resultados). Sensibilidad, robustez.

ESTUDIO DE CASOS: Resolucin de problemas.

4
INTRODUCCION
5

Evaluacin de la conformidad
ISO 17000-11
1. Enfoque funcional - I
La evaluacin de la conformidad es una
serie de tres funciones que satisfacen una
necesidad, o una solicitud, de demostrar que
se cumplen los requisitos especificados:
seleccin;
determinacin, y
revisin y atestacin.
6
Enfoque funcional - I
La evaluacin de la conformidad se puede aplicar a
productos (definido de modo que incluye servicios),
procesos, sistemas y personas, y
tambin a aquellos organismos que prestan servicios de
evaluacin de la conformidad.
Por comodidad en esta norma se utiliza la expresin objeto de evaluacin
de la conformidad para referirse en conjunto a cualquiera o a todas estas
entidades.
7
Requiere
vigilancia?
Selecin
Determi-
nacin
Revisin y
attestacin
Informacin sobre
elementos
seleccionados
Informacin sobre
el cumplimiento de
requisitos especificados
Cumplimiento
demostrado de los
requisitos especificados
Necesidad de demostrar cumplimiento de requisitos especificados
S
No
Final
A:
funcin
EC
B: salida
Clave:
Evaluacin de conformidad: Enfoque funcional
8

2. Seleccin
Actividades de planificacin y preparacin
para
Recopilar o producir informacin para la funcin de
determinacin

Caracteristicas del organismo de EC,
Muestreo
Requisitos especificados(por ejemplo estandares)
Procedimientos (mtodos de prueba e inspeccin)
9

3. Determinacin - I
Las actividades de determinacin se llevan a cabo con el fin de
obtener informacin completa relativa al cumplimiento de los
requisitos especificados por el organismo de evaluacin de la
conformidad o su muestra.

Ensayo/prueba (4.2)
Inspeccin (4.3)
Auditora (4.4)
Evaluacin entre pares (4.5)
10
Ensayo/prueba (17000:2004, 4.2)
determinacin de una o ms caractersticas de un
objeto de evaluacin de la conformidad, de acuerdo
con un procedimiento (3.2).

NOTA El trmino ensayo/prueba se aplica en general a
materiales, productos o procesos.
11
Objeto y alcance de ISO17011
Para los propsitos de esta norma
internacional, los OEC proveen los
siguientes servicios:
1. Ensayo/prueba.
2. Inspeccin
3. Certificacin de sistemas de gestin.
4. Certificacin de productos
5. Calibracin.
12
REQUISITOS DE LA NORMA ISO/IEC 17025:2005
Diagrama de Ishikawa aplicado al items 5.4.
Mtodos de ensayo y de calibracin y validacin mtodos
G. Delgado
5.4. Mtodos y Validacin
Mtodos de ensayo Generalidades
Estimacin incertidumbre Validacin Mtodos
Control de datos
Seleccin
Desarrollados
No Normalizados
Mtodos y proc.
apropiados
Incertidumbre
Instructivos, normas,
man., actualizados
Verificaciones
Sofware validados
Proc. Proteccin
Mantenimimiento
computadoras
Calibraciones
Mediciones
Tomar todos componentes
No normalizados
Diseados
Normalizados modificados
Normalizados,
previa verificacin
Apropiado, validados
13
5.4.1. Generalidades. El laboratorio debe aplicar mtodos y procedimientos
apropiados para todos los ensayos o las calibraciones dentro de su alcance. Estos
incluyen el muestreo, la manipulacin, el transporte, el almacenamiento y la
preparacin de los tems a ensayar o a calibrar y, cuando corresponda, la
estimacin de la incertidumbre de la medicin as como tcnicas estadsticas para
el anlisis de los datos de los ensayos o de las calibraciones.
El laboratorio debe tener instrucciones para el uso y el funcionamiento de todo el
equipamiento pertinente, y para la manipulacin y la preparacin de los tems a
ensayar o a calibrar, o ambos, cuando la ausencia de tales instrucciones pudieran
comprometer los resultados de los ensayos o de las calibraciones. Todas las
instrucciones, normas, manuales y datos de referencia correspondientes al trabajo
del laboratorio se deben mantener actualizados y deben estar fcilmente
disponibles para el personal (vase 4.3). Las desviaciones respecto de los
mtodos de ensayo y de calibracin deben ocurrir solamente si la desviacin ha
sido documentada, justificada tcnicamente, autorizada y aceptada por el cliente.
REQUISITOS DE LA NORMA ISO/IEC 17025:2005
5.4 Mtodos de ensayo y de calibracin y validacin de los mtodos
14
5.4.2. Seleccin de los mtodos

El laboratorio debe utilizar los mtodos de ensayo o de calibracin, incluidos los de
muestreo, que satisfagan las necesidades del cliente y que sean apropiados para
los ensayos o las calibraciones que realiza. Se deben utilizar preferentemente los
mtodos publicados como normas internacionales, regionales o nacionales. El
laboratorio debe asegurarse de que utiliza la ltima versin vigente de la norma, a
menos que no sea apropiado o posible. Cuando sea necesario, la norma debe ser
complementada con detalles adicionales para asegurar una aplicacin coherente.
Cuando el cliente no especifique el mtodo a utilizar, el laboratorio debe seleccionar
los mtodos apropiados que hayan sido publicados en normas internacionales,
regionales o nacionales, por organizaciones tcnicas reconocidas, o en libros o
revistas cientficas especializados, o especificados por el fabricante del equipo.
Tambin se pueden utilizar los mtodos desarrollados por el laboratorio o los
mtodos adoptados por el laboratorio si son apropiados para el uso previsto y si
han sido validados. El cliente debe ser informado del mtodo elegido. El
laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los mtodos
normalizados antes de utilizarlos para los ensayos o las calibraciones. Si el
mtodo normalizado cambia, se debe repetir la confirmacin.
Si el mtodo propuesto por el cliente se considera inapropiado o desactualizado, el
laboratorio debe informrselo.
15
5.4.3. Mtodos desarrollados por el laboratorio

La introduccin de los mtodos de ensayo y de calibracin desarrollados por el
laboratorio para su propio uso debe ser una actividad planificada y debe ser
asignada a personal calificado, provisto de los recursos adecuados.
Los planes deben ser actualizados a medida que avanza el desarrollo y se debe
asegurar una comunicacin eficaz entre todo el personal involucrado.

5.4.4. Mtodos no normalizados

Cuando sea necesario utilizar mtodos no normalizados, stos deben ser acordados
con el cliente y deben incluir una especificacin clara de los requisitos del cliente y
del objetivo del ensayo o de la calibracin. El mtodo desarrollado debe haber sido
validado adecuadamente antes del uso.

16
Mtodo No Normalizado (cont)
Nota: Para los mtodos de ensayo o de calibracin nuevos es conveniente
elaborar procedimientos antes de la realizacin de los ensayos o las
calibraciones, los cuales deberan contener, como mnimo, la informacin
siguiente:
*una identificacin apropiada;
*el alcance;
*la descripcin del tipo de tem a ensayar o a calibrar;
*los parmetros o las magnitudes y los rangos a ser determinados;
*los aparatos y equipos, incluidos los requisitos tcnicos de funcionamiento;
*los patrones de referencia y los materiales de referencia requeridos;
*las condiciones ambientales requeridas y cualquier perodo de
estabilizacin que sea necesario.
*la descripcin del procedimiento, incluida la siguiente informacin:
-la colocacin de las marcas de identificacin, manipulacin, transporte,
almacenamiento y preparacin de los tems;
-las verificaciones a realizar antes de comenzar el trabajo;
-la verificacin del correcto funcionamiento de los equipos y, cuando
corresponda, su calibracin y ajuste antes de cada uso;
-el mtodo de registro de las observaciones y de los resultados;
-las medidas de seguridad a observar.
*los criterios o requisitos para la aprobacin o el rechazo;
*los datos a ser registrados y el mtodo de anlisis y de presentacin;
*la incertidumbre o el procedimiento para estimar la incertidumbre.
17
5.4.5. Validacin de los mtodos

La validacin es la confirmacin, a travs del examen y el aporte de evidencias
objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso especfico
previsto.

El laboratorio debe validar los mtodos no normalizados, los mtodos que disea o
desarrolla, los mtodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, as
como las ampliaciones y modificaciones de los mtodos normalizados, para
confirmar que los mtodos son aptos para el fin previsto. La validacin debe ser
tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de
aplicacin o del campo de aplicacin dados.

El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para
la validacin y una declaracin sobre la aptitud del mtodo para el uso previsto. La
gama y la exactitud de los valores que se obtienen empleando mtodos validados
(por ejemplo, la incertidumbre de los resultados, el lmite de deteccin, la
selectividad del mtodo, la linealidad, el lmite de repetibilidad o de
reproducibilidad, la robustez ante influencias externas o la sensibilidad cruzada
frente a las interferencias provenientes de la matriz de la muestra o del objeto de
ensayo) tal como fueron fijadas para el uso previsto, deben responder a las
necesidades de los clientes.

18
Validacin de mtodos (cont)
NOTA 2: Es conveniente utilizar una o varias de las tcnicas siguientes para la determinacin del
desempeo de un mtodo:
*calibracin utilizando patrones de referencia o materiales de referencia;
*comparacin con resultados obtenidos con otros mtodos;
*comparaciones interlaboratorios;
*evaluacin sistemtica de los factores que influyen en el resultado;
*evaluacin de la incertidumbre de los resultados basada en el conocimiento cientfico de los
principios tericos del mtodo y en la experiencia prctica.
Estimacin de la incertidumbre de la medicin
Un laboratorio de calibracin, o un laboratorio de ensayo que realiza sus propias
calibraciones, debe tener y debe aplicar un procedimiento para estimar la
incertidumbre de la medicin para todas las calibraciones y todos los tipos de
calibraciones.

Los laboratorios de ensayo deben tener y deben aplicar procedimientos para estimar
la incertidumbre de la medicin. En algunos casos la naturaleza del mtodo de
ensayo puede excluir un clculo riguroso, metrolgicamente y estadsticamente
vlido, de la incertidumbre de medicin. En estos casos el laboratorio debe, por
lo menos, tratar de identificar todos los componentes de la incertidumbre y hacer
una estimacin razonable, y debe asegurarse de que la forma de informar el
resultado no d una impresin equivocada de la incertidumbre. Una estimacin
razonable se debe basar en un conocimiento del desempeo del mtodo y en el
alcance de la medicin y debe hacer uso, por ejemplo, de la experiencia
adquirida y de los datos de validacin anteriores.
19
VALIDACION: Verificaciones necesarias para asegurar las
caractersticas del desempeo y limitaciones de un mtodo y
demostrar que ste est cientficamente regido bajo las condiciones
para las cuales debe ser aplicado. Se comparan los parmetros del
desempeo del mtodo con los requerimientos necesarios de los
datos analticos.
TECNICA: Principio cientfico til para proveer informacin
sobre la composicin de una sustancia.
METODO: Adaptacin de una tcnica para mediciones de
parmetros analticos seleccionados.
PROCEDIMIENTO: Direcciones generales escritas necesarias
para utilizar un mtodo. Ejemplos: Mtodos estndares de aguas,
AOAC, EPA, etc
PROTOCOLO: Serie de direcciones definitivas que un laboratorio
debe seguir sin excepcin para utilizar un mtodo.
DEFINICIONES
20
CRITERIOS DEL DESEMPEO DE UN METODO
a) Primarios: precisin, exactitud, lmite de deteccin. b)
Secundarios: Linealidad, rango, lmite de cuantificacin,
selectividad, sensibilidad, robustez o fortaleza del mtodo.
Tipos de
validacin
Interna
Dentro del laboratorio. Se realiza
cuando se ha desarrollado nuevo
mtodo o cuando se adapta o se
modifica el mtodo
Externa
Entre laboratorios.
Comparacin con al menos
8 laboratorios
21
REGLAS FUNDAMENTALES PARA LA
VALIDACIN
1. Validar el mtodo completo. Desde la etapa
preparatorio hasta la medicin final.
2. Validar en un intervalo de concentraciones.
Precisin del mtodo depende de la concentracin
del analito en la solucin muestra.
3. Validar sobre una amplia gama de
matrices. Probar un mtodo dado en aguas,
suelos, alimentos, muestras biolgicas, etc.
22
Especificaciones
requeridas por el
cliente
Seleccin del
mtodo apropiado
Normalizado y
verificado?
Planificacin de
tareas
Experimentos de
validacin/
estimacin incert.
Evaluacin de
informacin disponible
sobre validacin del
mtodo
OK?
Evaluacin de los
resultados, segn
especificaciones
Realizar
ajustes
Documentar
mtodo y su
validacin
Utilice el mtodo
con confianza
Procedimiento
normalizado y
reporte validacin
FIN
INICIO
Flujo para la seleccin y validacin de un mtodo
23
Qu es un procedimiento normalizado?
Un procedimiento normalizado es el protocolo establecido por el laboratorio,
optimizado, validado, revisado, aprobado por la(s) persona(s) autorizada(s).
Tiene una identificacin nica. Deben especificarse los parmetros que
caracterizan el desempeo del mtodo a travs de la confirmacin o
verificacin (o validacin si el mtodo ha sido desarrollado en el laboratorio, si
es no normalizado o si el mtodo normalizado ha sido modificado) de que el
mtodo es apto para el ensayo requerido por el cliente.
El procedimiento normalizado debe ser implementado en el laboratorio por el
personal autorizado, competente, con el instrumental de medicin calibrado y
las condiciones ambientales ptimas.
Existe mucha confusin entre validar o no un mtodo normalizado. Se supone
que el mtodo normalizado ya est validado, especifica los parmetros que
caracterizan su desempeo. Si un mtodo normalizado va a ser aplicado por
primera vez en el laboratorio, previamente se deben realizar los procesos
correspondientes con el fin de verificar o confirmar que el mtodo cumple con
las especificaciones que caracterizan el desempeo del mtodo.
24
FLUJOGRAMA DE NORMALIZACION DE UN PROCEDIMIENTO
Definicin de
parmetros
analticos
Diseo
experimental
Optimizacin
Emprica?
Experiencias
iterativas
programas en
computadoras
Modelo
Evaluacin de
resultados
OK?
Planificacin de
validacin
Modelo de
calibracin, rango,
linealidad, LD, LC
Precisin y
exactitud
Estabilidad
del analito
Procesamiento
de resultados
Informe
validacin/ proc.
normalizado
Anlisis de rutina
DESARROLLO
DEL METODO
INICIO
VALIDACION DEL
METODO
SI
NO
SI
NO
Documentacin/
normalizacin
25

Recomendaciones (I)


Mtodo por prioridad:

1. Mtodos de prueba internos y modificados

2. Mtodos de prueba con alto potencial de riesgo

3. Mtodos de prueba o productos con alto nivel
de utilizacin

4. Validar primero los puntos crticos en los
procedimientos.

26
ACTIVIDADADES Ejecutor 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Diagnstico del laboratorio (recursos, disponibilidad) DT, A
Ensayo de pureza de reactivos y referencias A1
Verificacin de calibraciones A2
Repetibiliad en mediciones (tr, f) A2
Repetibilidad del mtodo (contenido de analito) A2
Linealidad y rango. Repetibilidad A2
Lmite de deteccin y cuantificacin A2
Exactitud del mtodo A2
Prueba de robustez A1,A2
Implementacin de anlisis de rutina A1,A2
Diseo del Control de Calidad DT
Ensayos interlaboratorios (proficiency) DT, A
Elaboracin de un protocolo DT, A
Elaboracin del informe de validacin DT, A
Supervisin de ejecucin de actividades DT, DG
PLANIFICACIN DE LA VALIDACION
27
Mtodo, equipo, sistema
Muestra
Resultado
Preparacin de la muestra
Sistema de anlisis
Equipo
incluye
hardware software
Mtodo analtico
Prueba del equipo
calificacin del equipo
Validacin del mtodo
Prueba de aptitud del sistema
sistema de calidad
Methodenvalidierung
Calibracin
Validacin del software
28
Calificacin del equipo (I)

1. Calificacin del diseo (C.D., D.Q.)

Define las especificaciones funcionales y operacio-
nales del instrumento, y detalla las condiciones y
decisiones en la seleccin y desempeo del
proveedor.
29
Calificacin del equipo (II)

2. Calificacin de la construccin (C.C., C.Q.)

Asegurar por parte del fabricante que el producto ha
sido diseado y fabricado segn un sistema de calidad
reconocido mundialmente, y que cumple con las
condiciones de conformidad y seguridad .
30
Calificacin del equipo (III)

2. Calificacin de instalacin (C.I., I.Q.)

Establece que el instrumento es recibido de acuerdo
a como se dise y especific, que est
adecuadamente instalado en el ambiente que se
seleccion, y que es apropiado para la operacin del
instrumento.

31
Calificacin del equipo (IV)

4. Calificacin de la aplicacin (C.A., A.Q.)

El proceso en donde se demuestra que un
instrumento funcionar de acuerdo a la
especificacin operacional en el ambiente
seleccionado.
32
Calificacin del equipo (V)

5. Calificacin del funcionamiento (C.F.,
P.Q.)

El proceso en donde se demuestra que un
instrumento funciona de acuerdo a la especificacin
adecuada para su uso rutinario.
33
Calificacin del equipo (VI)

6. Calificacin del mantenimiento (C.M.,
M.Q.)

El proceso de revisin peridica. Cualquier
reparacin, ajuste, y otro servicio debe ser
debidamente registrado en la documentacin
correspondiente.
34
PRECISION
35
MEDIDAS DE LA PRECISION
Definiciones
Repetibilidad. Precisin esperada bajo las mejores condiciones,
a intervalos cortos de tiempo (en un mismo da) en un mismo
laboratorio, efectuado por el operador designado con el mismo
instrumento
Precisin intermedia (ISO 1994). Grado de dispersin de
resultados obtenidos en diferentes tiempos (en diferentes das) de
un ensayo o anlisis, efectuado por el mismo operador y el mismo
instrumento .
Reproducibilidad. Precisin esperada para la medicin de un
analito en una muestra, efectuada en diferentes laboratorios, a
diferentes tiempos, por diferentes operadores y con diferentes
instrumentos.
36
Diseo de datos para la estimacin de la repetibilidad
y la precisin intermedia.
Rplicas Das
1 2 3 . j p
1
2
3
:
m

x
ij
Medias
S
2

S
2
1
S
2
2
S
2
3
. S
2
j
. S
2
p
1
x
2
x
3
x
j
x
p
x
37
INTERPRETACION DE RESULTADOS PRECISION
ANOVA
. . .
2 1
= = x x
. . .
2 1
x x =
Repetibilidad
RSD%
Precisin
Intermedia
Control C
x x
.
A
outlier
A
A
Estable 4 das
B
Revisin
Nuevos
estndar
Varianzas
iguales ?
SI
NO
A
B
38
n
i
Da 1 Da 2 Da 3 Da 4 Da 5
1 0.21229211 0.20324648 0.22491155 0.21193974 0.23549286
2 0.21670552 0.21666273 0.2326656 0.21695385 0.23973896
3 0.21738428 0.21805454 0.23300503 0.22906803 0.24091835
4 0.21862706 0.2187584 0.23362641 0.23468816 0.24958395
5 0.22273356 0.22081961 0.24119217 0.23664339 0.2510824
6 0.22632585 0.22269855 0.24609646 0.23757208 0.25457247
7 0.22985315 0.22704026 0.25630969 0.23759674 0.2731622
8 0.2298631 0.22774875 0.26257867 0.23936202 0.27506941
9 0.23824682 0.23257724 0.26496227 0.24667366 0.28589554
10 0.24002508 0.24206982 0.27525473 0.25173432 0.28632261
EVALUACION DE LA PRECISIN EN LA DETERMINACIN DE
ARSENICO EN AGUAS SUBTERRNEAS POR AA DE LLAMA
Absorbancias medidas durante 5 das de una muestra de
agua conteniendo 24 ppm de arsnico total.
39
A) Test de Bartlett
Parmetro a calcular
(

|
.
|

\
|
=

= =
2
1
2
1
1
i
k
i
i
k
i
i
LnS LnS
C
M v v
v
i
: grados de libertad de cada serie de resultados
S
2
i
: es la desviacin estndar de cada serie
S
2
varianza agrupada, est dado por la siguiente expresin:
S
S
i i
i
2
2
=

v
v
Criterio: si M<_
2
0.95

las varianzas son homogneas

( ) 1 3
1 1
1

|
|
.
|

\
|

|
|
.
|

\
|
+ =

k
C
i i
v v
Grados de libertad es k-1. Donde k es el nmero de columnas
Ensayo de repetilibad: Test de Bartlett
40
B) Test de Hartley
Esta prueba estadstica, slo es aplicable para series con grados de libertad
iguales: v
1
=v
2
=.....=v
n
.
Se divide la varianzas mxima (S
max
2
) entre la mnima (S
max
2
), se compara
con el valor de las tablas de Hartley y si el valor del cociente calculado (r
c
)
es mayor que el valor de las tablas (r
0.95
), se dice que las varianzas no son
homogneas (no hay homocedasticidad).
2
min
2
max
S
S
r
C
=
Si rc>r
0.95
, las varianzas son heterogneas (hay
heterocedasticidad)
APLICACIN NUMRICA
Para problema anterior, son las varianzas homogneas?
41
2 3 4 5 6
2 39.0 87.5 142 202 266
3 15.4 27.8 39.2 50.7 62.0
4 9.6 15.5 20.6 25.2 29.5
5 7.15 10.8 13.7 16.3 18.7
6 5.82 8.34 10.4 12.1 13.7
7 4.99 6.94 8.44 9.7 10.8
8 4.43 6.00 7.18 8.12 9.03
9 4.03 5.34 6.31 7.11 7.80
10 3.72 4.85 5.67 6.34 6.92
k
v
Test de Hartley. Comparacin de Varianzas
Tabla de valores de r al 95 % de nivel de confianza. k es el nmero
de varianzas y v son los grados de libertad para cualquier serie.
42
Resultados del Test de Bartlett:
M = 6.44
Es menor que la _
2
0.95
=9.49
Las varianzas son homogneas hay repetibilidad.
Evaluacin de la repetibilidad y la precisin intermedia se realiza a travs
del ANOVA 1F.
Resultados del Test de Hartley:
rc= 4.27
r
0.95
= 7.11
Se verifica que las varianzas son homogneas
43
Fuente de variacion S.C. G.L. C.M. Fc
F
1-o/2

o=0.05
Entre das 0.00948497 4 0.002371 11.8955 3.01
residual (intra-das) 0.00897027 45 0.000199
total 0.01845524 49
TABLA ANOVA 1F
0.2
0.22
0.24
0.26
0.28
0.3
0 2 4 6 8 10
Existen diferencias entre los das. Se observa que las medias
varan mucho en los ltimos 3 das.
Graficando los intervalos
de confianza por da se
pueden ver dnde estn
las diferencias.
A
Das
44
Repetibilidad: expresada como RSD% a partir de la raz de C.M. residual
y la media global de las absorbancias.
RSDr%= 5.94
Precisin intermedia como varianza:
Existen diferencias significativas entre las medias. Puede existir un error
sistemtico al pasar de un da a otro. El suministro de energa fallaba
frecuentemente durante el desarrollo de los experimentos. Cada serie de
experimentos se realiz sin ninguna interrupcin de la energa. Esto
confirma que para la repetibilidad o varianza intra-das la precisin de la
medicin fue la misma. No as en las medias por da.
Componente de la varianza entre das
s
D
2
=0.00022; p es el nmero de das; N
es el nmero total de mediciones. = 10
|
|
|
|
|
.
|

\
|

= =
1
/ ) (
2 ^
~
1 1
2
2
p
N n N
Sr
n
CM CM
s
i j
ij
r D
D
2 2 2
) ( r D T I
s s s + =
RSD
I
%=8.3 Poca precisin intermedia :
45
CONTROL DE CALIDAD DE LA REPETIBILIDAD Y LAS MEDIAS POR DA
S LC =
S B LI
S B LS
3
4
=
=
Lmite central:
Lmites superior e
inferior:
Lmites de
promedios
LC+A
3
Sprom 0.25106632 0.25106632 0.25106632 0.25106632 0.25106632
LC-A
3
Sprom 0.22438993 0.22438993 0.22438993 0.22438993 0.22438993
Lmites de
Desv. Estd.
B3* Sprom 0.0234099 0.0234099 0.0234099 0.0234099 0.0234099
B4* Sprom 0.00381091 0.00381091 0.00381091 0.00381091 0.00381091
Para Sr Para medias
X LC
~
=
S A LC LI
S A LC LS
3
3
=
+ =
Media global
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
1 2 3 4 5 6
Dia
S
0.2
0.21
0.22
0.23
0.24
0.25
0.26
0.27
1 2 3 4 5 6
Dia
R
i

p
r
o
o
m
e
d
i
o
Repetibilidad
Medias
46
0.975
1.032
1.099
1.182
1.287
1.427
1.628
1.954
2.659
A
3

10
9
8
7
6
5
4
3
2
n
1.716 0.284
1.761 0.239
1.815 0.185
1.882 0.118
1.970 0.030
2.089 0
2.266 0
2.568 0
3.267 0
B
4
B
3

Factores utilizados en las cartas de control para
la repetibilidad y las medias
47
APLICACION NUMERICA
Se quiere hacer un estudio de la precisin del mtodo
voltameperomtrico en la determinacin de plomo en sangre.
Para ello se prepar una muestra y se analiz durante 4 das
consecutivos. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.
Rplicas Das
1 2 3 4
1
2
3
10.5

10.5 10.6 10.6
10.4

10.8 10.8 10.5
10.3 10.6 10.5 10.3
Media
S

Evale la precisin de los resultados. Exprese la repetibilidad
como desviacin estndar relativa %.Grafique los intervalos
de confianza y elabore una carta de control. Interprete los
resultados.
48
LINEALIDAD Y RANGO
49
Definiciones
Linealidad: funcin de calibracin de un
mtodo que responde a una lnea recta.
Rango: intervalo de concentraciones donde
la funcin de calibracin es lineal. Es el
intervalo de concentracin analtico para la
determinacin del analito en la muestra.
50
Valores caractersticos de dispersin de la curva de
calibracin
Desviacin estndar. residual (Dispersin de los valores de medicin en relacin de la
recta de regresin):
( )
2 n
y

y
s
n
1 i
i
yx

=

= 2 n
y x b y a y
s
i i i
2
i
yx

=

Precisin del modelo de calibracin o del mtodo para regresin lineal simple:
100 %
/
y
s
RSD
y x
=
mediciones
calculados valores y
=
=
i
y

Coeficiente de variacin del mtodo relacionado

al centro del intervalo de trabajo
51
Intervalo de confianza de un valor de
y calculado Y
k

( )
( )

+ = A
n
i
i
k
y x f k
x x
x x
n
s t Y
1
2
2
/ ; 975 . 0
1
52
Intervalo de confianza de la curva de regresin y valores
outliers.
Extrapolacin con menos precisin.
-2
0
2
4
6
8
10
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
X
Y
I.C. en ( ) es lo ms estrecho.
En este punto, la prediccin es la ms
precisa


y ; x
Grfica con Y
k
Ay
k

Y
k
: Punto definido en la recta de regresin

53
Funcin de analisis

Calibracin:
Se determina el valor desconocido de
medicin a travs del valor de
concentracin
Anlisis:
Se determina la concentracin
desconocida a travs del valor de
medicin conocido.
La funcin de anlisis es la inversa de la funcin de
calibracin.
x b a y + =
b
a y
x

=
0
2
4
6
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Conc.
V
a
l
o
r

d
e

m
e
d
i
c
i

n

54
ANOVA EN REGRESIN LINEAL
Suma de cuadrados,
fuente de variacin
Frmulas Grados de
libertad
SS
T
, Total

y
i
2
n
SS
M
, Media n 1
SS
corr
, M corregida n-1
SS
model
, Modelo p-1
SS
Rs
, Residual n-p
SS
LOF
, Falta de ajuste f-p
SS
pe
, Err. Exp. puro n-f
2
y
( )
2

y y
i
( )
2

y y
i
( )
2

i i
y y
( )
2

i i
y y
( )
2

i i
y y
n: nmero de lecturas en y; p: nmero de coeficientes de
regresin; f: niveles de concentracin
55
Diseo experimental ANOVA en ARL
SS
T
SS
M
SS
corr
SS
model
SS
R
SS
LOF
SS
pe
n
n-1
1
p-1
n-p
f-p
n-f
56
Identificacin de variables
x b b y
1 0
+ =
i
y
y
y
x
i
y

y
i
57
Ejemplo
Los datos para una curva de calibracin en
la determinacin voltamperomtrica de
hierro son los siguientes:
X /ppm: 0, 1, 2, 2
Y/A: 0.3, 2.2, 3, 4

58
X mg/L y
p
1 y
p
2 y
p
3 y
p
4 y promedio S
yi

10 0.19388876 0.1890612 0.20588693 0.18959406 0.19460774 0.00782385
20 0.36863977 0.38604139 0.38141392 0.37574982 0.37796122 0.00750533
30 0.5795914 0.5747622 0.57715417 0.57339968 0.57622686 0.00272753
40 0.77628559 0.76612878 0.7788453 0.78624765 0.77687683 0.0083178
50 1.00489382 0.95297796 0.98341219 0.98627299 0.98188924 0.02149891
60 1.16992833 1.16453739 1.17757745 1.17528497 1.17183203 0.00582433
Estudio del Modelo Lineal de calibracin en la determinacin de
un pesticida por GC-FID en aguas contaminadas, utilizando
tetracosano (30ppm) como estndar interno.
Razn de reas de pico, rplicas, promedio y desviacin estndar para diferentes
concentraciones de estndar de pesticida.
Test de homogeneidad de varianzas:
Bartley: M= 11.07 y _
2
=11.09
Hartley: rc= 62.12 y r
0.95
= 62.00
Varianzas son heterogneas ?.
Aplicamos la regresin ponderada
59
Pendiente (b
1
) 0.01957821
Intercepto (b
0
) -9.74E-03
Coeficiente r
2
0.99957032
Varianza Residual (S
2
x/y
) 1.9616E-05
S(b
0
) 0.00618558
S(b
1
) 0.00020296
Resultados de la regresin ponderada
Buena linealidad: 99.96%
Test de significancia del intercepto:
La hiptesis nula es H0: b0=0 y el valor calculado de t es tc = 1.58. Al
comparar con el valor 2.776 correspondiente a t
0.975
y 4 grados de
libertad, se observa que es menor, lo que significa que la hiptesis nula
es aceptada y se puede afirmar que la lnea pasa por el origen. En estas
condiciones el modelo de la curva de calibracin es:

p= 0.019578 X
0
0
b
c
S
b
t =
60
VERIFICACION DEL AJUSTE LINEAL
Para verificar la validez del modelo lineal, se aplica el ANOVA
SSREG y y
ij ij
=

( )
2
SSR y y
ij ij
=

( )
2
MS
SSREG
p
=
1
S
SSR
n p
2
=

Variacin Suma de cuadrados GL Cuadrtica media

Modelo
Regresin



P-1
n-p
total
c
MS
MS
F =
Clculo de Fc
Si Fc > F
(p-1,n-p)
el modelo se ajusta a una lnea recta
61
Fuente
Variacin gl SC varianzas Fc F0.95
Regresin 1 0.7593 0.7593 18425 10.01
Residual 4 0.0002 4E-05
Total 5 0.765
RESULTADOS DE ANOVA PARA LA REGRESIN
El modelo es lineal.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 20 40 60 80
mg/L estandar Cocana
R
a
z

r
e
a
s

d
e

p
i
c
o
62

=
i
i i
s
s
v
v
2
2
100 %
2 2
/

+
=
i i
y x
global
y w
s S n
RSD
0.000142
2.3 %
La precisin del modelo se mide por la desviacin estndar global (incluye la
varianza residual S
2
x/y
y la varianza agrupada s
2
asociada a las reas de
pico) relativa al promedio ponderado de la razn de las reas de los picos de
los estndares.
Precisin del modelo lineal
BUENA PRECISION RSD%< 5 %
63
-0.008
-0.006
-0.004
-0.002
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0 20 40 60 80
Verificacin de linealidad por grfica de residuales
e res
SE OBSERVA LA TENDENCIA A LA PERIDIOCIDAD,
INDICANDO LA LINEALIDAD.
64
Control de Calidad de la Curva de Calibracin
La repetibilidad de la curva de calibracin se realiza a travs de la
carta de control representada por el intercepto y la pendiente con sus
intervalos de confianza, a como se muestra en la figura siguiente:
Elipse correlaciona b
0
y b
1
Ab
0
= (F
0.975; 1,n-2
S
2
b0
)
Ab
1
= (F
0.975; 1,n-2
S
2
b1
)
b
0
b
1
b
0
-Ab
0
b
0
+Ab
0
b
1
-Ab
1
b
1
+Ab
1
Se elabora la curva de calibracin con 10 puntos. Con los coeficientes del
modelo y sus intervalos de confianza se elabora la carta de control. Luego se
repite la curva de calibracin durante un perodo de 5 das, y los valores de b
0

y b
1
se ubican en la carta de control. Los puntos deben quedar dentro de la
elipse.
65
Descripcin del modelo de control de calidad
Intervalo de confianza simultneo de b
0
y b
1
est dado por Mendel y
Linnig (Anal. Chem. 29 (1957) 743):

+ 0
2 , 2
2
2
2
)
1 1
(
2
)
1 1
)(
0 0
( 2
2
)
0 0
(
n
F s a
i
x a a
i
x a n o o o o

= + +

0 2 2
2 , 2
2 2 2
1 1 0
2
0 n i i
F s x A x A A nA
A
0
= a
0
- o
0
A
1
= a
1
o
1
A
0
A
1
Los puntos (A
0
,A
1
)
deben caer dentro
66
0
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
0.0105
0.034
0.0615
0.086
0.1158
0.1377
0.1549
0.1897
0.2105
0.2383
0.2661
C A
Grfico de control b1, b0
0.00125
0.00625
0.01125
0.01625
0.003 0.0031 0.0032 0.0033
pendiente (b1)
i
n
t
e
r
c
e
p
t
o

(
b
0
)
b1
0.00316898

0.0032
b0
0.01005909

0.0104
CC para linealidad de hierro en aguas
67
LIMITE DE DETECCION Y DE
CUANTIFICACION
68
Estimacin de LD Y LC a partir de la repetibilidad de la seal del blanco (o
matriz de la muestra) comparado con una seal producida por un estndar
de concentracin muy diluida, donde seal sea ms de 3 veces la del ruido.
A partir de lecturas de blanco y un estndar diluido
Estd
Estd
Yblanco blanco
C
Y
S Y
LD
29 . 3 +
=


Estd
Estd
Yblanco blanco
C
Y
S Y
LC
10 +
=
N Y
Estd
Y
blanco

1 191.44 5.218
2 207.77 9.228
3 207.08 5.07
4 175.5 4.222
5 187.82 6.044
6 187.89 7.229
7 179.42 5.744
8 179.06 5.355
9 200 7.099
10 208.13 5.972
Y promedio 192.411 6.1181
S
Y
12.6104678 1.41894871
Datos en V
obtenidos
CG-FID para
un pesticida
en un
efluente de
aguas
residuales.
Cstd= 4 ppm.
LD= 0.22
LC= 0.42
69
Proceso de evaluacin del LD y de LC usando las
tcnicas GC y HPLC
Estndar
y
std
> 3 R
de C
std
Seal de Ruido (R)
YR
3 >
R
std
Y
Y
y
std
Medido de pico a pico
70
LIMITE DE DETECCION A PARTIR DE LA CURVA DE
CALIBRACIN POR ADICIN DE ESTNDAR
1
0
29 . 3
b
S Y
LD
b blanco
+
=
1
0
10
b
S Y
LC
b blanco
+
=
56.76
380
0.9999
10.119
1.46
0.25
Parmetro
Pendiente b
1

Intercepto b
0

Coeficiente r
2

Var. Residual S
2
x/y

S
b0

S
b1

0
10
20
30
40
379.7
934.9
1520.2
2057.4
2655.1
Cstd/ppm
28.1
252.4
157.6
385.4
267.9
Y/V SY
0.1 mL de muestra de agua contaminada.
Estndar de pesticida de 1000 ppm
LD= 0.19
LC= 0.37
71
Agua
destilada
TIEMPO
R
y
std
LD Caso de absorcin atmica, espectrofotometra
UV/V.
72
R
C
( )
2

2
/

=

n
y y
S
i
y x
Clculo de LD a travs de la varianza residual de
la curva de calibracin por adicin patrn.
x b b y
1 0
+ =
1
/
29 . 3
b
S Y
LD
y x Std
+
=
En un dominio de concentraciones de la linealidad. Se dice que la varianza
residual es debida a efectos de la matriz y el ruido instrumental.
73
APLICACION NUMERICA
En la determinacin voltamperomtrica de hipoclorito en aguas, se realiza una
curva de calibracin de soluciones estndares puros, Los resultados para la
preparacin de la curva son los siguientes datos:
ppm 0.5 1.0 3.0 6.0
A 0.18 0.41 0.71 0.91
Encuentre el modelo de calibracin. Calcule la desviacin estndar del intercepto.
Evale los valores de LD y LC. Comente los resultados.
74
EXACTITUD DEL METODO
75
EXACTITUD DE UN METODO
Para evaluar la exactitud de un mtodo se utilizan muestras de
referencia certificadas (trazables con patrones internacionales). El
bias o sesgo es una medida del error sistemtico y se calcula como
la desviacin (c) de un resultado o promedio de resultados (x) con
respecto al valor de referencia expresado como porcentaje.
c= (x-)100/
Se hace una comparacin entre los resultados obtenidos por el
mtodo y el valor de referencia (utilizando la prueba de hiptesis)
y si hay diferencias significativas se evala el error sistemtico.
APLICACION NUMERICA
Se quiere evaluar la exactitud del mtodo de Kjeldhal para la
determinacin del porcentaje de nitrgeno en una muestra vegetal
certificada que declara 21.81% de nitrgeno. Los resultados obtenidos
son los siguientes: 20.89, 21.00, 21.1, 20.89, 21.00. Existen errores
sistemticos? En caso afirmativo, cul es el bias? Corregir resultado.
76
DETECCION DE ERRORES SISTEMATICOS
POR REGRESION LINEAL
Si se correlacionan los valores de referencia de muestras
certificadas a diferentes niveles de contenido del analito
con los resultados del mtodo a ensayar, es posible detectar
errores constantes y proporcionales.
Los criterios son los siguientes:
b
0
= 0 b
1
= 1 Ninguno
0
0
= b
1
1
= b
0
0
= b
1
1
= b
0
0
= b 1
1
= b
Errores
Proporcionales
Constantes
Los dos tipos
77
APLICACION NUMERICA
Se quiere evaluar la exactitud de la determinacin de nitrgeno
por el mtodo de Kjeldahl. Se utilizan 4 muestras vegetales de
referencia con diferentes niveles de contenido de nitrgeno. Los
resultados se presentan en la siguiente tabla:
Resultados 8.12 5.37 3.45 7.21
Referencia 8.20 5.10 3.10 6.85
Existen errores sistemticos? De Qu tipo?
Indicaciones para la solucin: calcular los parmetros de
regresin b
0
y b
1
. Plantear las hiptesis b
0
=0 y b
1
=1. Calcular el
parmetro t
c
y compararlo con el valor t
0.975
. El parmetro t
c
se
calcula por las siguientes ecuaciones:
0
0
0
b
c
S
b
t

=
1
1
1
b
c
S
b
t

=
( )

=
2
2
/ 2
1
x x
S
S
i
y x
b
78
RECOBRADO Y EVALUACION DE
INTERFERENCIAS (EFECTO DE MATRIZ)
Los componentes de la matriz pueden provocar un efecto
depresor o intensificador de la seal analtica o efecto de
matriz. Para minimizar este efecto se utiliza el mtodo de
adicin patrn en la curva de calibracin.
Cx=|b
0
/b
1
|
=b0+b1C
79
Deteccin del efecto de matriz y porcentaje de recobrado
AP
CCN
Concentraciones
s
e

a
l
AP
CCN
s
e

a
l
Concentraciones
ap=b
0
+b
1
C
ccn=b
0
+b1C
Efecto depresor
Efecto intensificador
Rc>100
Rc<100
Rc=100
No hay efecto
Porcentaje de Recobro:
Rc=(b1/b1)100
80
Estd. aadido
en ppm
Razn de reas R
A

RiA S
RiA

0 0.1676 0.0100
10 0.3459 0.0103
20 0.5707 0.0124
30 0.7442 0.0206
40 0.9429 0.0456
CURVA DE CALIBRACIN POR ADICION PATRN
Razn de reas y desviacin estndar para diferentes adiciones
de estndar de pesticida a 0.1 mL de muestra de aguas.
81
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 10 20 30 40 50 60 70
ppm
Y
Curvas de calibracin por adicin patrn y calibracin normal

RA
= 0.163+0.0197 X

p
= 0.019578 X
Test de significancia de la pendiente:
82
Parmetro Adicin patrn
(CAP)
Calibracin normal
(CCN)
Pendiente (b
1
) 0.0197 0.01958
Desv. Est. (S
b1
) 0.00063 0.00020
Var. Residual
S
2
x/y

0.00020547 0.00001965
TEST DE COMPARACIN DE LAS PENDIENTES
2
/
2
/
y x
CCN
y x
AP
S
S
Fc =
10.8 F
0.975
=9.8. Varianzas heterogneas
0.28 t
0.975
=2.776. Pendientes iguales
4 Grados de libertad. Aproximacin
de Welch
2
1
2
1
1 1
b
CCN
b
AP
CCN AP
c
S S
b b
t
+

=
( )
2 2
2
1
2
1
2
2
1
2
1

+
=
CCN
b
CCN
AP
b
AP
b
CCN
b
AP
n
S
n
S
S S
v
NO HAY EFECTO DE MATRIZ
83
ESTIMACIN DEL RECOBRADO
100
1
1
CCN
CPA
b
b
Rc =
|
|
.
|

\
|
+
|
|
.
|

\
|
=
CCN
CCN
CCN b
CAP
CAP
CAP b
b n
S
b n
S
Rc Rc u
1
2
1
2
1
2
2
1
) (
La incertidumbre asociada es:
El intervalo de confianza es:
Rc +/- 2 u(Rc)
100.6 2.8
84
SENSIBILIDAD
La sensibilidad de un mtodo est dada por la relacin entre la
fluctuacin de la variable concentracin y la pendiente de un
curva de calibracin.
2
1
2
2
b
S
S
R
C
=
Entre mayor es la pendiente menor es el error aleatorio y
la sensibilidad del mtodo es mayor
C
R
Mayor sensibilidad
Menor sensibilidad
R1
R2
C1
85
ROBUSTEZ DEL METODO
86
ROBUSTEZ DEL METODO
Robustez de un procedimiento analtico: capacidad de reproducir
resultados exactos en presencia de pequeos cambios (o factores) de las
condiciones experimentales factibles de producirse durante la
realizacin del procedimiento.
Puesta en prctica a tres niveles
Nivel I: verificar robustez frente a cambios menores en las condiciones
operacionales del medioambiente (temperatura, pH, reeactivos
diferentes, tiempo de reaccin, etc), incluyendo la reproducibilidad de
otro analista.
Nivel II: verificacin frente a cambios en condiciones ms severas, uso
de columnas cromatogrficas de diferentes proveedores, sustitucin de
diferentes equipos, efectuar la experimentacin en otro laboratorio.
Nivel III: verificar la robustez en un estudio colaborativo en al
menos 8 laboratorios diferentes
87
Diseo experimental factorial 2
n
para la prueba de robustez
Experimento
No.
Factor (f)
A B
Interacciones de f
AXB
Resp.
y
i
1
2
3
4
-
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
y
1
y
2
y
3
y
4
Diseo para dos factores A y B (n=2), 2
2
= 4 experimentos
De los resultados y
i
se pueden calcular los efectos de los factores y su
interaccin sobre la respuesta tomada como referencia.
Clculo de los Efectos de f y sus interacciones
) (
) (
) (
) (

+
+
=
n
y
n
y
E
f
Si E
f
>2S
y
las interacciones son significativas

88
N
0
ExperimentosO FM OxFM 'Y
-
PPB B1
1 2 3 PROM Y S
1 -1 -1 1 4.76828 4.9696 5.59679 5.11155 0.4321
2 1 -1 -1 5.73631 5.4375 5.20886 5.460877 0.2645
3 -1 1 -1 5.78117 5.3524 5.45704 5.530203 0.2236
4 1 1 1 5.65369 5.7652 5.58096 5.6666 0.0928
EFECTOS
EF
O
0.24286167
EF
FM
0.31218833
EF
OxFM
-0.106465
0.50647122 2 S=
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
EFO EFFM EFOxFM
EFECTO DE 2 FACTORES (ANALISTA, COLUMNA DE CADMIO) EN
LA DETERMINACIN DE NITRATOS EN AGUAS